腎型傳染性支氣管炎病毒致病機(jī)理及疫苗研究進(jìn)展

李 寧，郭連營，許普之，黃 橙，陳 衛(wèi)，郭小權(quán)

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045)

腎型傳染性支氣管炎病毒(Nephropathogenic infectious bronchitis virus，NIBV)屬于γ冠狀病毒，傳染性及強(qiáng)，且傳播速度快[1]，可損傷雞的多個器官組織[2]。病雞咳嗽、打噴嚏、拉白色稀便、產(chǎn)蛋下降等臨床表現(xiàn)，且表現(xiàn)出強(qiáng)烈的腎臟組織嗜性，是誘發(fā)內(nèi)臟痛風(fēng)暴發(fā)的主要病原體之一[3]，在感染NIBV后，病死率可達(dá)5%～30%[4]。

NIBV基因組為單股正鏈RNA，全長約為27.6 kb，是已知RNA病毒中最大的病毒[5]。此病毒由4種編碼結(jié)構(gòu)蛋白和15種非結(jié)構(gòu)蛋白共同調(diào)節(jié)。結(jié)構(gòu)蛋白中纖突蛋白S1基因變異性最大，且S1氨基酸序列的變異性決定了IBV的宿主和組織趨向性[6]；N基因進(jìn)化最慢，而E基因在所有結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因中進(jìn)化速度最快；M蛋白是病毒結(jié)構(gòu)總蛋白含量的40%左右,近N末端有2個糖基化位點(diǎn)，C端無明顯的親水區(qū)或疏水區(qū),其作用與病毒顆粒的形成相關(guān)[7]。

在過去的15年里，特別是在亞洲和中東國家，腎型IBV已成為主要的IBV類型[8]。第一個腎源性IBV毒株在美國和澳大利亞報道，后來在世界其它地區(qū)均見報道[9]。在2011年、2014年和2019年，中國分別發(fā)現(xiàn)DMV/1639/11、γCoV/CK/China/I0111/14和SD/04/1等腎源性毒株[10]。QX型IBV于1996年在中國首次被報道[11]，之后腎型QX毒株在中國、德國、荷蘭、比利時、法國、瑞典、波蘭、俄羅斯、斯洛文尼亞、西班牙和英國廣泛流行[12]。新型腎型毒株有B1648毒株、KM91毒株、Morocco/38毒株、SCU-14/2013-1毒株、Eg/CLEVB-2/IBV/012毒株和QX毒株等分別在比利時、韓國、墨西哥、利比亞、埃及、中國等國家(或地區(qū))流行[9]。

由于該病毒不僅可以通過排泄物污染進(jìn)行接觸性傳播，也可以通過空氣進(jìn)行呼吸道傳播；病雞康復(fù)后35天內(nèi)仍具傳染性，傳播速度又快，只要雞群發(fā)病就會快速蔓延至全群；并且所有日齡的雞不分性別和品種，均對NIBV易感；又因?yàn)镹IBV基因組在日常環(huán)境中易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等極易發(fā)生改變。因此，在NIBV的預(yù)防、診斷和治療方面具有很大的挑戰(zhàn)。

1 致病機(jī)理

在20世紀(jì)末和21世紀(jì)初，我國主要通過生化指標(biāo)和組織病理切片來研究NIBV對腎臟的損傷程度。得到的結(jié)果是NIBV感染后，造成雞腎小管上皮細(xì)胞的損害和間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的浸潤，從而導(dǎo)致腎臟功能下降，引起尿酸鹽排泄障礙并在腎臟中沉積，進(jìn)一步加速腎衰竭甚至壞死[13]。但隨著科技的發(fā)展，我國對NIBV致病機(jī)理進(jìn)行了更加深入的研究。

近幾年有研究者表明NIBV感染可引起腎臟XOD基因轉(zhuǎn)錄水平增高和血清XOD活性的增強(qiáng)。也引起血清中MDA的含量升高、GSH-PX和SOD的含量降低，從而直接導(dǎo)致抗氧化酶的減少；抗氧化酶的減少，引起ROS與機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和碳水化合物結(jié)合產(chǎn)生更多的自由基，從而使體內(nèi)抗氧化功能再次降低，進(jìn)一步促進(jìn)腎臟損傷、加速尿酸沉積，導(dǎo)致高尿酸血癥[14](圖1)。且在NIBV感染后，Toll樣受體激活機(jī)體天然免疫NF-κB信號通路，誘導(dǎo)促炎因子(IL-6、IL-1β)、抗炎因子IL-10和趨化因子的表達(dá)[15-16]。

圖1 NIBV感染機(jī)制圖[16]Fig.1 Mechanism diagram of NIBV infection

通過免疫組化和免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)病毒主要侵害肝臟組織中央靜脈周圍的細(xì)胞和腎臟組織的腎小管上皮細(xì)胞[17]，且肝和腎的損傷程度與NIBV感染后組織的病毒載量密切相關(guān)[2]。

通過NIBV感染實(shí)驗(yàn)動物后體外和體內(nèi)動態(tài)監(jiān)測器官組織的病毒載量，與呼吸型毒株相比，發(fā)現(xiàn)腎型IBV最先感染的器官是呼吸道黏膜，之后以外周血單核細(xì)胞為載體將病毒輸送至各器官組織[18]，而呼吸型毒株只能在支氣管內(nèi)繁殖，不能以單核細(xì)胞為載體擴(kuò)散病毒。

近幾年大量的研究者采用多組學(xué)方法來描述NIBV致痛風(fēng)雞腎臟的代謝變化和免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示[3]感染NIBV時可改變雞腎細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并破壞其形態(tài)，產(chǎn)生大量的ROS可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化和線粒體功能障；破壞腸黏膜的完整性、并可能減緩腸絨毛上皮細(xì)胞的生長；且16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)NIBV感染會改變雞回腸微生物的組成結(jié)構(gòu)，引起雞回腸微生物多樣性下降[19]。而腸道功能包括營養(yǎng)吸收、粘膜屏障強(qiáng)化、異生物代謝、血管生成、免疫和炎癥反應(yīng)。因此腸道微生物紊亂，導(dǎo)致機(jī)體對外界的體抗力下降，往往繼發(fā)或者并發(fā)支原體、大腸桿菌等疾病的感染，而提高雞群的死亡率。

機(jī)體感染NIBV一段時間后免疫系統(tǒng)會受到很大的干擾，一方面可以激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，另一方面也會損傷免疫器官，導(dǎo)致免疫功能紊亂。根據(jù)法氏囊代謝組學(xué)分析，從法氏囊組織中篩選出與腎型IBV發(fā)病機(jī)制相關(guān)的75種差異代謝物，主要有纈氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、支鏈氨基酸等物質(zhì)。這些小分子代謝物影響著糖酵解、糖異生、脂肪酸代謝、氨基酸代謝等能量代謝途徑[1]。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

前些年我國檢測NIBV的方法有血清學(xué)檢測技術(shù)，包括血凝和血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination and hemagglutination inhibition test,HA&HI)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization test,VN)、熒光抗體技術(shù)(fluorescent antibody technology,FA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)和膠體金免疫層析技術(shù)。隨著科技的發(fā)展，在經(jīng)典的IB診斷方法上，探索出特異性更高、敏感性更強(qiáng)、效率性更高、實(shí)用性更突出的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。目前分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、核酸探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)[20]。其他分子生物學(xué)技術(shù)如扣鎖探針(padlock probe,PLPs)和滾環(huán)探針技術(shù)、新一代測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)已被證明可用于檢測IBV[21]。

3 疫苗

本世紀(jì)初期，我國對NIB的防控主要采用的疫苗有弱毒苗、組織滅活苗和油乳劑苗。弱毒苗是用于控制IBV感染的第一代有效疫苗，也在家禽業(yè)中使用廣泛。滅活疫苗通常是通過甲醛等滅活劑滅活后制成，IBV滅活疫苗可以單獨(dú)使用或與IBV減毒活疫苗結(jié)合使用。如今我國對NIB進(jìn)行預(yù)防免疫的疫苗主要有弱毒苗、滅活苗、重組活載體疫苗、基因工程苗、核酸疫苗和亞單位疫苗。

3.1 弱毒苗

弱毒苗是從病原體中分離出來的，方法是將它們連續(xù)傳代到無特定病原體(specific pathogen free,SPF)的雞胚中。前些年研究者發(fā)現(xiàn)弱毒苗在免疫原性和免疫保護(hù)性之間表現(xiàn)出良好的平衡[22]，2017年BRU等人證明了在使用包含2種不同抗原疫苗的聯(lián)合計(jì)劃后，提高了不同血清型IBV的防護(hù);且在使用2種不同的減毒活疫苗時將間隔14 d比當(dāng)天將疫苗聯(lián)合使用可得到更廣泛的交叉保護(hù)[23]。雖然使用弱毒苗通常被認(rèn)為是控制該病毒感染最具效益的手段，但I(xiàn)BV疫苗的單一血清型不能提供足夠的保護(hù)，因此，生產(chǎn)者給予1種以上的疫苗血清型，以增加其群體的保護(hù)廣度；然而，這一策略增加了變異的風(fēng)險[24]。還因RNA病毒復(fù)制的特殊性，連續(xù)傳代產(chǎn)生的減毒疫苗株存在毒力返強(qiáng)或潛在重組的風(fēng)險[25]。重要的是，弱疫苗對高溫很敏感，因此在運(yùn)輸和儲存時要使用冷鏈來保持疫苗的質(zhì)量；然而，維持活疫苗質(zhì)量所需的額外制冷設(shè)備和冷藏室對偏僻地區(qū)的雞群接種疫苗的資源有限；一般來說，分配和管理成本通常大于疫苗生產(chǎn)成本；在發(fā)展中國家，這是廣泛實(shí)施免疫接種的主要障礙之一。也有學(xué)者為了優(yōu)化了弱毒苗，天然重組腎源性K40/09型IBV進(jìn)行了熱適應(yīng)，表現(xiàn)出顯著的高水平免疫原性和保護(hù)能力，且具有交叉保護(hù)作用[26]。

3.2 滅活苗

滅活疫苗通常是通過甲醛等滅活劑滅活后制成，可以單獨(dú)使用或與弱疫苗結(jié)合使用。滅活疫苗具有很高的安全性，但I(xiàn)BV滅活疫苗也面臨著一些缺陷，如缺乏引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力和缺乏交叉免疫保護(hù)的作用。且需多次免疫,免疫程序相對繁瑣。也有學(xué)者為了提高滅活苗的有效性，使用兩種活的異源IBV疫苗和滅活苗進(jìn)行接種，兩種異源活疫苗的結(jié)合使用確實(shí)提高了IBV滅活苗的有效性[27]，但尚未達(dá)到理想狀態(tài)?？紤]到滅活苗和弱毒苗的局限性，近年來研究者開發(fā)了重組活載體IBV疫苗，它們顯示出更高的安全性和有效性[28]。

3.3 新城疫病毒載體疫苗

近年來，重組活載體疫苗其安全性、遺傳穩(wěn)定性以及誘導(dǎo)對多種血清型病原體的免疫反應(yīng)等優(yōu)勢而被廣泛研究。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)載體疫苗是以表位為基礎(chǔ)的活載體疫苗，主要由3個B細(xì)胞中和表位和4個T細(xì)胞表位組成，疫苗菌株命名為rNDV-IBV-T/B，給機(jī)體提供了對抗同源和異源IBV菌株挑戰(zhàn)的能力[29]。由于rNDV-IBV-T/B疫苗菌株對高溫敏感，次年又開發(fā)了重組可熱型NDV載體疫苗，被稱為rLS-T-HN-T/B[30]。目前人們普遍認(rèn)為，重組活載體疫苗產(chǎn)生免疫效果較慢，且迄今為止所報道的使用病毒載體疫苗的結(jié)果并不完全令人滿意，必須探索新的載體。

3.4 基因工程疫苗

基因免疫是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的生物技術(shù),其安全性及高效性是傳統(tǒng)疫苗所達(dá)不到的。它不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫,而且具有能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的細(xì)胞免疫,避免機(jī)體向外界排毒這一優(yōu)點(diǎn)。但由于NIBV具有高頻率變異特點(diǎn)以及目前對其免疫保護(hù)機(jī)制尚不清楚，給高效可靠的疫苗研發(fā)帶來困難。

3.5 核酸疫苗

RNA疫苗與DNA疫苗是核酸疫苗的兩種類型，都是將目的基因與真核表達(dá)質(zhì)粒連接，導(dǎo)入宿主體內(nèi)，然后利用宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白[31]，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答。核酸疫苗的使用安全有效，操作簡便，成分單一，但卻可構(gòu)建多基因或多價疫苗，能同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，可長期在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而使機(jī)體獲得持續(xù)性的免疫力，具有較好的免疫原性。但幼齡動物的免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，機(jī)體有一定概率會把外源基因序列表達(dá)的蛋白質(zhì)誤認(rèn)為機(jī)體產(chǎn)生的正常物質(zhì)，并且錯誤地整合到機(jī)體細(xì)胞基因組中，引起機(jī)體的病變[32]。

3.6 亞單位疫苗

亞單位疫苗是一種誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫,來改善或控制病毒潛伏感染情況的新型疫苗,一般與佐劑配合使用來提高其免疫原性[33]。王月欣等人研制的S1亞單位疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體,尤其與QXL87活疫苗組合免疫時,免疫保護(hù)效果尚佳,為當(dāng)前我國由QX型IBV引起的IB疾病提供更全面的防控[34]。亞單位疫苗與常規(guī)疫苗相比，它可以代表一種安全的改良的活疫苗，各年齡的雞群都可以使用，安全性高，可批量生產(chǎn)，成本低廉；但有文獻(xiàn)表明，該疫苗臨床效果評估并不理想，因此亞單位疫苗未進(jìn)行商品化推廣[35]。

眾所周知，IB控制的復(fù)雜性是由多種因素決定的，NIBV的生物學(xué)特性、IB的流行病學(xué)等問題，都需要不斷地研究和探討。新的預(yù)防戰(zhàn)略必須克服舊的問題，如成本和管理的問題、交叉保護(hù)和變異的問題，必須將其知識和評估視為戰(zhàn)略規(guī)劃的基本必要條件。

4 小結(jié)與展望

近年來，腎型傳氣管炎病毒已成為傳染性支氣管炎病的重要致病原。全球?qū)υ摬《镜难芯恳渤掷m(xù)開展，并不斷涌現(xiàn)出許多有關(guān)NIBV的毒株重組變異、致病機(jī)理以及新制備疫苗的報道，也在一定的程度上增強(qiáng)了疫苗效價，提高對動物的保護(hù)力。我國在NIBV領(lǐng)域中也取得一定的研究成果，但要提高NIBV的防護(hù)效率、降低NIBV的發(fā)病率仍然亟需進(jìn)一步的發(fā)展。其次，病毒在機(jī)體內(nèi)的感染過程、感染機(jī)制及其在機(jī)體中誘發(fā)的固有免疫和適應(yīng)性免疫過程有待進(jìn)一步研究。此外，該病毒具有很強(qiáng)的突變和重組能力，以及不正確的疫苗使用策略和不合理的養(yǎng)殖模式也會造成IB的大范圍流行。因此，深入研究NIBV誘發(fā)IB的特點(diǎn)及其感染所導(dǎo)致的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，可為IB臨床治療措施提供更豐富的理論依據(jù)，也可為研制IB疫苗或抗病毒藥物提供新的思路。