體外消化前后EGCG 對腸道菌群組成的影響

李浩楠，雷嗣超，辜 煊，謝辰陽，李 杰，楊 芳,2,3，張 美

（1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205；2.武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點(diǎn)實驗室，湖北武漢 430205；3.磷資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，湖北武漢 430073）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是從中國綠茶中提取的一種成份，是綠茶茶多酚中含量最豐富的兒茶素類單體物質(zhì)。它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛質(zhì)量的9%～13%。因為具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，EGCG 具有非常強(qiáng)的抗氧化活性，抗氧化活性至少是維生素C 的100 多倍，是維生素E 的25 倍，能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA 受損害，這種損害與癌癥、心臟疾病和其他重大疾病有關(guān)。EGCG 具有多種生理功能，如抗炎、抗癌、抗氧化等[1-2]，對生物體起到促生長、緩解氧化應(yīng)激和炎癥損傷等作用[3]，在食品工業(yè)上可作抗氧、抑菌、保鮮、祛臭劑;在日化產(chǎn)品上作特殊功能的保質(zhì)劑、護(hù)膚劑。

近年來的研究表明，EGCG 對肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌以及宮頸癌等均有顯著的抑制效果，且不良反應(yīng)較小[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)自噬活性、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移、抗血管形成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等方面發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[5-7]。然而，由于胃腸消化過程對EGCG 結(jié)構(gòu)的影響導(dǎo)致其功能活性的變化，其生物利用率較低。另一方面，腸道是機(jī)體內(nèi)最大的微生態(tài)系統(tǒng)，70%以上的免疫功能都與其有關(guān)，成為保護(hù)機(jī)體健康的天然屏障[8]。動物腸道內(nèi)菌群的數(shù)量、組成及相互作用直接影響機(jī)體的健康[9]。因此，腸道菌群的變化可以用于分析功能因子在體內(nèi)的活性變化。本文模擬體外消化前后的EGCG，研究其對大鼠腸道菌群的影響，探討了EGCG 在消化過程中的變化情況及其對腸道菌群的影響，為提高EGCG 的生物利用率及生物活性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

EGCG，杭州禾田生物技術(shù)有限公司；厭氧培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS、DNA 聚合酶，北京索萊寶科技有限公司；DNA 抽提試劑盒，Omega 公司；甲醇（色譜純）、乙醇（色譜純），德國默克公司；Sprague Dawley（SD）大鼠糞便，武漢金開瑞生物工程有限公司；胃蛋白酶、鹽酸、胰蛋白酶、膽鹽、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺，SW-CJ-1D 型，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，311 型，Thermo 公司；PCR 儀，9700 型，Thermo 公司；酶標(biāo)儀，AMR-100 型，杭州奧盛儀器有限公司；基因測序儀，MiSeq 型，美國Illumina 公司。

1.2 方法

1.2.1 EGCG 和EGCG-GIT 的制備

EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取400 mg EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解后定容于100 mL 容量瓶中，即得4 mg/mL 的EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

EGCG-GIT 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取0.5 mL ECCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4 mL 活性蛋白酶液（0.9 mol/L NaCl 配置4 mg/mL 胃蛋白酶溶液，0.1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至2.1），在250 r/min、7 ℃的搖床中消化2 h。然后加入3.6 mL 活性胰液-膽汁混合物（225 mg 胰蛋白酶、225 mg 膽鹽溶于90 mL NaCl 溶液，用0.1 mol/mL NaOH 調(diào)pH 至7.0～7.2，用NaCl 定容于100 mL 容量瓶），用0.1 mol/L 碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 在7.0～7.5，在100 r/min、37 ℃的搖床中振蕩2 h。而后在4 000 r/min 的離心機(jī)中離心10 min，取上清液定容至10 mL，記作EGCG-GIT。

1.2.2 腸道菌群的制備

參考黃小霞等[10]的方法，稍作修改。

將采集的SD 大鼠糞便解凍，在無菌操作條件下，糞便與生理鹽水按1∶4（g/mL）比例混合均勻，使用渦旋儀蝸旋2 min，用4 層無菌紗布過濾，濾液即為腸道菌液。按1∶9 的比例將腸道菌液加入BBL 瓊脂厭氧培養(yǎng)基中，混勻，液體石蠟液封后置于干燥器（含厭氧產(chǎn)氣包）中37 ℃培養(yǎng)24 h，得培養(yǎng)液，以3%比例進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，得到腸道菌懸液。

1.2.3 體外發(fā)酵

準(zhǔn)確量取9 mL 由1.2.2 制備得到的腸道菌懸液，加入1 mL EGCG，混合均勻后，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h；EGCG-GIT 也作相同處理，每組樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)實驗?？瞻讓φ战M把EGCG 換成生理鹽水，其他條件不變，記作CK。

1.2.4 菌群構(gòu)成分析

腸道微生物總DNA 提?。翰捎媚c道微生物DNA 試劑盒提取DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[11]。

PCR 擴(kuò)增：對目標(biāo)片段16S rDNA V4 區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增（重復(fù)3 次），以第一個引物中的barcode 作為特異引物擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物。將PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收目標(biāo)片段，即為PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物[12]。

熒光定量：采用QuantiFluor-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合[13]。

文庫構(gòu)建與測序：使用MiSeq 測序儀和MiSeq V3 試劑盒對文庫中的片段進(jìn)行2×300 bp 的雙端測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Illumina MiSeq 平臺測序數(shù)據(jù)分析。高通量測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾、去嵌合體，得到的有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行分類操作單元的劃分以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，菌群結(jié)構(gòu)差異及差異微生物種類均采用QIIME、Usearch 等軟件進(jìn)行分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG 及其體外消化產(chǎn)物對腸道菌群的影響

2.1.1 對腸道菌群α 多樣性的影響

腸道菌群α 多樣性可用香農(nóng)指數(shù)表示，它包含兩個因素：一是種類數(shù)目，即豐富度；二是種類中個體分配上的均勻性。種類數(shù)目增多可提高α 多樣性；同樣，種類之間個體分配的均勻性增加也會使α 多樣性提高，即α 多樣性與香農(nóng)指數(shù)呈正相關(guān)[10]。

從EGCG 及其體外消化產(chǎn)物處理的腸道菌群中得到的兩組樣品，共獲得158 775 條16S rDNA 有效序列量，采用Illumina PE250 測序序列對有效序列為97%以上的相似水平進(jìn)行OTU 生物信息統(tǒng)計分析，足以說明樣本所涵蓋的腸道菌群類別。由表1 可知，與對照組相比，EGCG組的香農(nóng)指數(shù)無顯著變化（P＞0.05），而EGCG-GIT 組的香農(nóng)指數(shù)顯著升高（P＜0.05），顯著提高腸道菌群的α 多樣性，表明消化前后的EGCG 對菌群多樣性的影響不同，這可能與消化過程中EGCG 的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

表1 EGCG 和EGCG-GIT 對腸道菌群α 多樣性的影響Table 1 Effect of EGCG and EGCG-GIT on α diversity of intestinal flora

2.1.2 主成分分析（PCA）

為了揭示EGCG 組和EGCG-GIT 組之間腸道菌群種類的差異，分析體外模擬消化前后的EGCG 對腸道菌群的總體影響，對樣品組進(jìn)行了主成分分析，見圖1。

圖1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis

由圖1 可以看出，第一主成分的貢獻(xiàn)率為64.96%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為23.66%，這兩個主成分的累積貢獻(xiàn)率為88.62%。這說明由這兩個主成分可以解釋大部分的變量，PCA 分析能夠反映樣品的整體信息，且PCA 可以有效區(qū)分消化前后的EGCG 組。結(jié)果顯示，除去EGCG3（可能由于取樣問題導(dǎo)致的實驗誤差），消化前后的EGCG 在PC1 方向表現(xiàn)出了極大的成分差異性，但是在PC2 方向較接近，推測PC1 方向上的差異性是由有益菌豐度變化差異導(dǎo)致的，而PC2 方向上的相似性可能是由相同的有害菌豐度變化導(dǎo)致的。

2.1.3 對腸道微生物類群的影響

圖2（見上頁）為EGCG 的菌群OTU 聚類分析。結(jié)果顯示，EGCG 組樣品在門和綱水平上的微生物類群數(shù)目無明顯變化，而在目、科、屬水平上的微生物類群變化很大。其中，梭菌屬（Clostridium sensu stricto 18）在EGCG 處理過后，數(shù)量急劇下降，幾乎沒有檢出。梭菌屬是腸道內(nèi)主要的產(chǎn)丁酸菌，丁酸是一種短鏈脂肪酸，梭菌屬的減少可有效減少這種短鏈脂肪酸的生成，表明EGCG 可能通過減少梭菌屬的含量，從而減少脂質(zhì)分解成脂肪酸。EGCG 可能通過促進(jìn)和抑制某些菌屬的生長，起到改善腸道免疫功能的作用[15-16]。

圖2 EGCG 與CK 在各分類水平的微生物類群對比Fig.2 Comparison of microbial groups of EGCG and CK at various classification levels

由圖3 可知，EGCG-GIT 處理的樣品整體呈增加趨勢，科、屬、種水平上的微生物類群變化較大，擬桿菌屬明顯增加。與圖2 相比，消化前后的EGCG 對腸道菌群的影響發(fā)生了變化。相比對照組，EGCG 組中，對人體有益的Lactobacillus大幅增加，羅斯拜瑞氏菌屬（Roseburia）增加；而能產(chǎn)生芽孢的Clostridium sensu stricto 18明顯減少；EGCG-GIT 組中Bacteroides和Anaerotruncus明顯增加；對人體有益的Ruminococcaceae小幅增加，而Clostridium sensu stricto18和Lachnoclostridium明顯減少。

圖3 EGCG-GIT 與CK 在各分類水平的微生物類群對比Fig.3 Comparison of microbial groups of EGCG-GIT and CK at various classification levels

2.1.4 對優(yōu)勢菌屬及其相對豐度的影響

EGCG 發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌屬的分析組分圖4 和熱圖6A 顯示，腸道菌群前三優(yōu)勢菌屬為Escherichia-Shigella、Clostridium sensu stricto 18以及Peptoclostridium。其中，Escherichia-Shigella相比于對照組的相對含量顯著增加，Clostridium sensu stricto 18減少到幾乎消失，Peptoclostridium顯著增加。EGCG-GIT 發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌屬的分析組分圖5 以及熱圖6B 的顯示，腸道菌群前三優(yōu)勢菌屬為Bacteroides、Clostridium sensu stricto 18、Lachnoclostridium。Bacteroides相比于對照組的相對含量顯著增加，Clostridium sensu stricto18減少到幾乎沒有檢出，Lachnoclostridium顯著減少。

圖4 EGCG 優(yōu)勢物種群落結(jié)構(gòu)分析組分圖Fig.4 Composition diagram of community structure analysis of EGCG dominant species

圖5 EGCG-GIT 優(yōu)勢物種群落結(jié)構(gòu)分析組分圖Fig.5 Composition diagram of community structure analysis of EGCG-GIT dominant species

圖6 微生物群落屬熱圖分析Fig.6 Heat map analysis of microbial community

本文腸道微生物的優(yōu)勢菌屬與類似報道[17-19]結(jié)果相近。擬桿菌屬是SD 大鼠體內(nèi)大量存在的常規(guī)菌群，屬于革蘭氏陰性菌[20]，Cholewisk 等[21]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門的豐度與體脂和體質(zhì)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其基因組中富含大量碳水化合物活性酶基因，可以利用多種膳食中的可溶性多糖，代謝產(chǎn)物以乙酸鹽和丙酸鹽為主。擬桿菌門細(xì)菌具有多種產(chǎn)維生素和輔酶的基因，可能在大鼠腸道微生物消化和營養(yǎng)利用中發(fā)揮重要作用[22-23]。梭桿菌屬是腸道內(nèi)主要的產(chǎn)丁酸菌，丁酸具有為腸上皮細(xì)胞提供能量、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)、調(diào)節(jié)腸道免疫等作用[24-25]。其在EGCG 處理過程中逐漸富集，表明EGCG 可能被梭桿菌屬酵解生成短鏈脂肪酸丁酸，進(jìn)一步發(fā)揮維護(hù)腸道健康的作用[26]。

3 結(jié)論

消化前后的EGCG 對腸道菌群有不同影響，EGCG并未顯著改變腸道菌群的α 多樣性，而EGCG-GIT 顯著提高了腸道菌群的α 多樣性。兩者分別處理的腸道菌群都在科、屬、種水平豐度呈現(xiàn)顯著差異。盡管消化前后的EGCG 均能顯著降低有害菌梭菌屬（Clostridium sensu stricto 18）的豐度，但兩者對有益菌的影響存在差異，EGCG 可顯著提高有益菌乳桿菌屬（Lactobacillus）和羅斯拜瑞氏菌屬（Roseburia）的豐度；其消化產(chǎn)物則是使有益菌瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）小幅增加。消化前后的EGCG 對大鼠腸道菌群組成的影響情況不同，可能與其消化過程中的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，未來可進(jìn)一步研究EGCG在消化過程中的組成變化及其影響因素，探討提高EGCG 生物利用率運(yùn)載體系的制備工藝。