基于基因分析的產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及其體外抗氧化研究

呂青遙，雷霜江，包善思，陳文文，陳怡均，焦士蓉

（西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039）

0 引言

乳酸菌(LAB，lactic acid bacteria)是一類通過發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的無芽孢革蘭氏陽性菌的總稱，至少含有23個(gè)菌屬，共200余種[1]。乳酸菌作為一種重要的益生菌，可以凈化腸內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)人體胃腸道健康及微生態(tài)環(huán)境平衡[2]。乳桿菌屬、雙歧桿菌屬的某些菌株被證實(shí)具有提高免疫力、降血壓、抗氧化、改善腸道菌群等生理功能[3-4]。乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是指乳酸菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類化合物[5]。LAB EPS一般包括釋放到培養(yǎng)基中的黏液多糖（slime polysaccharide，SPS）和附著在細(xì)胞壁的莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）[6]。LAB產(chǎn)生的EPS按組成可分為由同一種單糖組成的同多糖 和由兩種或兩種以上單糖組成的雜多糖[7]。在生理功能上，胞外多糖具有良好的抗腫瘤[8-9]、增強(qiáng)免疫抵抗力[10-11]和抗氧化[12]等活性。在物化特性上，EPS能改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)地、組織狀態(tài)、風(fēng)味和感官[13]，對(duì)豆制品的流變性、乳化性、黏著性都有顯著影響，極大地提高了其質(zhì)構(gòu)、凝膠和流變性能[14]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的15株乳酸菌為篩選源，測(cè)定他們的產(chǎn)胞外多糖能力，并對(duì)其所產(chǎn)胞外多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，綜合兩方面選出優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行全基因組序列分析，為進(jìn)一步高通量篩選高產(chǎn)EPS菌株和構(gòu)建基因工程菌提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用菌株是從以四川傳統(tǒng)泡菜、魚腸道、微生物藥劑為篩選源，選出降膽固醇能力＞30%且具有耐酸耐膽鹽能力的15株乳酸菌。

核酸染料，生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，成都福際生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；WFJ7200分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Easycycle Gradient 96梯度PCR儀、BDA Box 2凝膠成像系統(tǒng)，Analytikjena；DYY-8C雙定時(shí)電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫（-80）1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15~20 g，滅菌后使用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 乳酸菌胞外多糖的提取

參考李儀琳等的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動(dòng)[15]。將供試乳酸菌活化后接種到胞外多糖MRS液體篩選培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，取10 mL培養(yǎng)液于試管中，加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），震蕩30 min后，4 000 r/min離心15 min，收集上層水相溶液，重復(fù)以上操作至兩相之間無蛋白質(zhì)層為止。隨后加入3倍體積的冰凍無水乙醇，放置在4℃冰箱中冷藏。第2天取出，最終可以觀測(cè)到多糖呈乳白色絮狀沉淀析出，再于4℃、6 000 g下離心30 min，用10 mL蒸餾水溶解沉淀，可得胞外多糖提取液，胞外多糖粗提液冷凍干燥的胞外粗多糖。

1.4.2 胞外多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定，參照陶靜的做法[16]。EPS質(zhì)量濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和稀釋倍數(shù)換算出。

1.4.3 EPS對(duì)DPPH自由基的清除作用

參考丁武榮等的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動(dòng)，用去離子水和DPPH溶液作為對(duì)照[17]。用樣品和無水乙醇作為空白。測(cè)定517 nm處的吸光度，每組至少3個(gè)重復(fù)。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.5673X+9.0774，R2=0.9946。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當(dāng)量計(jì)（mg/g）。

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100

式中：A樣品為樣品溶液與DPPH反應(yīng)的吸光度；A空白為無水乙醇代替DPPH的吸光度；A對(duì)照為無水乙醇代替樣品溶液及蒸餾水的吸光度。

1.4.4 EPS對(duì)ABTS自由基的清除作用

參考劉城移等的實(shí)驗(yàn)方法[18]。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.6058X-0.8838，R2=0.9966。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當(dāng)量計(jì)（mg/g）。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100

式中，A樣品為不同濃度的樣品與ABTS+工作液反應(yīng)的吸光度；A對(duì)照為去離子水代替ABTS+工作液反應(yīng)的吸光度；A空白為去離子水代替樣品組的吸光度。

1.4.5 EPS的ORAC實(shí)驗(yàn)

參考Mu G等的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動(dòng)[19]，向96孔板各孔加入20μL不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液（或樣品），以緩沖液代替樣品或標(biāo)品為陽性對(duì)照（+APPH），以及隨后每孔加入4.0 nmol/L 20μL FL熒光試劑，37℃孵育20 min。測(cè)定時(shí)加入140μL 12.8 mmol/LAAPH溶液啟動(dòng)反應(yīng)，用緩沖液替代APPH為陰性對(duì)照（-APPH）將96孔板置于預(yù)熱至37℃酶標(biāo)儀中5 min。

以激發(fā)波長(485±20)nm,發(fā)射波長(530±20)nm進(jìn)行連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度,測(cè)定時(shí)間設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止，約60次循環(huán)(2 h)。

試驗(yàn)所得的各微孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)與其初始時(shí)間的熒光強(qiáng)度相比,折算成相對(duì)熒光強(qiáng)度f，以相對(duì)熒光強(qiáng)度采用近似積分法計(jì)算熒光衰退曲線下面積(AUC)。

AUC=0.5×[2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn]×△t,其中fn標(biāo)示第n個(gè)測(cè)定點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度,△t標(biāo)示相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間間隔(即2 min),則上述公式可簡化為:AUC=2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn。

ORAC值=[(AUC樣品-AUC空白)/(AUCTrolox-AUC空白)]×(Trolox濃度(μmol/L)/樣品濃度(g/L))

式中：AUC樣品為樣品作用下的各微孔熒光衰退曲線下面積；AUCTrolox為水溶性維生素E作用下的熒光衰退曲線下面積；AUC空白為僅有AAPH作用下的熒光衰退曲線下面積；Trolox濃度為標(biāo)準(zhǔn)品水溶性維生素E的濃度，μmol/L。

每組實(shí)驗(yàn)至少3個(gè)重復(fù)，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.6741X+13.284，R2=0.9971。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當(dāng)量計(jì)（mg/g）。

1.4.6 EPS的FRAP實(shí)驗(yàn)

參考梅邢等的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動(dòng)[20]，將300 mmol/L，pH=3.6的醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化鐵溶液以10∶1∶1配置成FRAP工作液，在96孔板中加入50μL 1g/L的胞外粗多糖水溶液和150μL FRAP工作液為樣品組，以蒸餾水代替樣品為對(duì)照組，室溫下放置20 min，在593 nm處測(cè)吸光度，每組至少3個(gè)重復(fù)。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0054X+0.127，R2=0.9984。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液的EPS含量，以每g提取物中Trolox當(dāng)量計(jì)（mg/g）。

1.4.7 生理生化試驗(yàn)

對(duì)乳酸菌進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、pH=4.0、pH=9.0、15℃、45℃生長試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、v-p乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)。參考蒲博等的實(shí)驗(yàn)方法并做適量改動(dòng)[21]。

1.4.8 16S rRNA基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

參考Zhang等人方法[22]，綜合胞外多糖產(chǎn)率及其抗氧化活性，選出產(chǎn)EPS能力較高，EPS抗氧化活性強(qiáng)的11株乳酸菌進(jìn)行鑒定。鑒定過程主要包括細(xì)菌基因組DNA的提取，PCR的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，序列的測(cè)定與回收。得到序列結(jié)果后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.9 R5全基因組測(cè)序分析

將活化后的R5菌體送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010分析處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次試驗(yàn)所得，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，并繪制圖表；采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 乳酸菌EPS產(chǎn)量

乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的結(jié)果，如表1所示。

表1 乳酸菌胞外粗多糖產(chǎn)量(±s,n=3)

表1 乳酸菌胞外粗多糖產(chǎn)量(±s,n=3)

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15株乳酸菌均有一定的產(chǎn)胞外多糖能力，胞外多糖產(chǎn)量在374.19~710.73 mg/L之間，產(chǎn)量低于400 mg/L的有1株，400~500 mg/L的有3株，500~600 mg/L的有6株，大于600 mg/L的有5株，分別為R4、R5、R27、R28、R40，其中R38產(chǎn)量最低為374.19±9.30 mg/L，R40產(chǎn)量產(chǎn)量最高達(dá)710.73±23.25 mg/L。

2.2 乳酸菌EPS抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌EPS的抗氧化結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌株胞外多糖對(duì)DPPH自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），其中R4清除DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到19.89±0.54 mg/g Trolox當(dāng)量。不同菌株胞外多糖對(duì)ABTS自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），其中R47清除ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到190.77±9.53 mg/g Trolox當(dāng)量。不同菌株胞外多糖ORAC氧化自由基吸收能力差異顯著（P＜0.05），其中R39氧化自由基吸收能力最強(qiáng)，達(dá)到101.40±4.20 mg/g Trolox當(dāng)量。不同菌株胞外多糖FRAP鐵還原能力差異顯著（P＜0.05），其中R5鐵還原能力最強(qiáng)，達(dá)到7.65±0.64 mg/g Trolox當(dāng)量。從4種不同抗氧化實(shí)驗(yàn)中可以看出，同一種菌株胞外多糖在不同的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，差異顯著（P＜0.05），乳酸菌胞外多糖的抗氧化在幾組實(shí)驗(yàn)中ABTS體系＞ORAC體系＞DPPH體系＞FRAP體系，表明乳酸菌胞外多糖對(duì)于ABTS自由基的清除率最高，而鐵原子還原能力較低。

表2 乳酸菌抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x-±s,n=3)

（續(xù)表2）

2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合生理生化試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，我們可對(duì)15株乳酸菌的大致分類做如下判斷，其中C28、C60、J3、R5、R8、R10、R24、R27、R28、R38、R39、R43、R47屬于乳桿菌屬，R4、R40屬于腸球菌屬。

表3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 16S rRNA序列法分析鑒定

綜合胞外多糖產(chǎn)率及其抗氧化活性，選出產(chǎn)EPS能力較高，EPS抗氧化活性強(qiáng)的11株乳酸菌進(jìn)行16S rRNA序列法分析測(cè)定，凝膠成像結(jié)果如圖1所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1可知，11株菌的16S rRNA PCR產(chǎn)物長度為1.5Kbp，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線分析，結(jié)果表明，9株菌為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosu 2717），R4、R40兩株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium 6583），基因測(cè)序結(jié)果與生理生化試驗(yàn)結(jié)果吻合，11株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.5 鼠李糖乳桿菌R5基因組中產(chǎn)EPS基因簇分析

全面綜合比較后，因R5產(chǎn)多糖量和抗氧化活性均較高，所以選R5進(jìn)行后續(xù)深入研究。通過將鼠李糖乳桿菌R5基因序列與NCBI上與產(chǎn)EPS有關(guān)的相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)R5基因序列中與EPS產(chǎn)生有關(guān)的基因都在Scaffold2上，比對(duì)結(jié)果如表4所示。從表4中看出，Identity＞98%，表明R5基因序列與相關(guān)基因序列一致性高。R5與相關(guān)基因Evalue值為0，可信。因此可以說明鼠李糖乳桿菌R5基因中有19個(gè)與EPS產(chǎn)生相關(guān)的基因，產(chǎn)EPS相關(guān)基因在R5基因序列中的查詢情況見表5。在這些產(chǎn)EPS相關(guān)基因中，gene0524、0531、0533、0534、0536是編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因的存在與EPS重復(fù)單元結(jié)構(gòu)之間存在高度相關(guān)，可用于今后篩選新的鼠李糖菌株[22-23]通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，R5所產(chǎn)的多糖為莢膜類多糖。

表4 R5基因序列比對(duì)結(jié)果

表5 產(chǎn)EPS相關(guān)基因在R5基因組中的查詢結(jié)果

（續(xù)表5）

圖3 R5基因序列中產(chǎn)EPS相關(guān)基因組圖譜

3 結(jié)論

15株乳酸菌均有一定的產(chǎn)胞外多糖能力，胞外多糖產(chǎn)量在374.19~710.73 mg/L之間。綜合產(chǎn)EPS能力和所產(chǎn)EPS的抗氧化能力結(jié)果，R5 EPS產(chǎn)量較高678.01±17.44 mg/L，且R5的EPS在幾種抗氧化體系中能力都較強(qiáng)，其中在DPPH體系中為18.58±0.65 mg/g Trolox當(dāng)量，在ABTS體系中為163.78±7.64 mg/g Trolox當(dāng)量，在ORAC體系中為68.38±7.19 mg/g Trolox當(dāng)量，在FRAP體系中為7.65±0.64 mg/g Trolox當(dāng)量。因此選擇R5進(jìn)行后序?qū)嶒?yàn)。

對(duì)鼠李糖乳桿菌R5進(jìn)行全基因組測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)的總堿基數(shù)為1164790444（bp），對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到質(zhì)控后的總堿基數(shù)為1143095840（bp）。通過將鼠李糖乳桿菌R5基因序列與NCBI上與產(chǎn)EPS有關(guān)的相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)得知，其所產(chǎn)多糖為莢膜類多糖。在鼠李糖乳桿菌R5基因序列中，找到了19個(gè)產(chǎn)EPS相關(guān)基因。為進(jìn)一步高通量篩選高產(chǎn)EPS菌株和構(gòu)建基因工程菌提供前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。