奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌噬菌體的分離與生物學(xué)特性分析

常軍帥,楊瑞鈺，戴小智，屈勇剛*，梁 晏*，李 娜，趙 玉，王紫陽，張小玉

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

奶牛乳房炎(Cow mastitis)是指奶牛乳腺內(nèi)的各種炎癥反應(yīng)，臨床發(fā)病率為33.41%，是影響我國奶牛業(yè)發(fā)展的三大疾病之一[1]。目前世界上已確定的引發(fā)奶牛乳房炎的病原微生物達(dá)150多種。在我國，由致病性大腸埃希氏菌引發(fā)的奶牛乳房炎占10.60%～36.94%，主要誘發(fā)環(huán)境型乳腺炎，多發(fā)生于干乳早期及泌乳高峰期，可導(dǎo)致乳品質(zhì)和產(chǎn)乳量下降[2-5]。目前缺少用于預(yù)防奶牛乳房炎的有效疫苗，治療仍以抗生素為主，但在生產(chǎn)中長期大規(guī)模使用抗生素導(dǎo)致大腸埃希氏菌耐藥性逐年增加。據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌對(duì)部分β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、多肽類及磺胺類藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性[6-10]。因此，天然抗菌劑的研究已成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

噬菌體(bacteriophage，簡稱phage)在防控細(xì)菌感染方面有巨大的潛力。J Porter等[11]用4種大腸埃希氏菌噬菌體制成雞尾酒制劑，可抑制50%以上的大腸埃希氏菌乳腺炎分離株的生長；牛冬燕[12]將噬菌體雞尾酒制劑用于降低牛的大腸埃希氏菌感染，取得了良好的效果。針對(duì)已獲得的噬菌體，通常采用全基因測(cè)序、基因功能預(yù)測(cè)及進(jìn)化樹分析，從分子水平了解噬菌體特性。本研究以奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌為宿主菌，從養(yǎng)殖場污水中分離純化到一株裂解性肌尾噬菌體，并對(duì)其進(jìn)行了基本的生物學(xué)特性的研究，以期為防治奶牛乳房炎積累材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品 20株奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌(G1～G20)、4株金黃色葡萄球菌(J1～J4)、4株無乳鏈球菌(L1～L4)，均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存；污水采自石河子大學(xué)試驗(yàn)站奶牛圈舍內(nèi)。

1.1.2 主要試劑 LB肉湯培養(yǎng)基，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉和20 g/L 磷鎢酸負(fù)染液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；進(jìn)口銅網(wǎng)碳支持膜，北京中鏡科儀有限公司產(chǎn)品；病毒基因DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 15 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(MultifugeXLR)、全波長酶標(biāo)儀(1530)，美國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；立式恒溫振蕩器(IS-RDV1)，美國精騏有限公司產(chǎn)品；智能電熱恒溫水浴鍋(HH-S3)，常州市信科實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(HT7700)，日立(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置 SM緩沖液：NaCl 2.9 g，20 g/L 明膠2.5 mL，MgSO4·7H2O 1.0 g，1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)25 mL，加蒸餾水定容至500 mL，120℃高壓滅菌20 min，4℃保存。半固體LB肉湯培養(yǎng)基和固體LB肉湯培養(yǎng)基分別是在液體LB肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，加入7 g/L 和15 g/L的瓊脂粉。

1.2.2 菌株準(zhǔn)備 將試驗(yàn)所用菌株接種于液體LB內(nèi)，在37℃恒溫振蕩器中180 r/min培養(yǎng)6 h～8 h至對(duì)數(shù)生長期，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體的分離與純化 將采集的污水先后使用4層滅菌紗布和3層定性濾紙過濾，4℃靜置5 h后用0.22 μm的一次性濾膜濾過除菌。取200 μL濾液和100 μL大腸埃希氏菌G17的菌懸液于3 mL的 2倍營養(yǎng)液體LB中，在37℃恒溫振蕩器中180 r/min 培養(yǎng)4 h后，12 000 r/min離心10 min，取上清液。上清液用液體LB連續(xù)6次10倍倍比稀釋，各取100 μL稀釋好的液體和大腸埃希氏菌G17菌懸液在無菌試管內(nèi)混勻并孵育15 min，然后加入7 mL約45℃的半固體LB，搖勻后倒入平皿，待凝固后倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 噬菌體的純化 用無菌槍頭挑取生長良好的單個(gè)噬菌斑接種于100 μL大腸埃希氏菌G17菌懸液內(nèi)，孵育15 min，加入5 mL液體LB肉湯培養(yǎng)基后置于37℃恒溫振蕩器培養(yǎng)4 h，離心后取上清用液體LB連續(xù)10倍倍比稀釋，將稀釋好的液體與大腸埃希氏菌G17菌懸液各取100 μL混勻吸附后采用雙層瓊脂法培養(yǎng)，此步驟反復(fù)4次以上，直到一個(gè)平板中的噬菌斑形態(tài)大小一致，即可得到純化好的噬菌體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 噬菌體的濃縮及電鏡觀察 參考文獻(xiàn)[13]，采用超速離心法進(jìn)行噬菌體顆粒的濃縮，濃縮液效價(jià)應(yīng)不低于1.0×109PFU/mL 。將銅網(wǎng)(200目)置于噬菌體濃縮液內(nèi)3 min后，用吸水紙吸干銅網(wǎng)上多余水分，再對(duì)銅網(wǎng)用20 g/L 磷鎢酸負(fù)染液染色5 min，吸干水分后，紅外燈照射30 min，送至石河子大學(xué)分析測(cè)試中心電鏡實(shí)驗(yàn)室使用HT7700透射電鏡(TEM)觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.6 噬菌體核酸類型的鑒定 使用病毒基因DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體核酸，分別用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease和噬菌體基因組混勻后在37℃水浴條件下酶解2 h，采用瓊脂(7 g/L )凝膠電泳法對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 噬菌體的生物學(xué)特性研究

1.2.7.1 噬菌體裂解譜的測(cè)定 將純化好的噬菌體液100 μL以1∶1比例分別與20株奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌、4株金黃色葡萄球菌、4株無乳鏈球菌菌懸液混勻孵育15 min后雙層瓊脂法培養(yǎng)10 h，觀察有無噬菌斑。

1.2.7.2 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的測(cè)定 將宿主菌和噬菌體分別培養(yǎng)至濃度約1.0×108CFU/mL和1.0×108PFU/mL，在菌液數(shù)量體積相同的情況下，按MOI分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例加入相應(yīng)數(shù)量體積的噬菌體液，混勻，吸附15 min，加入液體LB使每管的總量相同，在37℃恒溫振蕩器中180 r/min培養(yǎng)4 h，用雙層瓊脂法測(cè)定每個(gè)MOI的效價(jià)，單位為PFU/mL，滴度最高者為最佳MOI。重復(fù)3次，每次2個(gè)平行，取平均值繪制最佳感染復(fù)數(shù)的柱狀圖。

1.2.7.3 一步生長曲線的測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液與噬菌體液按MOI=0.1混勻吸附15 min后加入適量的液體LB，在37℃恒溫振蕩器中180 r/min培養(yǎng)，分別在0、5 、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210 min這19個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)噬菌體滴度。重復(fù)3次，每次2個(gè)平行，取平均值繪制噬菌體感染宿主菌G17的一步生長曲線。

1.2.7.4 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 從50 mL噬菌體液中取100 μL測(cè)其滴度，剩余液體平均分裝于31個(gè)滅菌EP管內(nèi)，分別置于不同溫度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)的恒溫水浴鍋中，各溫度內(nèi)的噬菌體液每隔10 min取出1份測(cè)噬菌體滴度，直到第6次取樣后方可結(jié)束。重復(fù)3次，每次2個(gè)平行，根據(jù)時(shí)間、溫度與噬菌體滴度繪制熱穩(wěn)定曲線圖。

1.2.7.5 pH穩(wěn)定性的測(cè)試 分別取900 μL不同pH(pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)的液體LB培養(yǎng)基，與100 μL噬菌體液混勻置于37℃的恒溫水浴鍋內(nèi)孵育2 h后取出測(cè)定噬菌體滴度，重復(fù)3次，每次2個(gè)平行，根據(jù)pH與噬菌體滴度的不同，繪制曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離鑒定

以奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌G17為宿主菌，從奶牛舍污水中分離出了一株噬菌體，采用雙層瓊脂平板法純化4次以后，噬菌斑大小均勻一致，呈透亮的圓形，直徑2.2 mm～2.4 mm，無暈圈且邊緣整齊，將其命名為vB-EcoC-P17(簡稱P17)。對(duì)其濃縮液負(fù)染后進(jìn)行透射電鏡觀察，顯示噬菌體P17為有尾噬菌體，頭部大小約63.4 nm×65.2 nm,尾部大小約114.4 nm×18.6 nm。

2.2 噬菌體P17的核酸類型鑒定

結(jié)果如圖1所示，瓊脂糖膠凝電泳后，噬菌體P17的核酸長度大于15 kb，酶(DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease)消化處理后電泳結(jié)果顯示，其核酸能被DNase I降解，卻不能被RNase A和Mung Bean Nuclease完全降解，表明噬菌體P17的核酸類型為雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)。

2.3 噬菌體P17的裂解譜鑒定

如表1所示，在20株奶牛乳房炎源大腸埃希氏菌(G1～G20)、4株金黃色葡萄球菌(J1～J4)、4株無乳鏈球菌(L1～L4)中，噬菌體P17可裂解6株大腸埃希氏菌，裂解率為30.00%(6/20)；無裂解金黃色葡萄球菌及無乳鏈球菌的能力。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.噬菌體核酸；2.DNase I；3.RNase A；4.Mung bean nucleaseM.DNA Marker DL 15 000;1.Nucleic acid of phage;2.DNase I;3.RNase A;4.Mung bean nuclease圖1 噬菌體P17核酸類型的鑒定Fig.1 Identification of nucleic acid type phage

表1 噬菌體P17的宿主范圍Table 1 Host range of phage P17

2.4 噬菌體P17最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定

如圖2 所示，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.1時(shí)，噬菌體的效價(jià)最高，即0.1為噬菌體P17的最佳感染復(fù)數(shù)。

圖2 噬菌體P17的MOI測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination of multiplicity of infection of phage 37

2.5 噬菌體P17一步生長曲線的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]中對(duì)噬菌體潛伏期、暴發(fā)期和平穩(wěn)期的評(píng)定方法，確定噬菌體P17的潛伏期約20 min，在20 min～150 min時(shí)噬菌體的滴度持續(xù)上升，暴發(fā)期約130 min，裂解量約為17 PFU/cell(裂解量=裂解暴發(fā)末期噬菌體滴度/初期感染宿主菌濃度)，之后噬菌體數(shù)量基本保持平衡，此時(shí)宿主菌基本全部被裂解，噬菌體滴度不再增長(圖3)。

圖3 噬菌體P17的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage P17

2.6 噬菌體P17熱穩(wěn)定性的測(cè)定

噬菌體P17對(duì)溫度的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，噬菌體的滴度在逐步下降。當(dāng)溫度升至70℃時(shí)，30 min就可使噬菌體P17全部失去活性(圖4)。

圖4 噬菌體P17的耐熱穩(wěn)定性Fig.4 Stability of phage P17 to temperature

2.7 噬菌體P17酸堿耐受力的測(cè)定

由圖5可知，在pH 5.0～11.0時(shí)，噬菌體P17的效價(jià)未發(fā)生大的改變。當(dāng)酸堿度為pH 4.0和pH 12.0時(shí)，噬菌體P17效價(jià)仍大于1.0×106PFU/mL，當(dāng)酸堿度pH ≤3.0或pH ≥13.0時(shí)，噬菌體P17完全失去活性。

圖5 噬菌體P17的pH敏感性Fig.5 Sensitivity of phage P17 to pH

3 討論

噬菌體是廣泛存在于自然界細(xì)菌病毒中，凡是有細(xì)菌存在的地方就會(huì)有相應(yīng)的噬菌體。噬菌體與其宿主菌進(jìn)化關(guān)系密切，開展噬菌體的研究對(duì)了解致病菌的進(jìn)化有一定意義。本研究采用雙層瓊脂平板法，從奶牛圈舍污水中分離到一株大腸埃希氏菌噬菌體，依據(jù)《病毒分類—國際病毒分類委員會(huì)第9次報(bào)告》中對(duì)噬菌體階元的劃分及噬菌體常規(guī)命名方法，將其命名為vB-EcoC-P17，其中vB代表viruses bacteriophage(病毒噬菌體)；Eco代表Escherichiacoli(大腸埃希氏菌)；C代表Caudovirales(尾噬菌體目)[14-15]。對(duì)噬菌體P17進(jìn)行核酸類型鑒定，發(fā)現(xiàn)噬菌體P17的核酸類型為dsDNA，屬于最常見的噬菌體核酸類型。

通過測(cè)試裂解譜發(fā)現(xiàn)，噬菌體P17只能裂解大腸埃希氏菌，對(duì)測(cè)試的大腸埃希氏菌裂解率為30.00%，與幾株牛源、雞源、驢源大腸埃希氏菌噬菌體相對(duì)比，裂解率差異不明顯[16-19]。噬菌體由蛋白質(zhì)與核苷酸構(gòu)成，高溫下蛋白易變性，P17在pH 5.0～11.0和60℃高溫時(shí)均能保持較高活性，耐堿性明顯高于王禮偉等[16]發(fā)現(xiàn)的5株牛源大腸埃希氏菌噬菌體，耐熱性與之相似，說明噬菌體P17對(duì)外界不良環(huán)境有一定的適應(yīng)性，在生產(chǎn)中利于保存及應(yīng)用。與張倩等[17]發(fā)現(xiàn)的牛源大腸埃希氏菌噬菌體XJ2相比，噬菌體P17裂解暴發(fā)期更長，裂解量略強(qiáng)于XJ2，說明此噬菌體的殺菌效果較為理想。噬菌體P17的宿主菌在新疆患有奶牛乳房炎的樣品中分布廣泛，可考慮將其作為預(yù)防奶牛乳房炎噬菌體“雞尾酒”制劑的一部分。

造成奶牛乳腺炎的原因復(fù)雜多樣，由于目前缺少有效的疫苗，在生產(chǎn)實(shí)踐中藥物的不當(dāng)使用已對(duì)食品安全和畜牧生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的影響。在抗生素后時(shí)代的今天，解決菌株耐藥性已成為人類必須攻破的壁壘，裂解性噬菌體是最有可能幫助人們對(duì)付細(xì)菌耐藥性的手段之一。本分離株噬菌體為奶牛乳房炎的噬菌體防治研究與應(yīng)用提供了材料。