液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中的脂溶性維生素

鄭國(guó)建，林毅侃，印杰

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

0 引言

嬰幼兒配方奶粉作為非母乳喂養(yǎng)嬰兒的主要食物來(lái)源，含有其生長(zhǎng)發(fā)育的所有營(yíng)養(yǎng)[1]。脂溶性維生素是嬰幼兒進(jìn)行正常新陳代謝所必須的。如維生素A缺乏可導(dǎo)致兒童失明[2]；維生素D缺乏會(huì)對(duì)骨骼造成影響[3]；維生素E缺乏可導(dǎo)致人體生殖系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)等異常[4]。因此國(guó)家對(duì)嬰幼兒配方奶粉制定了嚴(yán)格的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，如GB 10765-2010[5]，GB 10767-2010[6]。用于測(cè)定脂溶性維生素（維生素A、E、D、K1、）的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有2個(gè)：GB 5009.82-2016[7]、GB5009.158-2016[8]。相應(yīng)的AOAC方 法 有3個(gè)：AOAC 2012.10[9]、AOAC 2016.05[10]、AOAC 2015.09[11]。在使用上述方法時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行差異化處理，且處理過(guò)程復(fù)雜，同時(shí)需使用多臺(tái)套設(shè)備進(jìn)行定性定量分析。本研究將建立一個(gè)同時(shí)檢測(cè)該4種脂溶性維生素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，簡(jiǎn)化樣品處理步驟，提高處理能力，提高檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1、二丁基羥基甲苯（BHT）購(gòu)于Sigma公司；二氯甲烷、甲醇、乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純購(gòu)于Fisher Scientific；正己烷、環(huán)己烷、乙醚、石油醚、甲基叔丁基醚、異辛烷、丙酮為化學(xué)純購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；超純水由Millipore Milli-Q超純水儀生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters XEVO TQXS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有大氣壓化學(xué)電離離子源（APCI），沃特世科技（上海）有限公司；Eppendorf 5804離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；Wiggens Votex 3000渦旋振蕩儀，維根技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters BEH C182.150 mm，1.7μm。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為1%二氯甲烷甲醇溶液，梯度洗脫：0~0.5 min，20%A保持不變；0.5~4 min，20%A線(xiàn)性變化至0%A；4~8.5 min，0%A保持不變；8.51 min變化至20%A，保持2 min；柱溫為40℃；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為2μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電離離子源（APCI），正電離模式；電暈電流：15.0μA；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：400℃；干燥氣流速為800 L/h；錐孔反吹氣流速為150 L/h。離子對(duì)、碰撞能量如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 樣品處理

試樣前處理?xiàng)l件參考了AOAC 2012.10和AOAC 2015.09，并做了適當(dāng)修改：精確稱(chēng)取0.500 g試樣，加0.1 g BHT，加10 mL水，渦旋混勻，加入20 mL甲醇，渦旋20 s后靜置10 min，加入10 mL異辛烷，渦旋20 s，在9 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min。取1 mL上清于40℃水浴中氮吹吹干，用丙酮復(fù)溶后過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用于脂溶性維生素測(cè)定的儀器方法包括正相色譜法[12]、反相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。維生素A和維生素D有紫外吸收基團(tuán)，維生素E既有紫外吸收基團(tuán)又有熒光響應(yīng)，因此可在液相條件下同時(shí)檢測(cè)。但是維生素K1由于無(wú)紫外吸收基團(tuán)，需使用鋅粉還原柱進(jìn)行還原后再進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致這4類(lèi)脂溶性維生素?zé)o法同時(shí)使用液相色譜分析。因此本研究使用通用性更好的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)這4類(lèi)脂溶性維生素的同時(shí)檢測(cè)。

由于采用了直接提取法，所以實(shí)驗(yàn)需考慮嬰幼兒奶粉中維生素A、E、D、K的所有添加形式。參考了AOAC 2012.10（維生素A、E）[9]、AOAC 2016.05（維生素D）[10]、AOAC 2015.09（維生素K1）[11]可知維生素A主要包含維生素A棕櫚酸酯和維生素A醋酸酯；維生素E包括alpha-生育酚和維生素E醋酸酯；以及維生素D3和維生素K1。

由于脂溶性維生素的極性較小，因此當(dāng)采用直接提取法時(shí)，往往使用正相色譜分析，如AOAC 2012.10[9]和AOAC 2015.09[11]中使用了正己烷、甲基叔丁基醚、異辛烷等正相溶劑。而正相體系對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的硬件要求比較高，需要配置專(zhuān)門(mén)的正相脫氣包。且正相體系在質(zhì)譜中應(yīng)用有一定的危險(xiǎn)性。因此本實(shí)驗(yàn)探索使用C18反相色譜進(jìn)行脂溶性維生素的分析。

實(shí)驗(yàn)研究了甲醇、乙腈等溶劑對(duì)維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1在C18色譜柱上的洗脫能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)維生素A棕櫚酸酯的洗脫能力較弱，導(dǎo)致其出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；甲醇的洗脫能力強(qiáng)于乙腈，但還是無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求的10 min內(nèi)完成分析的目標(biāo)。為了加強(qiáng)流動(dòng)相的洗脫能力，實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入少量的二氯甲烷。當(dāng)二氯甲烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1%時(shí)能顯著改善維生素A棕櫚酸酯的出峰時(shí)間，使其變得尖銳。同時(shí)為了保證維生素A、維生素A醋酸酯不要出峰太早，在初始階段加入適當(dāng)?shù)乃黾恿鲃?dòng)相的極性，優(yōu)化后的色譜條件見(jiàn)1.3.1，色譜圖如圖1所示。圖1（a）中，3個(gè)峰依次為維生素A、維生素A醋酸酯和維生素A棕櫚酸酯。

圖1 脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜色譜

在電離方法選擇上，由于脂溶性維生素極性較小，因此更適合使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）對(duì)其進(jìn)行離子化[17]。通過(guò)優(yōu)化APCI的電離參數(shù)，優(yōu)化各脂溶性維生素的選擇離子和碰撞能，最終得到各化合物的特征離子對(duì)和碰撞能，如表1所示。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的提取方法分為直接提取法[8-9,11]和堿溶液皂化提取法[7,10]。由于維生素K1在堿性條件下極不穩(wěn)定[18]，因此為了實(shí)現(xiàn)對(duì)脂溶性維生素的同時(shí)提取，本研究選用直接提取法。

維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1屬于脂溶性維生素，易溶于乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)選用一實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性奶粉樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案為：先用45 g水溶解5 g奶粉樣品，渦旋混勻后，取5 g試樣，加5 mL水，用20 mL甲醇沉淀蛋白，再使用10 mL適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取其中的脂溶性維生素，離心取上層溶劑氮吹吹干后，使用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換后進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)中考察了乙醚∶石油醚（1∶1，體積比）、正己烷∶環(huán)己烷∶乙醚（4∶4∶2，體積比）、正己烷、異辛烷等提取溶劑的提取效果。

當(dāng)使用乙醚∶石油醚（1∶1，體積比）和正己烷∶環(huán)己烷：乙醚（4∶4∶2，體積比）體系時(shí)，離心后水相和有機(jī)相之間存在較厚的乳化層，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果偏低，見(jiàn)表2。當(dāng)使用正己烷、異辛烷時(shí)，離心后水相和有機(jī)相能得到較好的分離，但正己烷的提取效率不及異辛烷，如表2所示。最終選擇異辛烷作為提取溶劑。

表2 提取溶劑的提取效果

由于異辛烷溶液不能直接進(jìn)入反相色譜體系，因此需對(duì)其進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。在選擇復(fù)溶溶劑時(shí)對(duì)比了異丙醇、甲醇、乙腈和丙酮的復(fù)溶效果。當(dāng)使用異丙醇、甲醇和乙腈復(fù)溶時(shí)，不能完全溶解氮吹后的殘?jiān)芤罕容^渾濁。而用丙酮時(shí)能完全溶解殘?jiān)?。因此選擇丙酮作為復(fù)溶溶劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中復(fù)雜的干擾物對(duì)分析物質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)，可用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[19-20]。維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1在奶粉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)比值分別為0.81、0.83、0.78、0.84、0.94、0.76、0.80，均小于1，表明脂溶性維生素的響應(yīng)被樣品中的干擾物質(zhì)輕微抑制。因此為了減輕基質(zhì)效應(yīng)的影響，在配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)應(yīng)選擇空白基質(zhì)溶液進(jìn)行配制。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系和定量限

使用儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，各脂溶性維生素的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.99，見(jiàn)表3。

使用空白基質(zhì)溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)敝粱衔锏姆甯呗源笥?0倍信噪比作為方法的定量限，各脂溶性維生素的定量限在（1~20）μg/100g之間，如表3所示。

表3 線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限

2.5 回收率和精密度

分別在空白奶粉基質(zhì)中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。其中加標(biāo)濃度點(diǎn)的低點(diǎn)為0.5倍左右脂溶性維生素在嬰幼兒奶粉中的平均添加量，中間點(diǎn)為脂溶性維生素在嬰幼兒奶粉中的平均添加量，高點(diǎn)為1.5倍左右的平均添加量。每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次重復(fù)，總體回收率在81.7%~99.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.13%~6.33%之間，結(jié)果如表4所示。

表4 脂溶性維生素在奶粉基質(zhì)中的回收率、精密度μg/100g

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的5批次嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素進(jìn)行檢測(cè),見(jiàn)表5。所測(cè)得值均大于產(chǎn)品標(biāo)簽明示值，說(shuō)明為了防止脂溶性維生素在貨架期內(nèi)降解，生產(chǎn)廠(chǎng)家對(duì)該類(lèi)維生素進(jìn)行了過(guò)量添加以保證產(chǎn)品質(zhì)量。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)嬰幼兒奶粉中沒(méi)有檢測(cè)到維生素A，可能是由于維生素A穩(wěn)定性較差[21-22]。所以企業(yè)主要以維生素A醋酸酯和維生素A棕櫚酸酯的形式添加。

表5 實(shí)際樣品檢測(cè) μg/100g

3 結(jié) 論

本文建立了一種使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的方法。該方法在各自的范圍內(nèi)其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)≥0.99；維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1定量限在1μg/100g~20μg/100g之間；方法在奶粉基質(zhì)中的3個(gè)濃度水平具都有非常好的加標(biāo)回收率和精密度，回收率在81.7%~99.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%~6.33%。該方法適用于嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的測(cè)定。