禽腺病毒4型的研究現(xiàn)狀

薛曉巖，張振興，季 佳，王雯慧,3，代紅煬，李高銀，李素華*，宋建領(lǐng)*

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650031；4.會澤黑頸鶴國家級自然保護區(qū)管護局，云南曲靖 654200；5.昭陽區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南昭通 657000)

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4，AdV-4)是近年來在我國暴發(fā)的以禽心包積液和肝炎為主要特征的病毒性傳染病，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病起源于巴基斯坦安卡拉地區(qū)，又稱“安卡拉病毒”，之后在伊拉克、印度、智利、美國南部和中部、韓國、波蘭、日本等國家和地區(qū)大面積暴發(fā)和流行。2014年我國北方多地相繼暴發(fā)該病，2015年開始在我國呈地區(qū)流行態(tài)勢。近年來，該病的診斷技術(shù)、疫苗研制和防控技術(shù)的研究都取得了一定的進展，為了更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行，本文比較全面的綜述了該病的病原學(xué)特點及其研究成果。

1 禽腺病毒的病原學(xué)

1.1 禽腺病毒分類

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是屬于禽腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒屬的是一種DNA病毒。根據(jù)病毒群特異性抗原的差異性，可將FAdV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞群。禽腺病毒Ⅰ群(FAdV-Ⅰ)具有共同的群抗原，是雞胚致死孤兒病(chicken embryo lethal orphan，CELO)和雞包涵體肝炎(inclusion-body hepatitis，IBH)的主要病原；禽腺病毒Ⅱ群(FAdV-Ⅱ)是雛雞大理石脾病(Marble spleen disease，MSD)的主要病原；禽腺病毒Ⅲ群(FAdV-Ⅲ)是引起減蛋綜合征(Egg drop syndrome，EDV)的代表性毒株。

FAdV Ⅰ群與Ⅱ群無抗原相關(guān)性，二者與Ⅲ群只有部分抗原交叉反應(yīng)[1]。根據(jù)抗血清的交叉中和反應(yīng)特性和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)分析,可將Ⅰ亞群FAdV分為12個血清型(1～8a，8b～11)和5個基因型(A～E)。血清型和基因型具有確定相關(guān)性，其中A基因型包括1個血清型(FAdV-A-1)，B基因型包括1個血清型(FAdV-B-5),C基因型包括2個血清型(FAdV-C-4和FAdV-C-10),D基因型包括4個血清型(FAdV-D-2、FAdV-D-3、FAdV-D-9和FAdV-D-11),E基因型包括4個血清型(FAdV-E-6、FAdV-E-7、FAdV-E-8a和FAdV-E-8b)。當(dāng)前國內(nèi)主要流行C和E兩種基因型，F(xiàn)AdV-11、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b，F(xiàn)AdV-D-11等血清型均在國內(nèi)感染雞中分離到，尤其以FAdV-C-4流行范圍最廣、致病性最高，在家禽養(yǎng)殖中危害最大[2，3]。

1.2 禽腺病毒結(jié)構(gòu)及主要結(jié)構(gòu)蛋白

FAdV是20面體對稱的球形狀，無囊膜包被，直徑為70 nm～90 nm[4]，病毒外殼由衣殼蛋白(Capsid)、核酸芯髓(Core)和纖突(Fiber)及相關(guān)蛋白組成，病毒結(jié)構(gòu)如圖所示(圖1)[5]。其中衣殼蛋白由240個六鄰體(Hexon)、12個五鄰體(Penton)和12個纖突(Fiber)3種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成[6]。病毒核酸為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，包裹在蛋白質(zhì)外殼中心部位，占整個病毒體積的11%～14%，因此FAdV也被認為是目前體積最大和結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的DNA病毒?；蚪M約為43 kb～46 kb，基因兩端各含有一個約40 bp～200 bp末端重復(fù)序列[7]。

圖1 禽腺病毒粒子模式圖[5]Fig.1 Pattern diagram of avian adenovirus particles[5]

1.2.1 六鄰體蛋白 六鄰體(Hexon)蛋白基因全長2 829 bp，共編碼943個氨基酸，是結(jié)構(gòu)蛋白中含量最高、分子量最大、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的蛋白，且FAdV各亞群的Hexon具有較高同源性。Hexon是由3條長度相近的六鄰體多肽鏈(330 ku～360 ku)聚合而成的非頂點殼粒子。每個六鄰體多肽由基底區(qū)(pedestal regions)和高變環(huán)區(qū)(variable loops)兩部分構(gòu)成，基底區(qū)包括P1、P2兩個保守區(qū)域，高變環(huán)區(qū)由Loop 1～4共4個環(huán)裝區(qū)共同構(gòu)成，其中Loop 1區(qū)由132-289位aa組成，Loop 2區(qū)由363-507位aa組成，Loop 4區(qū)在793-878位aa組成[8，9]。Hexon蛋白具有特異抗原決定簇，可通過loop 1區(qū)遺傳進化分析確定FAdV血清型[10]。FAdV的毒力也可能由Hexon介導(dǎo)，高致病性FAdV-4毒株的Hexon蛋白被非致病性毒株Hexon替換后，毒力明顯減弱[11]。此外，Hexon蛋白的高變環(huán)區(qū)與病毒感染力密切相關(guān)，研究表明在FAdV復(fù)制前期，高變環(huán)區(qū)與宿主肺巨噬細胞scavenger受體SR-A6的結(jié)合，可促進病毒入侵宿主細胞，并加快復(fù)制過程[12]。

1.2.2 五鄰體蛋白 五鄰體(Penton)蛋白由5個多肽組成頂點殼粒，殼粒直徑8 nm～10 nm，均排在三角形面上。Penton可與Hexon蛋白結(jié)合介導(dǎo)病毒與宿主細胞黏附，并通過與宿主細胞受體結(jié)合，激活宿主細胞發(fā)生病變[13]。

1.2.3 纖突蛋白 衣殼蛋白的12個纖突(Fiber)蛋白均以Penton base為基底，長約為9 nm～77.5 nm，以天線樣穿過衣殼伸出到頂端，是病毒最外側(cè)蛋白[14]。蛋白遠端為頭結(jié)區(qū)，形成球域蛋白(Knob protein)，結(jié)合有FAdV的血凝素蛋白，是病毒與宿主細胞表面受體結(jié)合的部位，直接介導(dǎo)病毒與靶細胞接觸。通常哺乳動物腺病毒只有一種纖突蛋白，而FAdV中均存在兩種長度具有差異的纖突蛋白，即長纖維Fiber-1和短纖維Fiber-2，分別由基因獨立編碼。雖然兩種Fiber蛋白的存在是所有FAdV所共有的，不同血清型FAdV中的兩種Fiber編碼基因具有差異性，使得Fiber長度存在血清型差異性,其中FAdV-A-1是唯一存在50 nm極端長度差的血清型，這一特征可作為FAdV-A-1與其他血清型的鑒別標志[15]。然而有研究對FAdV代表毒株的Fiber序列深入研究后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-C是唯一具有相同長度的Fiber蛋白的FAdV物種[16]。研究表明，F(xiàn)iber-2基因有助于增強病原體的增殖能力，缺失該基因，將無法產(chǎn)生病毒粒子，從而使病毒失去毒性，高致病性FAdV-4毒株的Fibe-2被弱毒株ON1 Fiber-2替換后病毒毒性明顯減弱[10]。

1.3 禽腺病毒理化特性

由于FAdV無囊膜包被，因此病毒對乙醚、胰蛋白酶等脂溶劑具有較強的抵抗力，經(jīng)脂溶性溶劑處理后的病毒仍具有感染性。低溫環(huán)境更有利于FAdV-Ⅰ病毒粒子存活，可在-20℃環(huán)境中長期存活，但在56℃經(jīng)30 min可滅活；病毒對pH環(huán)境有相當(dāng)強的耐受能力，在pH 3～9中仍可保持感染性。但1 g/L的甲醛溶液和DNA抑制劑5-碘-2脫氧尿苷可使病毒迅速滅活。FAdV-Ⅰ不可凝集禽類紅細胞，但在pH 6～9的室溫條件下可凝集大鼠紅細胞，血凝素對胰酶、RNA酶、神經(jīng)氨酸酶不敏感。

2 FAdV-4流行病學(xué)特征

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是致病性最強的腺病毒[17]，不僅能夠引起雞包涵體肝炎，還能引起心包積液，稱為心包積液-包涵體肝炎綜合征(Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis,HPS-IBH)或者稱為雞心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS)[18]。該病最早暴發(fā)于1987年的巴基斯坦的安卡拉地區(qū)的肉雞場內(nèi)，因為較強的傳染性使得在巴基斯坦其他地區(qū)迅速傳播，故又稱為“安卡拉病毒”。

2.1 FAdV-4的易感動物

FAdV-4易感肉雞、蛋雞、鴨、鵝等家禽，也可感染野生禽類。有學(xué)者[19]在野生黑鳶組織細胞切片中發(fā)現(xiàn)類似腺病毒的病毒顆粒。2014年有學(xué)者[20]在鴕鳥、烏鴉和鴿中成功分離到FAdV-Ⅰ，并通過陽性標準血清將分離株鑒定為FAdV-4。通過血清學(xué)試驗，在麻雀、孔雀血液中檢測到FAdV-4抗體呈陽性。研究者在死亡南極賊鷗的心臟、氣管、肺臟、腸道、肝臟以及腎臟組織中用PCR技術(shù)成功獲得FAdV基因組全長[21]。在2020年，國內(nèi)研究者第一次從鵪鶉中分離到FAdV-4毒株[22]。此外，我國學(xué)者從疑似患有HPS-IBH的鴛鴦肝臟組織中分離鑒定到一個FAdV-4分離株，該毒株來自患HPS-IBH家禽傳播感染[23]。

2.2 FAdV-4的傳播途徑

通常該病多見于高溫和潮濕地區(qū)，并且與多種家禽混養(yǎng)地區(qū)或者大規(guī)模飼養(yǎng)肉雞地區(qū)。研究表明，F(xiàn)AdV-4能長期潛伏于糞便、鼻氣管黏膜和腎臟中，可以通過各種排泄物排毒，其中糞便中載毒量最高，因此大部分發(fā)病雞是通過帶毒糞便經(jīng)糞-口途徑傳播。研究顯示病毒可通過呼吸道排放的病毒顆粒形成氣溶膠，在雞群短距離范圍內(nèi)緩慢傳播，但感染率較低。此外，病毒也可通過種蛋、雞胚垂直傳播。

2.3 FAdV-4的流行特征

起源于巴基斯坦安卡拉的FAdV-4，目前已在印度、中東、土耳其、斯洛伐克、墨西哥、秘魯、厄瓜多爾、俄羅斯、孟加拉國、智利、韓國和科威特有報道[24]。2014年開始在我國多地零星散發(fā)，2015年6月在我國呈現(xiàn)地方流行性，在山東、河南、江蘇、安徽、湖北、廣東、海南、云南等地均有報道[25,26]。研究者通過對我國2015年-2016年流行的105株FAdV進行序列分析發(fā)現(xiàn)，其中93%為FAdV-4，說明FAdV-4是引起我國雞HPS的主要病原[27]。通過對2015年我國分離到的12株FAdV-4的Hexon基因遺傳進化分析表明，國內(nèi)流行毒株可能源于印度株[28,29]。病毒分子特征分析顯示2015年國內(nèi)流行的FAdV-C-4和FAdV-E-8b毒株的Hexon蛋白，相比早期毒株已分別出現(xiàn)17個和84個核苷酸突變位點，氨基酸突變率分別為2.9%和10.4%。深入研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)不同地區(qū)的分離株可能具有共同的祖先，李昕鍵等[30]分離到的海南HN1605毒株與山東分離株SDSX、SDXT2-15、SDSX-15、SDNY2-15 和湖北分離株HB1510、HBLF-15均來自同一毒株。近年來，國內(nèi)開始出現(xiàn)FAdV-4新毒株，這些毒株均分離自IBH和HPS患雞，該毒株與以往毒株的全基因組序列相比有一個ORF19缺失，為近年來FAdV-4毒性和傳染性增強提供一定的理論基礎(chǔ)[31]。

3 FAdV-4型檢測方法

3.1 病毒分離

由于肝臟是病毒載量最高的發(fā)病器官，通過將病雞肝臟組織研磨、過濾、除菌制成懸液，接種于6～9日齡SPF雞胚的卵黃囊、尿囊膜或尿囊腔的方式盲傳3代，收集雞胚尿囊液、尿囊膜雞雞胚肝組織可實現(xiàn)病毒的分離和純化。有研究表明FAdV-4經(jīng)卵黃囊途徑接種雞胚后在雞胚肝臟組織中的增殖效果最好，病毒載量最高，雞胚胎腎細胞、肝細胞、成纖維細胞中也能分離到病毒，但病毒載量較低[32]。

3.2 分子生物學(xué)技術(shù)

實驗室最常用的檢測FAdV-4的方法是針對Hexon和Fiber設(shè)計引物，通過PCR鑒別特定血清型。近年來熒光定量PCR及特異性LAMP也被應(yīng)用于FAdV-4的鑒定。Pan等人建立了針對Hexon Loop 1區(qū)的探針熒光定量PCR檢測方法，具有更高的敏感性[33]。鐘鳴等人建立了FAdV-4特異性LAMP的檢測方法。也有學(xué)者[34]建立了基于Fiber基因的PCR-RFLP方法，可有效鑒別毒株是否可誘導(dǎo)HPS。

3.3 血清學(xué)方法

血凝和血凝抑制試驗常用于鑒定FAdV-4的血清型。Manzoor S等人通過使用人O型紅細胞血凝抑制試驗從野鳥中檢測出FAdV-4的血清抗體。近年來Feichtner等人利用FAdV-1和FAdV-4的Fiber作為抗原建立了2種血清型的ELISA鑒別檢測方法[35]。研究表明FAdV-4血清可以中和FAdV-11，但FAdV-11血清卻不能中和FAdV-4，同時FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b之間也均不能相互中和，但FAdV-11與FAdV-8b之間可以相互中和[9]。

4 FAdV-4型疫苗

在研制FAdV-4弱毒活疫苗和油乳劑滅活疫苗的同時，很多研究者在FAdV-4基因工程疫苗和亞單位疫苗研究中也獲得一定進展。張丹等研制的Penton、Fiber 2亞單位疫苗免疫均可使SPF雞獲得100%的保護率，且以Penton蛋白為抗原的疫苗刺激雞產(chǎn)生的抗體效價更高，抗體保護期更長[36]。范維等研制的FAdV-4 Fiber 2蛋白亞單位疫苗也能夠保護雞只免受強毒的攻擊[37]。韋悠等制備了FAdV-4和FAdV-8的多價油乳劑滅活苗，結(jié)果表明該疫苗穩(wěn)定性及安全性良好，免疫效果能持續(xù)6個月以上[38]。龐洪澤構(gòu)建的FAdV-4 Hexon和Penton串聯(lián)基因核酸疫苗，在雛雞體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體[39]。疫苗的制備工藝也將影響免疫效果，研究表明HPS病死雞肝勻漿油乳劑疫苗保護效果明顯較鋁膠佐劑的效果要好,雞胚肝細胞勻漿(CEHH)疫苗的抗原含量較HPS-LH要低很多[40]。

5 展望

近年來，由于FAdV-4的迅速傳播，對國內(nèi)外家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，該病的預(yù)防措施和治療得到了國內(nèi)外研究人員的高度重視。研究人員通過對FAdV-4病毒粒子的研究，一些制備的滅活疫苗和新型疫苗對阻斷FAdV-4的傳播有一定的效果。為了有效防控該病的發(fā)生與流行，應(yīng)該加強對新出現(xiàn)的FAdV-4型毒株生物學(xué)特性、發(fā)病機制、診斷檢測技術(shù)、該病與家禽其他傳染病之間的關(guān)聯(lián)性研究。家禽感染FAdV-4后誘導(dǎo)宿主免疫器官產(chǎn)生免疫逃避，應(yīng)進一步探究其潛在的分子機制和參與該過程的細胞因子對闡明該病發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)；在終端檢測技術(shù)方面，未來應(yīng)研究敏感、特異、快速的新型等溫擴增、免疫酶等檢測技術(shù)，能夠檢測不同感染宿主中不同組織樣品病原核酸；在該病與家禽其他傳染病之間的共感染中，應(yīng)該深入研究共感染因子和宿主之間的作用機制，對家禽常見疫病與FAdV-4共感染病例之間在組織損傷、生化水平和年齡依賴等方面進行對比，有助于對研究共感染的致病機制提供依據(jù)。