A型塞內卡病毒研究進展

肖佳旭，郭笑然，趙 款，袁萬哲

(河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 07100)

A型塞內卡病毒(Senecavirus A)也稱塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，屬于小RNA病毒科塞內卡病毒屬。SVA最初被認為是細胞培養(yǎng)物中的污染物，推測其來源于豬胰蛋白酶或胎牛血清。2002年美國馬里蘭州蓋瑟斯堡的研究人員首次在人胚胎視網膜細胞系(PER.C6)中分離得到SVA，并命名為SVV-001[1]。SVA因具有溶瘤特性，因此發(fā)現(xiàn)初期多將其應用治療不同類型的腫瘤[2]。加拿大和美國分別在2008年和2012年報道了SVA引發(fā)豬水皰病的病例，這使得人們開始關注塞內卡病的發(fā)生與流行。自2014年以來，SVA在北美國家或地區(qū)的豬群中暴發(fā)，SVA感染新生仔豬的死亡率上升，嚴重影響仔豬的存活率。2015年SVA首次在我國廣東省報道，現(xiàn)已有15個省市報道有SVA的流行。對我國豬群中流行的SVA毒株進行遺傳進化和重組分析發(fā)現(xiàn)中國豬群中流行的毒株在遺傳進化上呈現(xiàn)出復雜多樣性，并且出現(xiàn)了新的基因重組毒株[3]，這些提示我們需要進一步加強對我國SVA的流行監(jiān)測和防控技術儲備。

1 病原學

1.1 基因組結構

SVA為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈20面體對稱結構，直徑約30 nm，基因組全長7.3 kb，包含一個獨立的開放閱讀框(ORF)，兩側分別由5′端非編碼區(qū)(5′untranslated region，5′UTR)和3′端非編碼區(qū)(3′UTR)組成。3′UTR包含有polyA。SVA的ORF被核糖體翻譯成多聚蛋白，包括L前導蛋白、P1結構蛋白、P2和P3非結構蛋白。SVA病毒粒子結構及基因組結構模式圖如圖1所示。多聚蛋白經過初級裂解形成L-P1-2A、2BC和P3共3種前體蛋白。P1被3C蛋白酶進一步水解為VP1、VP0和VP3共3個蛋白，VP0在其后組裝的過程中被水解為VP2和VP4，其中VP0、VP1和VP3作為病毒衣殼的表面結構蛋白具有良好的免疫原性。P2裂解為3個非結構蛋白2A、2B、2C，其中2A蛋白只有9個氨基酸，推測SVA 2A蛋白僅執(zhí)行P1-2A/2BC-P3核糖體跳躍功能；P3裂解為4個非結構蛋白3A、3B、3C和3D[4]，3D蛋白含有其他小RNA病毒保守的氨基酸基序，是RNA依賴的RNA聚合酶的主要組成部分，在病毒復制中起到重要作用。

圖1 SVA病毒粒子結構及基因組結構模式圖[6]Fig.1 Schematic diagram of the structure and genome structure of SVA virion[6]

1.2 培養(yǎng)特性

SVA能夠在豬睪丸細胞(ST)、幼齡倉鼠腎細胞(BHK-21)、豬腎細胞(PK-15、SK)、和人非小細胞肺癌細胞(NCI-H1299)等細胞系上增殖，均能夠產生明顯的細胞病變，主要表現(xiàn)為細胞拉絲最后脫落，因此常利用上述細胞對SVA進行分離與培養(yǎng)[5-6]。

2 流行病學

2.1 SVA分布

2004年，美國印第安納州發(fā)生豬水皰病，排除了外來動物疫病病原的感染，但其病因未明確。2007年加拿大首次報道了SVA感染相關病例，最初猜測可能與當時廣泛流行的豬水皰病有關，但并沒有實質性證據(jù)。2012年美國報道了豬群中有SVA的流行，但追溯發(fā)現(xiàn)早在2010年已有豬群感染，并證實了2007年加拿大報道的SVA陽性病例確實與豬水皰病有關。2014年前，除北美地區(qū)外，其他地區(qū)無SVA的報道，直到 2014 年末，巴西報道了SVA感染病例，而與美國和加拿大不同的是，巴西的SVA感染不僅局限于成年豬，新生仔豬也有感染[7-9]。隨后SVA開始在世界各國廣泛流行，包括中國、泰國、哥倫比亞和越南等，世界各地的SVA同源性高達95.8%～99.9%，但與SVV-001株的同源性較低(93.8%～94.6%)，說明SVA流行過程中在不斷進化[9]。馬雪青等[10]在我國湖北某豬場成功分離出一株SVA，并命名為HBWH/2018，通過對病毒基因組全長序列的遺傳進化分析，HBWH/1/2018株與HN01/2017株親緣關系相似性高達99.4%，而與SVV-001株的同源性僅有91.3%。同時中國動物衛(wèi)生與流行病學中心對SVA進行回顧性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)我國廣東、廣西、云南、貴州、湖南、福建、江西、四川、湖北、河南、山東、新疆、上海、遼寧和黑龍江等多個省(自治區(qū)、直轄市)均有SVA的檢出，表明SVA在我國不同區(qū)域已廣泛流行[6,9]。

2.2 SVA傳播

豬是SVA的自然宿主，主要感染新生仔豬，3日齡以內的仔豬感染后死亡率高達到70%～80%，3日齡～7日齡仔豬感染死亡率為30%左右，隨著日齡的增加，死亡率逐漸降低。SVA感染一年四季均可發(fā)生，春季和秋季多發(fā)，病豬的口鼻分泌物和尿液糞便中均可攜帶病毒，易感動物與病豬直接接觸是主要傳播途徑。臨床研究表明，嚙齒動物和昆蟲可促進病毒傳播，通過RT-qPCR在小鼠的糞便和小腸中檢測到了病毒核酸，并分離到SVA，表明SVA在環(huán)境和小鼠體內都可以存活。小鼠可作為一種天然的貯存體和潛在的傳播媒介[11]。研究表明[12]，在豬感染后60 d的扁桃體中仍能檢測到感染性SVA的存在，但臨床癥狀已消失，證明SVA在豬體內能夠引起持續(xù)感染。還有研究表明持續(xù)性感染的母豬所產的仔豬仍可被SVA感染。Houston E等[13]對美國臨床表現(xiàn)健康的育肥豬和母豬進行血清學檢測，可檢測到SVA IgG抗體存在，表明臨床表現(xiàn)正常的豬存在被SVA感染的可能性。同時Buckley A C等[14]研究比較了早期分離株與當代分離株對豬的致病性，包括SVV001/2002、CAN/2011、HI/2012、IA/2015、NC/2015、SD/2015，結果表明所有接種病毒的豬均檢測到SVA，豬體內含有針對每種病毒的交叉中和抗體，并且檢測到接種當代病毒的豬體內的中和抗體滴度要明顯高于接種早期分離毒株的豬，說明SVA毒力在逐漸加強，應重視對SVA的防控，警惕SVA大流行的暴發(fā)。

通過對美國歷史SVA毒株(2010年之前鑒定)和全球當代SVA毒株(2011年之后鑒定)的全基因組序列遺傳分析的結果表明，兩者之間的遺傳差異為6.32%，并且與歷史SVA毒株相比，在當代SVA分離株的結構蛋白(VP1，VP2和VP3)中觀察到了多個氨基酸突變，表明多年來SVA基因組的進化可能是導致近期該病發(fā)病率上升的主要原因[15]。同時，我國出現(xiàn)的重組SVA毒株，引起了世界專業(yè)領域的關注，基因重組可能是SVA進化的重要機制。

3 致病機理及免疫機制

目前病毒進入細胞以及受體的表達機制尚不清楚。有研究表明，SVA感染機體后，可在表皮細胞、扁桃體樹突狀細胞和淋巴結巨噬細胞中復制增殖。SVV-001衣殼能夠與炭疽毒素受體1(ANTRX1)，也稱為腫瘤內皮標記物8(TEM8)特異性結合，它是SVA附著細胞和脫殼的重要受體。SVA相比其他小RNA病毒與受體的結合方式不同，口蹄疫病毒(FDMV)是利用整聯(lián)蛋白αVβ1、αVβ3、αVβ6、αVβ8作為受體入侵細胞，其VP1蛋白上的氨基酸殘基是單獨附著于受體上發(fā)揮作用；對于脊髓灰質炎病毒(PV)和柯薩奇病毒(CV)來說，受體與病毒衣殼表面結合，在峽谷深處發(fā)生相互作用，導致VP1結構發(fā)生變化；而SVA是VP1和VP2共同參與受體結合，VP1的CD-loop和VP2的GH-loop在與受體相互作用中起關鍵作用[16]。WANG M等[17]為了鑒定SVA的豬細胞受體，在ST細胞中敲除與過表達ANTXR1，表明ANTXR1敲除的細胞喪失SVA感染能力，而過表達ANTXR1則顯著增強了細胞感染，這些結果證實了ANTXR1是SVA的受體之一。SVA 3C蛋白酶通過降解干擾素調節(jié)因子3(IRF3)和干擾素調節(jié)因子7(IRF7)或者作為去泛素化酶來抑制視黃酸誘導基因1(RIG-I)、TANK結合激酶1(TBK1)、腫瘤壞死因子受體相關蛋白3(TRAF3)的表達，進而抑制Ⅰ 型干擾素通路，并且敲除RIG-Ⅰ 可以使SVA復制和表達增加，證實了其在SVA感染過程中可以激活Ⅰ 型IFN信號[18]。

SVA除了抑制宿主固有免疫反應外，還可引起宿主細胞凋亡和自噬以增強自身的復制。例如SVA 2C蛋白僅位于線粒體中，能夠通過激活caspase-3誘導細胞凋亡，而3C蛋白通過其酶活性誘導細胞凋亡[19]。并且2C和3C通過caspase信號傳導途徑誘導RIG-Ⅰ 降解以此調節(jié)宿主的免疫反應[20]。同時，SVA通過激活蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)和轉錄因子6(ATF6)途徑誘導細胞自噬[21]，從而促進復制。

SVA感染動物會出現(xiàn)短期的病毒血癥，但是隨著中和抗體水平的升高，病毒血癥逐漸消失。病毒感染的早期，由于VP1蛋白可引起宿主細胞凋亡，VP4蛋白位于病毒衣殼內表面故均不適用于疫苗生產，而VP2 和VP3蛋白能夠引起宿主產生較高水平的中和抗體，進而使機體抵抗病毒的感染[22]。研究表明，SVA 感染早期T細胞應答顯著增強，有助于機體清除病毒。由此可見，SVA感染可以同時激活機體的B細胞和T細胞應答，產生大量中和抗體，所以免疫系統(tǒng)在保護機體抵抗SVA過程中發(fā)揮著重要作用。

4 診斷

SVA感染的診斷可以通過直接或間接的檢測方法進行，現(xiàn)用于臨床和實驗室的診斷方法主要包括病原學診斷和血清學診斷[23]。

目前已建立多種方法應用于SVA病原體的檢測，包括多種RT-PCR測定方法[24-26]?，F(xiàn)針對SVA 3D聚合酶基因成功開發(fā)了RT-qPCR檢測方法，已作為商品化試劑盒進行售賣。同時根據(jù)VP1蛋白保守區(qū)域，基于Taq-Man技術的RT-qPCR檢測方法也已建立，該方法特異性強，靈敏度高，可實現(xiàn)定量檢測。現(xiàn)階段通過逆轉錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)方法與橫向流動試紙法相結合，肉眼觀察顏色比對即可判定結果，可在現(xiàn)場進行快速鑒別診斷SVA感染[27]。近年已報道了基于逆轉錄微滴數(shù)字聚合酶鏈式反應(RT-ddPCR)的SVA檢測方法，其檢測下限比RT-qPCR低約10倍[28]。

表1 用于SVA檢測的多種直接和間接方法[23]Table 1 Multiple direct and indirect detection methods for SVA detection

血清學診斷方法主要是檢測血清中的抗原或抗體，其中包括間接ELSA、競爭ELISA和病毒中和試驗等方法。血清學方法適于大規(guī)模的流行病學研究或監(jiān)測，同時基于臨床觀察，多個樣本中的PCR檢測和抗體檢測方法相結合的診斷方法比單一診斷方法更有效。目前針對SVA衣殼蛋白VP1、VP2、VP3的ELSA抗體檢測方法均有所報道，其中競爭ELISA應用最為廣泛，現(xiàn)階段也已有商品化檢測試劑盒。近期，Bai M等[29]開發(fā)出使用病毒樣顆粒(VLPs)ELISA檢測血清抗體，VLPs作為ELISA系統(tǒng)的包被抗原比整個病毒顆粒更安全，同時比單體蛋白或多肽表現(xiàn)出更好的敏感性，特異性和免疫原性，這為病毒診斷又提供了有力的技術支撐。

5 疫苗研究進展

疫苗接種仍然是控制和預防傳染病的最有效方法。SVA流行已有數(shù)十年，目前還沒有商品化疫苗，所以研發(fā)高效疫苗顯得尤為重要。

Yang F等[36]對SVA 滅活疫苗進行了相關研究和評價，結果表明 SVA 滅活疫苗免疫動物可產生較高水平的抗體，能夠對豬起到很好地保護作用。最近，Li Y等[37]又對2018年在我國廣東省分離的GD-ZYY02-2018毒株進行遺傳進化分析，結果表明該毒株屬于美國樣毒株，并與中國最近流行的SVA株具有緊密的遺傳關系，同時用滅活的GD-ZYY02-2018株接種的豬可以產生高滴度中和抗體，初步表明該滅活毒株可用作深入研究的候選疫苗株，能夠防止和控制SVA傳播和流行，但仍需進一步研究來驗證SVA滅活疫苗的安全性和保護率等，最重要還是要探究滅活的SVA疫苗是否能保護豬免受異源毒株的攻擊。Sharma B等人[38]參考SVV-001 5′UTR區(qū)域的堿基，通過反向遺傳學技術對SVA SD15-26毒株5′UTR的29、31和32位置處的堿基由C 突變?yōu)門 ，并且為了和野毒株進行區(qū)分，將VP4區(qū)域的SacⅡ酶切位點失活(942位置處由C突變?yōu)锳)，拯救出一株重組的突變病毒(rSVAmSacⅡ)。結果顯示該突變病毒是一株弱毒株，動物經接種后未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，但是該病毒保留了良好的免疫原性，能夠刺激機體誘導產生針對 SVA 的中和抗體，對豬起到了保護作用。突變4個堿基毒力減弱，可能是由于在5′UTR或者P1編碼區(qū)的基因突變引起的關鍵元件構象的改變，例如內部核糖體進入位點(IRES)或順式RNA元件(CRE)等。2020年Mu S等[39]利用原核表達系統(tǒng)表達SVA衣殼蛋白并在體外成功組裝出病毒樣顆粒(VLPs)，免疫動物后VLPs疫苗可同時引起細胞和體液免疫應答，其所誘導中和抗體水平與滅活的SVA疫苗相似。VLPs疫苗與活疫苗和滅活疫苗相比，不含病毒核酸，沒有增殖能力，免疫原性好，安全性高，是目前疫苗的發(fā)展研發(fā)方向。最近，Zhang X等[40]人建立了一種包含CMV和T7啟動子的改良雙啟動子反向遺傳系統(tǒng)，可通過真核或原核RNA聚合酶系統(tǒng)拯救SVA，操作簡便，可在短時間內拯救出SVA，為研究高效SVA疫苗提供了有力的技術支撐。

6 結語與展望

近年來，SVA在多個國家均有暴發(fā)流行的報道，世界各國研究人員在病原學、流行傳播、致病機制、診斷及疫苗的研發(fā)方面取得了巨大的進展。但由于感染SVA后，其臨床癥狀與其他水皰病的臨床癥狀極其相似，所以快速準確診斷鑒定尤為重要。雖然SVA現(xiàn)階段還沒有像口蹄疫那樣帶來毀滅性的危害，但不容忽視的是小RNA病毒具有極強的基因變異能力和重組能力，毒力逐漸加強，很難預測其未來的流行發(fā)展情況。因此，應深入研究SVA的致病性、免疫機制及遺傳進化分析等，持續(xù)關注SVA的演變趨勢，同時研發(fā)高效的疫苗和診斷制劑來做好防控技術儲備。