實(shí)驗(yàn)教學(xué)中苯酚硫酸法檢測(cè)靈芝多糖的探索*

郜玉欣，孫立權(quán)，田 虹

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是本科生教學(xué)大綱的重要組成部分。開(kāi)展實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的就是要培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、運(yùn)用書(shū)本理論的能力、分析解決問(wèn)題的能力，養(yǎng)成學(xué)生的實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度和認(rèn)真細(xì)致的工作作風(fēng)和良好的科學(xué)素養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)技能也是為學(xué)習(xí)后續(xù)課程和獨(dú)立開(kāi)展科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，有助于對(duì)學(xué)生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新理念的形成[1-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和儀器價(jià)格等降低，原來(lái)主要用于前沿科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的大量先進(jìn)儀器設(shè)備也越來(lái)越多地用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。因此，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中，要結(jié)合理論教學(xué)積極引入科研中的先進(jìn)方法和設(shè)備，讓實(shí)驗(yàn)教學(xué)與理論知識(shí)傳授、能力培養(yǎng)和素質(zhì)提高協(xié)調(diào)發(fā)展。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，要本著“將經(jīng)典實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行升級(jí)改造，引入現(xiàn)代分析技術(shù)，加強(qiáng)綜合性和研究性訓(xùn)練、促進(jìn)教與學(xué)”的教改思路，來(lái)助力“新工科”建設(shè)[5-6]。

圖1 苯酚-硫酸法反應(yīng)方程式

多糖提取純化是生物分離工程教學(xué)實(shí)驗(yàn)中一個(gè)經(jīng)典內(nèi)容。植物總多糖的檢測(cè)可以選擇比色法、色譜法[7]和色質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8]。利用苯酚與被酸水解的單糖顯色反應(yīng)就是比色法檢測(cè)多糖的原理，反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1。分光光度計(jì)作為比色法使用的儀器，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，是利用光吸收定律的基本分析儀器。其中樣品池的容量通常為4 mL，每個(gè)樣品的檢測(cè)都需要 5～10 mL的濃酸(濃度大于70%硫酸)[9]，因此，每次實(shí)驗(yàn)中使用濃硫酸的總量很大。而作為高腐蝕性危化品的濃硫酸在使用過(guò)程中具有較高的風(fēng)險(xiǎn)，我們希望在實(shí)驗(yàn)中盡量減少濃硫酸使用量，就不會(huì)產(chǎn)生大量酸性廢液，減小廢棄物處理的壓力。

酶標(biāo)儀作為生物類(lèi)實(shí)驗(yàn)中基本分析儀器，雖然在光路方向與分光光度計(jì)有些不同，但是其工作原理也是遵循光吸收基本定律——朗伯-比爾定律[10]，目前基本型號(hào)儀器價(jià)格也不高，是在生物實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的儀器。與普通分光光度計(jì)相比，酶標(biāo)儀使用多孔板作為盛放樣品的部件，比普通比色皿需要的樣品少，并且可以多個(gè)樣品(96孔板同時(shí)測(cè)96個(gè)樣品)同時(shí)檢測(cè)，增加了檢測(cè)通量，提高了檢測(cè)速度。酶標(biāo)儀具有溫度調(diào)節(jié)的功能，能夠?qū)悠愤M(jìn)行恒溫加熱[11]。因此，我們以靈芝多糖為檢測(cè)對(duì)象設(shè)計(jì)了使用酶標(biāo)儀檢測(cè)提取實(shí)驗(yàn)中多糖的新實(shí)驗(yàn)方案。在方案中可以實(shí)現(xiàn)一次測(cè)量多個(gè)樣品(由孔板上孔數(shù)量決定)，同時(shí)對(duì)樣品加熱，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，進(jìn)而節(jié)約苯酚和濃硫酸等試劑，減少酸性廢液產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容也有助于學(xué)生熟練使用移液槍和96孔板等生物實(shí)驗(yàn)中基本器材，拓展了酶標(biāo)儀等基本儀器的應(yīng)用范圍，提升了學(xué)生獨(dú)立操作的實(shí)驗(yàn)水平，鍛煉了綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和解決問(wèn)題的能力[12]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

靈芝多糖(本實(shí)驗(yàn)室純化樣品)；無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸，均為分析純?cè)噭?，?gòu)自伊諾凱科技有限公司。

(ELx808)酶標(biāo)儀，Bio-rad；(FA2204C)電子天平，上海越平；超聲清洗儀，昆山超聲；(DHG-9030A)鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣；真空干燥箱，上海一恒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)溶液配制

(1)靈芝多糖溶液的配制

精密稱(chēng)定靈芝多糖樣品5.0 mg，置于50ml的容量瓶中，再加蒸餾水定容，配成0.1mg/ml靈芝多糖樣品溶液。

(2)苯酚溶液的配制

精密稱(chēng)定重蒸[13]苯酚5.0 g，溶解后倒入100 mL棕色的容量瓶中，再加蒸餾水定容，混勻即得。

(3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)定無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，再加蒸餾水定容，配成0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再分別移取該葡萄糖溶液，配成20、40、60、80和100 μg/mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 方法精密度

(1)苯酚-硫酸法線性范圍

分別移取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(20、40、60、80、100 μg/mL)與5%苯酚溶液以及濃硫酸在96孔板中混合，體積比為1:1:5, 總體積為180 μL，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行震蕩，反應(yīng)溫度為25 ℃，顯色時(shí)間30 min，測(cè)定吸光度，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置在490 nm，并使用蒸餾水作為試劑空白。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用直線回歸方程擬合。

(3)方法穩(wěn)定性考察

分別移取靈芝多糖溶液于96孔板中，按苯酚-硫酸法顯色條件顯色，并在酶標(biāo)儀對(duì)其進(jìn)行時(shí)間-吸光度曲線的掃描，考察其穩(wěn)定性。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

采用苯酚-硫酸法，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)象，分別考察以下因素：苯酚用量：標(biāo)準(zhǔn)溶液/苯酚溶液(V/V)(1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2)；濃硫酸用量：標(biāo)準(zhǔn)溶液/濃硫酸溶液(V/V)(1:4、1:4.25、1:4.5、1:4.75、1:5)；反應(yīng)時(shí)間(20、25、30、35、40 min)；加熱溫度(60、70、80、90、100 ℃)對(duì)吸光度值的影響。

1.2.4 實(shí)際多糖含量的測(cè)定

取多糖溶液按照單因素確定的最佳條件進(jìn)行顯色反應(yīng)，在最佳吸收波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算靈芝多糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法線性范圍考察

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，苯酚-硫酸法得出線性回歸方程為 y=0.0037x+0.2433 (R2=0.9993)，表明本方法擬合曲線在 0～100 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖2 苯酚-硫酸法的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖2可知，苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2為0.9993，表明苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合度高、準(zhǔn)確。

2.2 方法穩(wěn)定性考察

采用苯酚硫酸法檢測(cè)靈芝多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酶標(biāo)儀進(jìn)行動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，30min內(nèi)每間隔2 min進(jìn)行一次檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可看出苯酚-硫酸法測(cè)得的吸光度穩(wěn)定。

圖3 苯酚-硫酸法的穩(wěn)定性

2.3 苯酚-硫酸法中單因素試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化

2.3.1 苯酚溶液用量的影響

由圖4可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/苯酚溶液(V/V) 為1:1.5時(shí)吸光度值最大，而其他苯酚用量的吸光度均比葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/苯酚溶液(V/V) 為1:1.5時(shí)的吸光度小，故合適的待測(cè)溶液/苯酚溶液(V/V) 為1:1.5。

圖4 苯酚-硫酸法中不同苯酚溶液量對(duì)吸光度的影響

2.3.2 濃硫酸用量的影響

由圖5可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/濃硫酸(V/V) 為1:4.5時(shí)吸光度值最大，而其他濃硫酸用量的吸光度均比葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/濃硫酸(V/V) 為1:4.5時(shí)的吸光度小，故合適的待測(cè)溶液/濃硫酸(V/V)為1:4.5。

圖5 苯酚-硫酸法中不同濃硫酸量對(duì)吸光度的影響

2.3.3 顯色反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖6可知，在加熱時(shí)間低于30 min時(shí)，吸光度略低，可能是顯色反應(yīng)不夠完全；達(dá)到30 min時(shí)，吸光度最大，而超過(guò)30 min時(shí)，隨著時(shí)間的增加，吸光度逐漸降低，因此顯色反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇30 min左右，故合適的苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖6 苯酚-硫酸法中不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.4 方法的可行性

上述單因素實(shí)驗(yàn)給出了苯酚-硫酸法能較好地應(yīng)用于酶標(biāo)儀檢測(cè)多糖。雖然苯酚-硫酸法由于需要配制苯酚溶液和濃硫酸，并需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間，比報(bào)道的蒽酮-硫酸法[14]所需要的時(shí)間稍長(zhǎng)，但是苯酚-硫酸法顯色所需要的溫度遠(yuǎn)低于蒽酮-硫酸法，因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，指導(dǎo)教師選擇苯酚-硫酸法方法用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

3 新方法的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用

在《生物分離工程實(shí)驗(yàn)》課程中，我們應(yīng)用了新的苯酚-硫酸法檢測(cè)靈芝多糖含量，通過(guò)與分光光度法對(duì)比(對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表1)，得出了用酶標(biāo)儀檢測(cè)多糖的優(yōu)點(diǎn)：

表1 不同儀器苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖比較

(1)采用酶標(biāo)儀檢測(cè)多糖，在一個(gè)教學(xué)班次(分組10組)中所用濃硫酸的量由900 mL減少到50 mL，所用靈芝多糖樣品、葡萄糖、苯酚的試劑量也減少了近90%；

(2)檢測(cè)時(shí)間由每組需要近一個(gè)小時(shí)，縮短到每個(gè)實(shí)驗(yàn)班次35分鐘，減少了近三分之二的實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)間，給其他實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(比如實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析)提供了較充裕的教學(xué)時(shí)間；

(3)減少了酸性實(shí)驗(yàn)廢液，使用酶標(biāo)儀時(shí)只產(chǎn)生使用分光光度計(jì)時(shí)的廢液的5%。

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中發(fā)現(xiàn)新檢測(cè)方法會(huì)提高學(xué)生移液槍和多孔板的使用熟練程度，深入了解酶標(biāo)儀的原理和結(jié)構(gòu)，降低了使用濃硫酸的安全風(fēng)險(xiǎn)。本次教學(xué)改革內(nèi)容是一個(gè)將儀器設(shè)備由科研使用轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用的有力示范，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新意識(shí)，強(qiáng)化學(xué)生多渠道解決實(shí)際問(wèn)題的能力將發(fā)揮重要作用，有助于實(shí)現(xiàn)“新工科”人才的培養(yǎng)目標(biāo)[15]。