補腎活血方對子癇前期模型大鼠血栓前狀態(tài)中凝血功能及TFPI-2的影響研究*

蔡曉曉 袁寧霞 張小菜 裴巧麗 王 丹 王 甜 朱麗紅（陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

高齡孕產(chǎn)婦伴發(fā)妊娠期高血壓及子癇前期相關(guān)領(lǐng)域的研究一直是產(chǎn)科熱點［1-2］。血栓前狀態(tài)（PTS）即是血液中凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)失衡，引起血栓形成前的病理狀態(tài)［3］。子癇前期患者一定程度上存在PTS，這種情況不一定引發(fā)血栓性疾病，但可能對子宮胎盤循環(huán)產(chǎn)生影響，從而引起胎盤灌注不足，導(dǎo)致胎盤微血栓形成。因此，失衡的PTS為抗凝治療提供了理論基礎(chǔ)。

子癇前期屬于中醫(yī)學(xué)“子腫”“子暈”“子癇”范疇。妊娠期間，陰血聚下以養(yǎng)胞胎，精血愈虛，陰不斂陽，相火偏旺，故本病因孕而虛，本虛標實。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，PE患者全身小血管痙攣，胎盤等組織微血栓形成，導(dǎo)致部分組織壞死，故PE又屬“瘀”的范疇。因此，腎虛血瘀是PE患者血栓前狀態(tài)的中醫(yī)病機關(guān)鍵。補腎活血原方來源于張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，主要功用以補腎、安胎為主，加用丹參，祛瘀生新而不傷正，《本草綱目》謂其“能破宿血，補新血”；《婦科名理論》也有“一味丹參，功同四物”之說。補腎活血方所選用的桑葚、桑寄生、炒菟絲子、丹參、續(xù)斷，旨在補腎化瘀的基礎(chǔ)上補腎活血，研究補腎活血方高、中、低劑量對子癇前期模型鼠仔代發(fā)育的影響及胎盤組織因子途徑抑制物-2（TFPI-2）的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由成都達碩動物實驗中心提供的性成熟SD大鼠，雌鼠210～250 g，雄鼠250～280 g；動物合格證號：SCXK（川）2015-030。于室溫18～28℃、相對濕度40%～70%的陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 藥物與儀器 左旋亞硝基精氨酸甲酯（購于美國Sigma公司）；阿司匹林腸溶片（國藥準字號H61023177，白鹿制藥）；補腎活血方免煎顆粒（購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）。BP-100A全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀（成都泰盟科技有限公司）；代謝籠（江蘇動物實驗設(shè)備有限公司）；電子顯微鏡（JEM-100SX）（日本電子公司）。

1.3 藥物的配置 LNAME溶液［4］：用天平稱取50 mg的L-NAME溶于1mL純水中混勻，質(zhì)量濃度為50mg/mL，玻璃棒攪拌使其完全溶解后4℃冰箱保存。阿司匹林腸溶片：按60 kg成人100 mg/d劑量計算，將50 mg阿司匹林腸溶片充分研磨成細顆粒狀，加入0.9%氯化鈉注射液50 mL，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，充分混勻后4℃保存。補腎活血方（桑葚10 g，桑寄生10 g，炒菟絲子10 g，續(xù)斷10 g，丹參10 g）：免煎顆粒按低、中、高劑量分別溶于50 mL純水中，其含生藥量分別為1、2、4 g/mL。

1.4 造模與分組 參考盧敏等［5-6］的造模方法，孕前各組大鼠測量基礎(chǔ)血壓作為參考，每晚6∶00將雌鼠與雄鼠合籠，次日晨8∶00進行陰道涂片，連續(xù)5 d為1個周期，以觀察到精子為大鼠懷孕第1天。孕10 d（給藥前）重復(fù)測量收縮壓進行對比，待孕12 d起造模組給予皮下注射L-NAME 125 mg/（kg·d），給藥后第3天測量血壓，若較給藥前血壓升高30 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）或以上則為造模成功。實驗中共90只雌鼠參與建模，其中不明原因不孕13只，造模成功77只。造孕鼠干預(yù)過程中早產(chǎn)3只，灌胃死亡2只，最終剩余72只。采用隨機數(shù)字表法分為6組，每組12只。

1.5 給藥方法 大鼠給藥劑量按人與動物每公斤體質(zhì)量用藥劑量折算系數(shù)計算：按60 kg成人劑量的折算系數(shù)W：6.25。正常妊娠組：12～19 d生理鹽水0.5 mL/d皮下注射。子癇前期組：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射。阿司匹林組：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射+16～19 d阿司匹林10 mg/（kg·d）灌胃。補腎活血方低劑量組：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射+16～20 d補腎活血方低劑量0.3 mL［312.5 mg/（kg·d）］灌胃。補腎活血方中劑量組：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射，16～20 d補腎活血方中劑量0.3 mL［625 mg/（kg·d）］灌胃。補腎活血方高劑量組：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射，16～20 d補腎活血方高劑量0.3 mL［1 250 mg/（kg·d）］灌胃。

1.6 標本采集與檢測 1）大鼠血壓的測量：分別于孕前、妊娠第10、15、20天測量大鼠收縮壓。將大鼠固定于恒溫箱中適應(yīng)2～3 min，待大鼠充分安靜后將尾根部置于尾套中，根部正中接觸傳感器。觀察電腦中的波形為規(guī)則鋸齒狀波形后點擊開始按鈕，氣囊開始充氣至鼠尾血流完全被阻斷后自動放氣，待電腦波形重新出現(xiàn)規(guī)則鋸齒波時即測得大鼠收縮壓與舒張壓。記錄數(shù)值，連續(xù)加壓測量3次，每次間隔1～2 min，取其平均值記錄。2）尿蛋白：收集妊娠第10、15、20天24 h尿液進行尿蛋白定量分析。3）血小板、凝血四項：孕21 d腹主動脈取4～5 mL動脈血檢測血小板計數(shù)（PLT）、凝血四項［凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT），升高纖維蛋白原（Fbg）］。4）TFPI-2水平：暴露大鼠子宮，將胎仔、胎盤從子宮中剖出，分離胎盤、胎仔，分別置于分析天平上稱重，精確至0.001 g，部分胎盤固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后脫水，石蠟包埋，用于免疫組化監(jiān)測TFPI-2。TFPI-2陽性反應(yīng)表現(xiàn)為合體滋養(yǎng)細胞內(nèi)有棕黃色顆粒沉著，根據(jù)German Immuno Reactive Score評分系統(tǒng)，將各組切片隨機抽取5個視野，在400倍顯微鏡下觀察，根據(jù)陽性表達強弱分級：0分為細胞內(nèi)無染色、呈均勻淡黃色或與背景顏色一致；1分為少量淡黃色顆粒沉著；2分為較多淡黃色或棕黃色顆粒沉著；3分為細胞內(nèi)有大量棕黃色或褐色顆粒沉著。根據(jù)染色面積分級：0分為陽性細胞染色面積為0；1分為陽性染色面積＜25%；2分為染色面積＜50%；3分為細胞內(nèi)陽性染色面積＞50%。根據(jù)染色強弱分級和染色面積分級綜合評分：（-）為0～1分；（+）為2～3分；（++）為4～5分；（+++）為5～6分。計算平均值作為QI值（QI值=強弱分級×面積分級）

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示；兩樣本組間表較采用t檢驗；不同時間點比較采用重復(fù)測量方差分析，多組間樣本方差齊性時采用F檢驗和LSD檢驗，不齊選用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計繪圖采用GraphPad Prism 5.0及Excel 2013軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠給藥前后收縮壓與24 h尿蛋白比較 見表1，表2。孕前及孕10 d各組大鼠收縮壓及24 h尿蛋白對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；孕15 d各組大鼠收縮壓及24 h尿蛋白與正常妊娠組相比呈明顯上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；孕20 d與子癇前期組對比，各組大鼠收縮壓及24 h尿蛋白呈不同程度下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組孕鼠給藥前后收縮壓比較（mmHg，±s）

表1 各組孕鼠給藥前后收縮壓比較（mmHg，±s）

注：與正常妊娠組比較，*P＜0.05；與子癇前期組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與補腎活血方中劑量組比較，▲P＜0.05。下同。

組別正常妊娠組子癇前期組阿司匹林組補腎活血方低劑量組補腎活血方中劑量組補腎活血方高劑量組n 12 12 12 12 12 12孕前112.41±6.58 106.50±7.93 106.83±11.00 105.50±8.29 111.00±9.53 103.75±6.66孕10 d 113.41±6.99 112.75±7.86 109.16±7.77 107.41±8.32 113.66±12.56 109.91±10.12孕15 d 113.08±5.90 155.83±6.67*154.41±8.97*154.66±8.11*160.33±8.45*160.08±9.09*孕20 d 109.00±5.37 162.16±5.37*135.08±9.22△△▲145.91±7.26△△▲123.33±8.74△△132.41±7.82△△▲

表2 各組孕鼠給藥前后24 h尿蛋白比較（mg/24 h，±s）

表2 各組孕鼠給藥前后24 h尿蛋白比較（mg/24 h，±s）

組別正常妊娠組子癇前期組阿司匹林組補腎活血方低劑量組補腎活血方中劑量組補腎活血方高劑量組n 12 12 12 12 12 12孕10 d 6.41±0.78 5.95±0.91 6.12±0.90 6.70±0.87 5.84±0.93 6.39±1.24孕15 d 6.20±0.51 12.36±1.66*12.77±1.78*13.21±1.60*12.76±1.06*13.05±0.91*孕20 d 6.33±0.98 14.30±2.20*9.41±1.40△△▲11.53±1.81△△▲7.28±1.06△△9.78±1.47△△▲

2.2 各組孕鼠PLT、凝血四項比較 見表3。與正常妊娠組相比，子癇前期組PLT、Fbg升高，PT、APTT、TT縮短，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與子癇前期組相比，阿司匹林組和補腎活血方低、中、高劑量組PLT、Fbg下降，PT、APTT、TT明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），中劑量組干預(yù)后血小板及凝血功能顯著好轉(zhuǎn)，差異明顯具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 各組孕鼠PLT、凝血四項比較（±s）

表3 各組孕鼠PLT、凝血四項比較（±s）

組別正常妊娠組子癇前期組阿司匹林組補腎活血方低劑量組補腎活血方中劑量組補腎活血方高劑量組n 12 12 12 12 12 12 PLT（×109/L）1 068.66±113.89 1 445.00±103.30*1 223.75±177.91△1 349.66±83.42△1 110.75±99.22△△1 255.08±119.03△PT（s）11.69±1.03 7.78±0.88*10.85±0.75△9.32±0.62△11.72±1.12△△10.66±1.43△TT（s）32.85±2.02 29.47±1.53*31.40±1.04△30.15±1.65△31.70±2.32△△31.14±1.60△APTT（s）18.06±0.70 14.73±1.26*17.98±1.48△15.54±1.96△18.54±0.97△△16.88±2.65△Fbg（g/L）1.57±0.20 3.20±0.33*2.30±0.45△3.09±0.40△1.63±0.33△△2.37±0.38△

2.3 各組孕鼠胎盤TFPI-2表達綜合評分比較 見表4，圖3。與正常妊娠組相比，子癇前期組大鼠胎盤中TFPI-2表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與子癇前期組相比，各干預(yù)組胎盤中TFPI-2表達呈不同程度變化，其中，補腎活血方低劑量組表達略有差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），補腎活血方中劑量組胎盤中TFPI-2表達明顯下降，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與阿司匹林組相比，補腎活血方低、高劑量組胎盤中TFPI-2表達變化不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組孕鼠胎盤中TFPI-2表達（蘇木素染色，400倍）

表4 各組孕鼠胎盤TFPI-2表達綜合評分比較（分，±s）

表4 各組孕鼠胎盤TFPI-2表達綜合評分比較（分，±s）

組別正常妊娠組子癇前期組阿司匹林組補腎活血方低劑量組補腎活血方中劑量組補腎活血方高劑量組n 12 12 12 12 12 12 TFPI-2 7.18±0.64 14.54±1.04*12.74±0.93△12.15±0.75△10.87±0.64△12.38±1.06△

3 討 論

子癇前期是一種嚴重的妊娠期特有疾病，是引起孕婦和圍生兒死亡的主要原因之一。正常妊娠時存在著生理性的高凝狀態(tài)，纖溶系統(tǒng)的活性也相應(yīng)增強，使正常孕婦機體凝血與纖溶系統(tǒng)保持動態(tài)平衡狀態(tài)。發(fā)生子癇前期時，血管內(nèi)皮細胞受損，凝血因子及血小板功能明顯增強，而抗凝血因子和纖溶酶原激活物活性降低，使機體凝血與抗凝平衡失調(diào)，呈明顯的高凝狀態(tài)血栓傾向［7］。

有研究表明，子宮螺旋動脈重塑是妊娠期間子宮與胎兒營養(yǎng)物質(zhì)交換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，正常妊娠螺旋動脈的重塑可達到96%，而重度子癇前期并發(fā)FGR時只有10%［8］。參與子宮螺旋動脈重塑的間質(zhì)滋養(yǎng)細胞穿透蛻膜、子宮內(nèi)膜及子宮肌層1/3，在螺旋動脈周圍聚集；然后，血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞以逆行方式沿螺旋動脈內(nèi)腔遷移，取代內(nèi)皮血管，使狹窄肌性管腔轉(zhuǎn)變?yōu)閿U張的低阻力子宮胎盤血管［9］。妊娠早期遷移的血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞在子宮螺旋動脈末端形成栓子，堵塞子宮動脈，使得子宮螺旋動脈重塑障礙。子癇前期患者胎盤組織內(nèi)微血栓形成，與中醫(yī)“血瘀”范疇相符合。

補腎活血方以壽胎丸為基礎(chǔ)，方中菟絲子補腎填精，腎精充盛則胎元穩(wěn)固。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子黃酮［10］能增加成年大鼠腺垂體、卵巢及子宮質(zhì)量，提高卵巢人絨毛促性腺激素/黃體生成素受體功能，改善垂體對促性腺激素釋放激素的反應(yīng)性，促進hCG分泌。續(xù)斷、桑寄生補肝腎，能破瘀血，生新血，令胎牢固，研究表明，桑寄生中的黃酮類物質(zhì)可以改善生殖軸功能，促進激素分泌，補腎活血、增加妊娠率［11］；阿膠滋陰養(yǎng)血，沖任氣血旺盛，胎元穩(wěn)固。全方以補腎安胎為根本，結(jié)合子癇前期患者可能與子宮螺旋動脈重鑄障礙、胎盤微血栓相關(guān)，加用丹參，祛瘀生新而不傷正，既活血又養(yǎng)血，能提高組織耐缺氧能力，改善胎盤微循環(huán)，達到抗血栓作用［12］。全方在壽胎丸基礎(chǔ)上化裁，增加了化瘀作用，治以補腎化瘀安胎之法，以期能改善子癇前期患者胎盤缺血缺氧，延長孕周，降低母胎死亡風(fēng)險。

TFPI-2是一種分子量為29 kD的絲氨酸蛋白抑制家族成員［13］。周瓊潔［14］通過對孕婦血清和胎盤TFPI-2表達的觀察，發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清中TFPI-2含量與胎盤中TFPI-2表達呈相反作用，這可能與子癇前期孕婦胎盤中TFPI-2表達不穩(wěn)定有關(guān)，受多因素影響。王曉丹等［15］通過實驗發(fā)現(xiàn)：胎盤滋養(yǎng)細胞TFPI-2有明確表達，并且子癇前期患者胎盤中TFPI-2的表達明顯低于妊娠期高血壓患者和正常妊娠者。Katalin Karaszi［16］報道，在早期子癇前期合并或不合并HELLP綜合征的胎盤組織中TFPI-2表達較高。

補腎活血方能不同程度改善子癇前期大鼠血液高凝狀態(tài)，降低PLT，縮短PT、TT及APTT，降低血栓風(fēng)險；同時可以減少TFPI-2在胎盤中的表達，提示補腎活血方對子癇前期大鼠模型血栓前狀態(tài)具有治療作用。根據(jù)不同劑量補腎活血方對比，低劑量作用效果一般，中劑量效果良好，高劑量作用效果與阿司匹林類似，提示不同劑量補腎活血方對改善子癇前期大鼠血液高凝狀態(tài)具有治療作用，但其安全性和有效性還需進一步研究。