豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白桿狀病毒載體表達及免疫保護性分析

張國軍，任洪林，楊延梅，暢麗芳，吳 金，王殿永，高玉龍，柳增善*，張媛媛*

(1.吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春 130062；2.吉林大學(xué)致遠有限公司，吉林長春 130000；3.河北省昌黎縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北昌黎 066600；4.吉林和元生物工程有限公司，吉林松原 138000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)可引起仔豬斷乳后多系統(tǒng)衰竭綜合征，為目前困擾全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，為國內(nèi)廣泛流行的優(yōu)勢血清型。臨床上病豬表現(xiàn)為發(fā)熱、漸進性消瘦、皮膚蒼白、黃疸、呼吸困難及下痢，最后導(dǎo)致豬的死亡。PCV2常與其他呼吸道病原混合感染，引發(fā)呼吸道癥狀，造成豬的死亡率劇增。PCV2是目前發(fā)現(xiàn)的最小病毒之一，其中的Cap蛋白是該病毒顆粒中的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，也是重要的保護性抗原。已發(fā)現(xiàn)PCV有4個血清型，即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，PCV1為非致病性病毒血清型，PCV2、PCV3和PCV4為致病性病毒血清型。PCV2可以分為5個基因型，分別是PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。我國目前豬圓環(huán)病毒病仍然以PCV2流行為主，PCV2a、PCV2b和PCV2d均有流行，尤其以PCV2b和PCV2d最為常見。預(yù)防仍然是控制該病的重中之重，國內(nèi)市場上使用的疫苗有全病毒滅活苗、聯(lián)合疫苗、合成肽苗、亞單位苗、嵌合疫苗等10種以上，30多家生產(chǎn)，主要是滅活苗和桿狀病毒基因工程滅活苗。國內(nèi)外疫苗的預(yù)防效果都沒有達到理想狀態(tài)，滅活苗應(yīng)激反應(yīng)大，吸收慢，現(xiàn)有疫苗價格還比較高，還有較多的疫苗針對PCV2a型病毒，對目前主要流行的PCV2b型病毒針對性不強。

病毒樣顆粒 (virus-like particles，VLPs)與天然病毒粒子結(jié)構(gòu)相同或相似，不含病毒核酸，不能進行自主復(fù)制，沒有毒力返強的可能，因其作為疫苗具有免疫效果好、生產(chǎn)周期短、穩(wěn)定性好、不具有感染性和不易失活等優(yōu)點，使其成為研發(fā)新型亞單位疫苗的熱點。本研究擬利用多角體病毒構(gòu)建表達PCV2 Cap蛋白抗原，并對表達蛋白及構(gòu)建的病毒株進行鑒定，進一步評估構(gòu)建的病毒株的生物學(xué)和免疫學(xué)特性，為開發(fā)新型、高效的豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和載體 昆蟲細胞sf9(Spodopterafrugiperda，ATCC CRL-1711)；昆蟲細胞High Five(粉紋夜蛾細胞，Trichoplusiani，Hi5，武漢普諾賽生命科技有限公司產(chǎn)品)；EscherichiacoliXL-1 Blue (Invitrogen,California,USA)，基因型為E.colimcrA 183△ (mcrCB-hsdSMR -mrr)173endA1sukpE44thi-1recA1gyrA96relA1lac(FproABlacqZ△M15 Tn5(Kan'))，pBacPAK8 transfer vector(TaKaRa Bio Company)和pBacF穿梭質(zhì)粒由人獸共患病研究教育部重點實驗室保存。

1.1.2 試驗用動物 長白豬(Landrace)來源于吉林大學(xué)實驗?zāi)翀觯?周齡，數(shù)量20頭，10 kg～15 kg，經(jīng)檢測PCV2核酸、PCV2 ELISA抗體均為陰性；新西蘭大白兔購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，8周齡(雄性)，數(shù)量6只，體重約1.75 kg～2 kg/只。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker(DL 2 000與DL 3 000)，北京百奧萊博科技有限公司產(chǎn)品；Cellfectin? Reagent，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；胎牛血清、細胞培養(yǎng)基、青鏈霉素，以色列BI公司產(chǎn)品；細菌檢測培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司產(chǎn)品；ECL Plus顯色劑，美國GE公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技公司產(chǎn)品；SpeⅠ及PstⅠ酶，大連TaKaRa公司產(chǎn)品；硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、酪胨瓊脂(GA)，北京寰宇科創(chuàng)公司產(chǎn)品；TNM-FH昆蟲培養(yǎng)基，上海Sigma公司產(chǎn)品；鼠抗Cap抗體，上海安研商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；羊抗鼠 IgG-HRP，日本Chemicon公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 核酸凝膠成像儀(E-Gel Imager)、蛋白智能成像系統(tǒng)(iBright)、PCR儀(Veriti)，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(CHEMISCOPE 6100 TOUCH)，上海勤翔科技儀器有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機(Microfuge 20/20R)，美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(H7650)，上海日立高新技術(shù)國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞準備與表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建 昆蟲細胞sf9采用Grace's 培養(yǎng)基培養(yǎng)，High Five(Hi5)采用Express Five? SFM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞解凍復(fù)蘇后，27℃～28℃培養(yǎng)，待細胞豐滿后收集細胞。臺盼藍染色，顯微鏡下觀察計數(shù)。

根據(jù)基因庫中我國流行PCV 2b型的核苷酸序列，針對N末端核定位信號序列中的11個核苷酸進行突變，并在讀框兩端加入SpeⅠ及PstⅠ酶切位點，合成cap序列，命名為MG4H。克隆至pUC57后，對cap基因克隆質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒pBacF進行SpeⅠ及PstⅠ酶切，將基因片段 MG4H通過T4 DNA連接酶連接到pBacF上，轉(zhuǎn)化E.coliXL-1 Blue中，以PCR及限制性酶切鑒定重組穿梭載體。

1.2.2 重組病毒拯救 取3×105/mL昆蟲細胞sf9 回種至12孔板組織培養(yǎng)皿中，室溫至細胞貼附，再將重組病毒DNA 1 μg 與2 μL flashBAC DNA 及2 μL Cellfectin? Reagent以Grace's 培養(yǎng)基混勻，室溫下靜置45 min，去除上清液。以Sf-900 Ⅱ SFM清洗2次，取混合物1 mL加入含細胞的12孔板組織培養(yǎng)皿中，27℃～28℃靜置5 h，去上清，再加入1 mL生長培養(yǎng)基 (TNM-FH)，27℃～28℃培養(yǎng)5 d以上或觀察到細胞感染病變。

轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)3 d～5 d回收病毒。取少許裂解細胞上清，通過負染進行透射電鏡觀察。取感染細胞3×105/mL均勻回種至12-孔板中，室溫下靜置至細胞貼附，再將P0 viral stock 15 μL加入培養(yǎng)基中，27℃～28℃培養(yǎng)5 d后，回收P1病毒，重復(fù)此步驟擴增P2重組桿狀病毒，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

利用PureLinkTMViral RNA/DNA Mini kit (Invitrogen?)抽取重組病毒DNA。利用引物PCV2-F1：AACCATCTCGCAAATAAATA和PCV2-F2：ACGCACAGAATCTAGCGCTT進行PCR鑒定，條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min，將PCR產(chǎn)物送公司測序。

1.2.3 表達蛋白特性分析 擴增的Cap蛋白大小應(yīng)為28 ku，BSA作為標準品對照。電泳后考馬斯亮藍染色并以凝膠成像儀掃描、Image J軟件分析蛋白含量。此外，取PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，加入Blocking 緩沖液于4℃振蕩1 h。加入一抗稀釋1∶2 000，4℃振蕩18 h，清洗數(shù)次；加入二抗稀釋1∶15 000，4℃振蕩60 min，1× PBST清洗數(shù)次。加入ECL Plus顯色劑(GE Healthcare)，反應(yīng)1 min。

以病毒培養(yǎng)液SDS-PAGE電泳測定表達的Cap蛋白含量。

1.2.4 重組病毒鑒定與純凈檢驗 將第2代重組病毒培養(yǎng)物分別接種于含Hi5細胞單層的96孔培養(yǎng)板，同時設(shè)立陰性對照。置27℃～28℃繼續(xù)培養(yǎng)至第6 d，根據(jù)細胞病變，按Reed-Muench法計算各培養(yǎng)時間下的病毒TCID50/mL。

取不攜帶任何外源基因的重組桿狀病毒(≥105.5TCID50/mL)肌肉注射家兔 4次～6次，分離血清，在靜置培養(yǎng)的Hi5細胞上測定血清的中和效價。用滅菌生理鹽水將桿狀病毒特異性抗血清(≥1∶1024)稀釋100倍，取100 μL和等體積的200 TCID50/mL的flashBAC-PCV2-ORF2株細胞培養(yǎng)物再接種Hi5細胞與培養(yǎng)，進行病毒特異性鑒定。

在重組病毒純凈檢驗中取第2代重組病毒培養(yǎng)物，分別接種TG、GA培養(yǎng)基各2支，每支200 μL，1支置37℃培養(yǎng)；1支置25℃培養(yǎng)；另取葡萄糖蛋白胨肉湯1支，置25℃培養(yǎng)，觀察5 d有無細菌生長。取第2代重組病毒培養(yǎng)物同時用液體和固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，設(shè)正常細胞培養(yǎng)物為陰性對照、接種豬鼻支原體為陽性對照。結(jié)果判定：接種被檢物的任何一個瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落時，判細胞不合格；陽性對照中至少有一個平板出現(xiàn)支原體菌落，而陰性對照中無支原體生長，則檢驗有效。

重組病毒培養(yǎng)物用桿狀病毒抗血清中和以后，接種sf9細胞，T25細胞培養(yǎng)瓶9個，每瓶接2.0 mL，置27℃～28℃靜置培養(yǎng)4 d，觀察是否出現(xiàn)細胞病變。按上方法再連續(xù)傳代2次，觀察是否出現(xiàn)細胞病變。取已接種用桿狀病毒抗血清中和的重組病毒培養(yǎng)物的sf9細胞6瓶，2瓶作為對照加PBS吸附，其他4瓶加入0.2%紅細胞懸液，5.0 mL/瓶，分別置4℃(2瓶)和25℃(2瓶)孵育30 min，檢查紅細胞吸附外源病毒情況。最后一次繼代的細胞單層經(jīng)丙酮固定后，用適宜的熒光抗體進行染色，檢查每一組單層是否存在特定外源病毒的熒光。

1.2.5 重組病毒免疫原性和病毒攻擊免疫保護性分析 選取6周齡PCV2核酸、PCV2 ELISA抗體均為陰性的健康長白豬20頭，隨機分為4組，每組5頭，其中1組為免疫組，另外3組為對照組，分別為非免疫攻毒對照組、免疫桿狀病毒載體對照組和空白(PBS)對照組。免疫組5頭豬頸部肌肉注射疫苗1頭份/1mL，免疫后隔離飼養(yǎng)14 d后，針對免疫組和各對照組的豬只分別同時采血，分離血清。針對血清樣品，采用本課題組建立的試劑盒(PCV2-iELISA)和中和試驗測定免疫組、免疫桿狀病毒載體對照組和空白對照組共3組豬的PCV2 ELISA抗體和中和抗體。

疫苗免疫14 d進行免疫攻毒試驗時，免疫組、非免疫攻毒對照組2組中每頭豬各攻豬圓環(huán)病毒SY-12株5 mL(≥105.5TCID50/mL)，在攻毒28 d時，稱量每頭豬體重，計算相對增重率；剖檢每頭豬腹股溝淋巴結(jié)，觀察淋巴結(jié)大小；分別采集血清和腹股溝淋巴結(jié)，針對血清作PCV2核酸PCR擴增，淋巴結(jié)做免疫組化染色。依據(jù)臨床癥狀、攻毒后的死亡和病理剖檢、核酸和抗原的檢測綜合判定重組病毒的免疫原性和免疫保護性。

2 結(jié)果

2.1 cap基因表達載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI公開的PCV2 ORF2基因(Cap蛋白)序列，合成了cap基因，并在兩末端分別設(shè)SpeⅠ及PstⅠ酶切位點，命名為MG4H。將獲得的MG4H基因克隆至pUC57質(zhì)粒中，形成pUC57-MG4H。以SpeⅠ及PstⅠ酶切pBacF質(zhì)粒及pUC57-MG4H純化后，T4 DNA連接酶將pBacF與MG4H基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化至E.coliXL-1 Blue中。最后，以限制性內(nèi)切酶酶切方式對穿梭質(zhì)粒pBacF-MG4H進行鑒定，酶切鑒定結(jié)果證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 病毒拯救

通過PCV2cap重組DNA和flashBAC DNA拯救病毒，重組病毒獲得拯救后，在sf9細胞上出現(xiàn)明顯病變。通過細胞凍融收集病毒上清，電鏡觀察到重組病毒形態(tài)呈現(xiàn)典型桿狀病毒形態(tài)，說明病毒拯救成功。

M.DNA標準DL 3 000；1.MG4H穿梭質(zhì)粒；2.酶切PCV2 cap基因M.DNA Marker DL 3 000;1.Shuttle plasmid MG4H;2.Enzyme digestion of PCV2 cap gene圖1 PCV2 cap基因MG4H穿梭質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of MG4H shuttle plasmid carrying pCV2 cap gene

2.3 重組病毒表達Cap蛋白分析

重組病毒cap基因PCR核酸特異擴增結(jié)果可見在822 bp處有明顯條帶。經(jīng)過SDS-PAGE分析，病毒表達蛋白與Cap蛋白特異性抗體發(fā)生了反應(yīng)(圖2，大小28 ku)，說明重組病毒Cap蛋白具有良好的特異反應(yīng)原性。針對第3代重組病毒培養(yǎng)不同時間后Cap蛋白表達量的檢測結(jié)果顯示，重組病毒在感染細胞后3 d、4 d和6 d時蛋白表達量呈現(xiàn)遞增趨勢，6 d含量最高，約為155 μg/mL。

2.4 重組病毒的特性鑒定與純凈分析

通過接種sf9細胞后觀察細胞病變，并按Reed-Muench法計算，第2代重組病毒培養(yǎng)物的半數(shù)細胞感染量(TCID50/mL)為104.5/0.1 mL。

通過用不攜帶任何外源基因的重組桿狀病毒(≥105.5TCID50/mL)肌肉注射家兔6只，免疫4次～6次后，獲得血清175 mL，混合后經(jīng)中和抗體測定，中和抗體水平為1∶2 048。按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗合格。該血清稀釋100倍后取100 μL和等體積的含200 TCID50/mL的flashBAC-PCV2-ORF2病毒株細胞培養(yǎng)物在27℃反應(yīng)1 h后接種Hi5細胞6孔，同時設(shè)不加血清的rBAC-BD06G株接種Hi5細胞對照6孔，觀察6 d。血清中和孔的細胞無病變，而不加血清的對照細胞均有細胞病變，說明制備的血清特異性好。

1.蛋白Marker；2.BV-MG4H/Hi-5感染細胞粗提物；3.Cap蛋白通過鼠抗Cap單抗和羊抗鼠二抗后反應(yīng)檢測1.Protein Marker;2.Crude extracts of cells infecting BV-MG4H/Hi-5;3.Cap protein tested by mouse anti-Cap monoclonal antibody and goat anti-mouse secondary antibody.圖2 Western blot分析Cap蛋白的表達Fig.2 Cap protein expression analized by Western blot

針對第2代重組病毒無菌檢驗時，對照無異常。第2代重組病毒無菌檢驗結(jié)果，25℃和37℃分別培養(yǎng)的TG小管、GA斜面和GP(葡萄糖蛋白胨湯)小管均未見細菌、霉菌生長。將病毒培養(yǎng)物 5 mL接種于20 mL支原體液體培養(yǎng)基的小瓶中移植培養(yǎng)，支原體檢驗結(jié)果如表1。

表1 第2代重組病毒培養(yǎng)物支原體檢驗結(jié)果Table 1 Mycoplasma test results of the second generation of recombinant virus culture

第2代重組病毒培養(yǎng)物用桿狀病毒抗血清中和以后，接種sf9細胞，27℃～28℃連續(xù)盲傳5代均未出現(xiàn)細胞病變；針對接種細胞進行吉姆薩染色，細胞未出現(xiàn)包涵體、巨細胞等病理學(xué)變化。細胞單層培養(yǎng)至5 d時，抗BVDV抗體熒光染色，結(jié)果和正常sf9細胞空白對照均無熒光出現(xiàn)，但BVDV接種對照的MDBK細胞對照出現(xiàn)了特異性熒光。單層細胞培養(yǎng)至7 d時，加入0.2%豚鼠紅細胞和0.2%雞紅細胞等量混合懸液后，4℃和25℃吸附30 min后，均未發(fā)現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象。對照無異常，說明重組病毒沒有被其他外源病毒污染。

2.5 重組病毒免疫原性和病毒攻擊保護性試驗

免疫組、桿狀病毒載體對照組和空白對照組豬在免疫前及免疫后14 d采集血清，采用PCV2-iELISA抗體檢測試劑盒和中和試驗檢測的免疫豬和對照豬的PCV2抗體(未免疫攻毒組默認沒產(chǎn)生抗體)，結(jié)果見表2。

表2顯示PCV2-iELISA抗體檢測試劑盒檢測的抗體水平與中和試驗測定的中和抗體水平定性結(jié)果基本一致，免疫豬產(chǎn)生了特異性抗體和中和性抗體。但二者檢測結(jié)果的高低似乎相關(guān)性不大。

表2 免疫后14 d血清中PCV2特異性抗體檢測結(jié)果Table 2 Results of PCV2 specific antibody detection in serum at day 14 after immunization

以100 μg Cap蛋白免疫豬14 d后攻毒結(jié)果為免疫組5頭豬全部保護。非免疫攻毒對照組5頭豬攻毒后均發(fā)病，其中3頭出現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)腫大，攻毒后28 d腹股溝淋巴結(jié)免疫組化染色陽性，血清PCV2 核酸PCR擴增陽性，相對增重率顯著低于空白對照組；2頭出現(xiàn)連續(xù)3 d體溫升高至40℃以上和腹股溝淋巴結(jié)腫大，攻毒后28 d腹股溝淋巴結(jié)免疫組化染色陽性，血清PCV2 核酸PCR擴增陽性，相對增重率顯著低于空白對照組?？瞻讓φ战M5頭豬臨床表現(xiàn)全部正常，淋巴結(jié)沒有異常變化。免疫組豬增重分別為3.5%、4.9%、1.6%、3.5%、3.8%，非免疫攻毒對照組分別為1.3%、-1.5%、0.7%、1.1%、-1.8%，空白對照組分別為9.1%、12.4%、9.4%、7.3%、8.2%。

3 討論

PCV2主要通過寄居免疫細胞侵襲豬體，損傷免疫細胞，破壞機體免疫功能[1]，產(chǎn)生的抗體對細胞內(nèi)病毒抵抗效果減弱。因此，預(yù)防性免疫對圓環(huán)病毒侵襲十分重要。PCV2感染的結(jié)果取決于感染過程中產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)，在PCV2侵襲情況下病豬免疫功能低下，無法形成有效的免疫反應(yīng)來清除循環(huán)中的病毒[2]。

目前國內(nèi)已經(jīng)批準上市和應(yīng)用的圓環(huán)病毒疫苗主要是完全病毒的滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗，各方面效果較為理想的更傾向于亞單位疫苗。滅活苗因培養(yǎng)條件不同將導(dǎo)致細胞含毒量差別較大，也可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且疫苗的有效抗原含量及免疫原性受滅活劑影響較大，滅活劑對疫苗的免疫應(yīng)答也有較大影響，加大了機體副反應(yīng)的概率。雖然目前國內(nèi)已經(jīng)上市了8種以上的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，但此類疫苗存在價格較高的缺點。此外，豬圓環(huán)病毒多與其他病原混合感染，且混合感染癥狀更嚴重[3-5]，因此，豬圓環(huán)病毒疫苗也經(jīng)常制備成聯(lián)合疫苗，使其預(yù)防范圍和預(yù)防效果均得到提高[6-8]。亞單位疫苗與滅活苗相比，具有生產(chǎn)相對容易、產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物誘導(dǎo)免疫反應(yīng)快、免疫效果好等優(yōu)點，受到生產(chǎn)企業(yè)和用戶青睞[9-10]。Cap蛋白是圓環(huán)病毒唯一具有有效免疫原性的蛋白，是該病毒疫苗開發(fā)的理想靶抗原。試驗結(jié)果證明該蛋白亞單位疫苗具有促生長、降低死亡率、預(yù)防效果好等優(yōu)點，與Park等研究結(jié)果相似[11]。試驗設(shè)計以多角體桿狀病毒表達Cap蛋白，結(jié)果構(gòu)建的表達載體表達Cap蛋白含量達155 μg/m L以上，與李富強等[12]的畢赤酵母表達水平相當(dāng)，與其他國內(nèi)類似研究相比，其結(jié)果也屬于高表達水平[13,14-18]。成功疫苗的關(guān)鍵是容易生產(chǎn)、產(chǎn)量高、成本低，這些基本條件在flashBAC-PCV2-ORF2病毒株已經(jīng)基本具備，而且對病毒攻擊的免疫保護性非常好，具備了疫苗的一般性質(zhì)。編碼豬圓環(huán)病毒2型豬補體C3d-P28和ORF2融合蛋白的候選DNA疫苗[9,7,16]，能夠增加預(yù)防更多型別的豬圓環(huán)病毒侵襲，證明核酸疫苗也具有較好的預(yù)防效果。由于豬圓環(huán)病毒以變異率高為特征，各地流行的變異株也各有特點[3-4,17,5]，如果考慮廣譜性預(yù)防，聯(lián)合疫苗也可能是一種較佳的選擇。也可以用昆蟲或植物載體的亞單位疫苗[10,18]，效果和產(chǎn)量都很好，也是制備亞單位疫苗的有效途徑。

利用多角體病毒載體成功構(gòu)建了表達PCV Cap蛋白的重組病毒-flashBAC-PCV2-ORF2株，構(gòu)建的Cap蛋白桿狀病毒表達載體具有良好的免疫原性，僅一次劑量就可以很快出現(xiàn)免疫反應(yīng)，且能夠基本保證預(yù)防強毒株的攻擊，具有較好的免疫保護作用。表達的抗原量在155 μg/mL以上，具備了規(guī)?；a(chǎn)的基本條件。后續(xù)將進一步探索構(gòu)建的Cap蛋白桿狀病毒載體的疫苗價值，為增強其免疫效果，還要考慮佐劑的配合使用，探討在佐劑配合下進一步提高其免疫效果的方式，達到一針解決免疫預(yù)防的目標。