3株具有抑菌活性的Lactobacillus plantarum在玉米青貯中的應(yīng)用研究

霍瑞，周亭亭，趙景娜，王昊乾，陳永福

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呼和浩特010018)

0 引言

為了提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)，減少有害菌生長(zhǎng)，通常會(huì)在其發(fā)酵過(guò)程添加青貯發(fā)酵劑[1]。乳酸菌種屬、數(shù)量和活性都對(duì)飼料的品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用[2]。同型發(fā)酵乳酸菌可產(chǎn)大量的乳酸，降低pH，抑制細(xì)菌增殖；而異型發(fā)酵乳酸菌能產(chǎn)生乙酸等有機(jī)酸來(lái)抑制真菌的生長(zhǎng)[3]。L.plantarum是同型乳酸菌，具有生長(zhǎng)迅速和產(chǎn)酸能力強(qiáng)的特性，然而關(guān)于玉米青貯中添加L.plantarum的報(bào)道鮮少：Contreras-Govea等[4]研究發(fā)現(xiàn)，L.plantarum能提高全株玉米青貯蛋白質(zhì)含量；L.plantarum與L.buchneri混合添加提高牧草有氧暴露穩(wěn)定性[5]；對(duì)玉米[6]和高粱[7]青貯也有積極作用。

本實(shí)驗(yàn)室以L.plantarum IMAU80162、IMAU10585和IMAU20013為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)單菌和復(fù)合發(fā)酵對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵期、有氧暴露期的活菌數(shù)和發(fā)酵品質(zhì)的影響，為菌株在青貯應(yīng)用提供重要研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和青貯來(lái)源

供試乳酸菌包括L.plantarum IMAU80162、IMAU10585和IMAU20013均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏和提供。

全株玉米于秋季在呼和浩特市郊區(qū)收割，其水分含量為65%~75%，并剪成1.5×1.5×1.5 cm的小塊備用。

1.2 試劑與儀器

MRS固體培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基（酵母菌和霉菌），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，上海致化化學(xué)科技有限公司；活性炭，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑科技有限公司；葡萄糖，天津風(fēng)船；硫酸銅，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硫酸鉀，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；色譜柱BEHC18(2.1×100 mm，1.7μm)，waters Waters公司；可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(VWD)；UV-1700分光光度計(jì)；自動(dòng)化凱氏定氮儀，上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司。

1.3 玉米青貯的調(diào)制

試驗(yàn)設(shè)置5組分別為:①空白對(duì)照組；②添加IMAU80162組；③添加IMAU10585組；④添加IMAU20013組；⑤IMAU80162、IMAU10585和IMAU20013等比例添加組。將L.plantarum以1×105cfu/g的接種總量噴灑至全株玉米小塊，混合均勻后以每袋200 g分裝在錫箔紙袋并進(jìn)行真空塑封，25℃發(fā)酵貯藏。貯藏0、3、42天時(shí)隨機(jī)取3袋樣品測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)，第42d將剩余樣品進(jìn)行有氧暴露，并置于25℃培養(yǎng)箱，檢測(cè)青貯溫度變化，升高2℃時(shí)取樣測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.4 微生物指標(biāo)的測(cè)定

將20 g玉米青貯加到含有80 g無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，搖床150 rmp/min搖動(dòng)30 min，取0.5 mL上清液，稀釋到適合的梯度對(duì)乳酸菌、酵母菌，霉菌和大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)，對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基分別為MRS固體培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基（酵母菌和霉菌）和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基。之后將樣品放置到攪拌機(jī)中，高速攪拌30 s，然后4層紗布過(guò)濾得勻漿，留樣備用。

1.5 發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定方法

1.5.1 干物質(zhì)

本實(shí)驗(yàn)采用的是微波爐法[9]。稱(chēng)取10 g玉米青貯放置于微波爐的塑料盤(pán)中，在高功率（600 W）條件下加熱1.5 min，稱(chēng)重，重復(fù)上述操作直至前后兩次稱(chēng)重相差小于0.01 g。

1.5.2 pH值及有機(jī)酸

取1.3中青貯勻漿10 mL，測(cè)定其pH值。之后將勻漿12 000 g離心15 min取上清液，過(guò)0.22μ濾膜，上機(jī)測(cè)試。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取乳酸、乙酸對(duì)照品各3.0000 g，先在燒杯中溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL棕色容量瓶中，加超純水定量至刻度，分別得到30 mg/mL的儲(chǔ)備液。根據(jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

HPLC分析條件[10]：色譜柱:BEH C18(2.1×100 mm，1.7μm.；檢測(cè)器:可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(VWD)；流速：0.4 mL/min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：4μL；流動(dòng)相A：水（millipore）+0.1%甲酸，流動(dòng)相B：乙腈（fisher，optimicalLCMS級(jí)別，F(xiàn)isher公司）+0.1%甲酸；梯度洗脫（B%）：0 min(20%)-2 min(50%)-2.1 min(95%)-3 min(95%)-3.1 min(20%)-5 min(20%)。

1.5.3 可溶性碳水化合物

本實(shí)驗(yàn)采用的是蒽酮硫酸法[11]。取含有4 mL的蒽酮溶液的試管（15×2.5 cm），冰上預(yù)冷10 min，將經(jīng)活性炭脫色后的提取液1 mL快速加到上述試管中，振蕩10 s，再放置到冰上；所有反應(yīng)液加完后，將反應(yīng)試管置于沸水浴10 min，隨后在冰上靜置5 min；分光光度計(jì)（UV-1700）測(cè)定分光光度值，配制濃度分別為0.1、0.075、0.05、0.025和0 mg/mL的葡萄糖溶液重復(fù)上述操作，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 粗蛋白含量及氨態(tài)氮

準(zhǔn)確稱(chēng)取玉米青貯1±0.0002 g，送至蒸餾瓶底部，加入0.2 g硫酸銅，3.5 g硫酸鉀，10 mL濃硫酸和2顆玻璃珠，放入消化爐，240℃加熱60 min之后，升溫到400℃繼續(xù)加熱至液體呈透明藍(lán)綠色，最后用自動(dòng)化凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾、滴定[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0和Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全株玉米原料微生物及品質(zhì)檢測(cè)

青貯前檢測(cè)原料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌、大腸桿菌、干物質(zhì)、粗蛋白、氨態(tài)氮、可溶性碳水化合物、pH值和有機(jī)酸。結(jié)果見(jiàn)表1，玉米原料微生物菌群豐富，可溶性碳水化合物和粗蛋白的含量適中，pH值為4.85，適合各種有益、有害菌的生長(zhǎng)。

表1 青貯前全株玉米的化學(xué)成分

2.2 添加乳酸菌對(duì)青貯發(fā)酵期的影響

由表2可以看出，青貯第3天，乳酸菌的數(shù)量急劇增長(zhǎng)。其中，IMAU10585和混菌處理組的乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到(4.05±0.31)×108cfu/g和(3.98±0.86)×108cfu/g，明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。此后，乳酸菌數(shù)量逐漸減少。酵母菌、大腸桿菌的數(shù)量在此時(shí)未檢出，而所有處理組的霉菌數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。

乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，代謝旺盛，產(chǎn)生了大量的乳酸，所有處理組乳酸含量均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)。隨著青貯的發(fā)酵，乳酸含量逐漸積累增多。IMAU80162與對(duì)照組乙酸含量差異不顯著(P＞0.05)，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。青貯飼料pH值的變化主要與有機(jī)酸的變化相關(guān)。青貯第3天時(shí)所有組的pH值均降到4.0以下，除IMAU80162外，其他組的pH值均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。3 d之后pH值一直保持相對(duì)穩(wěn)定，IMAU10585組pH值下降最快、最低。

第42天，對(duì)照組、IMAU80162組、混菌處理組的乳酸菌活菌數(shù)比IMAU10585和IMAU20013組高，達(dá)到105數(shù)量級(jí)，如表2所示。IMAU10585、IMAU20013和混菌組的酵母菌活菌數(shù)顯著高于(P＜0.05)對(duì)照組，這可能是由于耐酸酵母菌在低pH和高酸度的情況下生長(zhǎng)繁殖造成的。發(fā)酵后期仍未檢出大腸桿菌和霉菌，證明乳酸菌的生長(zhǎng)代謝形成的高酸環(huán)境及其產(chǎn)物能長(zhǎng)時(shí)間抑制有害菌的生長(zhǎng)。

表2 添加乳酸菌對(duì)玉米青貯發(fā)酵參數(shù)及微生物組成的影響

整個(gè)青貯期間，干物質(zhì)的變化都不大，可能是由于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程在密封的鋁箔袋中進(jìn)行，水分不散失或散失較少。類(lèi)似地，粗蛋白的變化在各組間不存在顯著性差異(P＞0.05)，整體含量略有增長(zhǎng)，但反應(yīng)蛋白質(zhì)質(zhì)量水平的氨態(tài)氮指標(biāo)數(shù)值出現(xiàn)了差異性(P＜0.05)，說(shuō)明L.plantarum的添加對(duì)蛋白質(zhì)起到了一定的保護(hù)作用?？扇苄蕴妓衔镒鳛槿樗峋a(chǎn)乳酸的原料，其含量到青貯第3天已經(jīng)迅速下降，之后緩慢較少，其消耗的程度與乳酸菌活菌數(shù)的變化是一致的。

2.3 添加乳酸菌對(duì)青貯有氧暴露期的影響

如表3所示，有氧暴露期間，乳酸菌數(shù)減少，混菌處理組，IMAU800162組的活菌數(shù)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。接觸空氣后，各實(shí)驗(yàn)組酵母菌急劇增長(zhǎng)，對(duì)照組、IMAU800162組、混菌處理組差異不顯著(P＞0.05)，未檢測(cè)出大腸桿菌和霉菌。

表3 添加乳酸菌對(duì)有氧暴露期的玉米青貯發(fā)酵參數(shù)及微生物組成的影響

各組pH值均有所升高，但各組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。乳酸含量相較于發(fā)酵前期出現(xiàn)了一定程度的下降，但對(duì)照組的乳酸含量、乙酸含量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。干物質(zhì)、可溶性碳水化合物、粗蛋白的含量呈不同水平地降低，但I(xiàn)MAU20013組干物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量明顯高于其它組(P＜0.05)，分別達(dá)到32.95%和4.23 mg/mL。各組氨態(tài)氮比例增加，其中，除IMAU10585組外，其他處理組氨態(tài)氮比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

在作物表面附生著大量的微生物，一部分是對(duì)青貯有利的，比如乳酸菌；另外一部分是有害的，比如腐敗菌、酵母菌和霉菌等[13]。實(shí)驗(yàn)中的全株玉米干物質(zhì)、粗蛋白含量、可溶性碳水化合物適中，pH值適合各類(lèi)微生物生長(zhǎng)繁殖，這些可能與玉米的收割季節(jié)以及種類(lèi)有關(guān)[14]。

全株玉米是包括玉米果實(shí)的完整株玉米，是青貯的主要原材料，含糖量較高，有利于發(fā)酵的進(jìn)行。在青貯初期，添加乳酸菌的各處理組乳酸菌總數(shù)顯著高于對(duì)照組，而酵母菌、霉菌和大腸桿菌的數(shù)量均顯著地降低了，各處理組的乳酸含量均顯著高于對(duì)照組，pH值也迅速降低至4.00以下，說(shuō)明添加的各乳酸菌均能很好的定植和繁殖，并抑制有害菌的增殖。

在青貯后期，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的所有樣品仍保持著低pH值環(huán)境，未檢出大腸桿菌和霉菌。但在乳酸菌、酵母菌總數(shù)方面，對(duì)照組與某些處理組差異不顯著。Hu[15]和Pedroso[16]的實(shí)驗(yàn)中同樣出現(xiàn)了類(lèi)似情況。這可能因?yàn)樘砑尤樗峋目倲?shù)為105cfu/g，僅為青貯前全株玉米乳酸菌數(shù)的1/50，隨著青貯原有乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，添加的乳酸菌在后期并不占優(yōu)勢(shì)。有學(xué)者指出，添加乳酸菌達(dá)到原料乳酸菌的2~10倍才能使添加的菌群在青貯中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位[17-18]。

青貯研究中，乳酸與乙酸含量的比值間接反映了青貯中同型和異型發(fā)酵乳酸菌的比重[1]。如圖1所示，5組青貯飼料中，對(duì)照組和IMAU80162的比值相對(duì)較小，也就是能產(chǎn)生乙酸的乙酸菌、異型發(fā)酵乳酸菌相對(duì)較多。乙酸能對(duì)酵母菌產(chǎn)生一定抑制作用[19]，這與本實(shí)驗(yàn)酵母數(shù)變化是一致的。雖然酵母菌活動(dòng)強(qiáng)烈不利于青貯飼料的發(fā)酵，但有研究[20]表明酵母菌能夠提高奶牛干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量以及消化粗蛋白和酸性洗滌纖維的能力，同時(shí)生成乙醇等，使青貯飼料具有酒香味。

圖1 乳酸與乙酸在青貯期間的含量比值變化

青貯過(guò)程中青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的變化情況，是指包括干物質(zhì)、可溶性碳水化合物和粗蛋白等的變化。干物質(zhì)代表著飼料的潛在可利用潛能，研究指出要獲得較好的青貯品質(zhì)需要干物質(zhì)濃度大于200 g/kg，干物質(zhì)含量高(300~350 g/kg)的青貯玉米可以在一定程度上控制發(fā)酵造成的損失，另外牛對(duì)干物質(zhì)含量低于300 g/kg的青貯玉米的消化吸收率會(huì)大量減少[21]。本實(shí)驗(yàn)的各組間干物質(zhì)含量變化并不顯著，且隨青貯時(shí)間的變化規(guī)律也不明顯。

可溶性碳水化合物和粗蛋白含量也是衡量谷物類(lèi)青貯品質(zhì)的兩大重要指標(biāo)[22]。可溶性碳水化合物是乳酸菌形成乳酸的原料，只有足夠數(shù)量的可溶性碳水化合物，才有可能使乳酸菌生成足夠的乳酸，造成低pH環(huán)境，抑制或殺死有害微生物，達(dá)到形成和保存青貯飼料的目的[13]。本實(shí)驗(yàn)中，雖然IMAU100585和IMAU20013組相較于其他組可溶性碳水化合物含量明顯高，但可能與這兩組乳酸菌總數(shù)偏少有關(guān)如圖2所示，而混菌處理組在保證乳酸菌數(shù)量的基礎(chǔ)上，可溶性碳水化合物含量仍然高于對(duì)照組和IMAU80162處理組，說(shuō)明乳酸菌的添加一定程度上可以提高青貯飼料的品質(zhì)。

圖2 青貯期間飼料中葡萄糖含量變化

另外，評(píng)價(jià)玉米飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)還需看其蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)品質(zhì)。在青貯過(guò)程中蛋白質(zhì)會(huì)降解成非蛋白氮，造成氨態(tài)氮的比例增加[23]。該實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)含量和氨態(tài)氮比例在青貯期并沒(méi)有顯著變化，在有氧暴露期，由圖3可見(jiàn)，IMAU80162組、混菌組的氨態(tài)氮明顯低于其他組，說(shuō)明乳酸菌的添加可以在一定程度上保護(hù)蛋白質(zhì)不被消耗。

圖3 玉米青貯中氨態(tài)氮的變化情況

4 結(jié)論

本研究中L.plantarum的添加有助于增加飼料厭氧發(fā)酵和有氧暴露后乳酸菌的數(shù)量，降低pH，減少大腸桿菌、酵母菌和霉菌等有害菌的數(shù)量，提高青貯飼料品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。其中單株IMAU80162抑制霉菌和酵母菌的效果最為顯著，它與IMAU100585，IMAU20013混合使用能有效維持青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。但是，不同的L.plantarum及配比能否改善青貯飼料的微生物菌群及營(yíng)養(yǎng)成分，還需要進(jìn)一步的探究。