害蟲種群分子調(diào)控技術(shù)及在森林害蟲防控研究中的進(jìn)展

張?zhí)K芳張榮張真

(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

害蟲是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要干擾因子，對森林健康、林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境都造成了嚴(yán)重的破壞。隨著害蟲管理方法的不斷豐富，害蟲管理的理念也從消滅害蟲轉(zhuǎn)變?yōu)榫C合管理。近年來，生態(tài)管理的新思路出現(xiàn)[1]，遵從害蟲自身的生態(tài)發(fā)展規(guī)律，注重預(yù)防[2]，而不是害蟲發(fā)生后再補(bǔ)救。

害蟲管理策略的不斷進(jìn)步離不開害蟲防治方法的不斷進(jìn)展。物理防治在成本、效率方面存在不足，化學(xué)防治雖然成效顯著，但是隨之帶來的3R問題則給人們更加嚴(yán)峻的考驗(yàn)。信息素監(jiān)測及防治技術(shù)[3]、生物防治技術(shù)[4]具有環(huán)保、針對性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，更加符合現(xiàn)代害蟲管理的要求。這些害蟲防治方法在人類管理害蟲的過程中發(fā)揮了重要作用，但是新的問題也不斷出現(xiàn)，亟待開發(fā)新型綠色、高效、精準(zhǔn)的害蟲防治技術(shù)。

隨著昆蟲分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們對害蟲成災(zāi)相關(guān)基因及其功能逐步了解，并開始利用分子生物學(xué)進(jìn)行害蟲管理。通過一定的分子操作對害蟲成災(zāi)關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，有望開發(fā)害蟲管理新技術(shù)。能夠?qū)崿F(xiàn)調(diào)控害蟲成災(zāi)關(guān)鍵基因表達(dá)的RNA干擾[5]和遺傳防控[6-7]技術(shù)成為目前極具應(yīng)用前景的害蟲分子調(diào)控技術(shù)。

1 基于RNA干擾的害蟲分子調(diào)控研究進(jìn)展

1.1 RNA干擾的概念和基本原理

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)特異性、高效地誘導(dǎo)生物體內(nèi)靶標(biāo)基因 mRNA沉默的現(xiàn)象[8]。RNAi按照生物體的復(fù)雜程度，分為細(xì)胞自主型(cell-autonomous)或非細(xì)胞自主型(noncell-autonomous)兩類。單個細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的RNAi為細(xì)胞自主型，其基本原理是，外源性的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，被降解成19～21 bp長度的干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)，然后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，通過堿基配對特異性的結(jié)合在同源 mRNA(靶標(biāo))上切斷靶標(biāo) mRNA，引發(fā)靶標(biāo) mRNA的分解，從而產(chǎn)生靶標(biāo)基因的表達(dá)沉默[9]。非細(xì)胞自主型RNAi包括系統(tǒng)性 RNAi(systemic RNAi)和環(huán)境RNAi(environmental RNAi)，是指 RNAi可從起始位點(diǎn)傳遞至其他細(xì)胞或組織[10]，其過程包括dsRNA的獲得和輸出、干擾信號進(jìn)入其他組織、最終目的基因通過細(xì)胞自主型RNAi被沉默。

1.2 RNAi在害蟲防治中的潛力

RNAi能夠特異性地降低或關(guān)閉靶基因表達(dá)，因此成為基因功能研究的重要手段。另一方面，通過對昆蟲基因功能的研究，可篩選出控制生長發(fā)育的關(guān)鍵靶基因，這樣就可以結(jié)合RNAi技術(shù)，對相關(guān)基因進(jìn)行沉默，達(dá)到有效防控害蟲的目的。

相較于傳統(tǒng)的害蟲防治方法，RNAi技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，該技術(shù)只針對特定昆蟲的特定基因進(jìn)行基因沉默，因此具有昆蟲選擇性和基因特異性，可以特異高效地干擾害蟲靶標(biāo)基因表達(dá)，進(jìn)而控制害蟲的發(fā)生危害。其次，dsRNA導(dǎo)入生物體后一般在半天內(nèi)就可以起效[11]，周期短，節(jié)省時間成本。最后，對非靶標(biāo)昆蟲影響較小，RNA易降解，無殘留，是生物多樣性和環(huán)境友好型的害蟲防控方法。dsRNA可被制備成用于噴霧或灌溉施用的制劑，大面積地施用于田間等[12]。因此，RNAi技術(shù)是至今為止最有可能應(yīng)用于害蟲防治的生物工程技術(shù)[5]。例如孟山都公司研發(fā)的表達(dá)靶向玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera的RNAi轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)獲得美國農(nóng)業(yè)部(USDA)和環(huán)保署(EPA)批準(zhǔn)，即將開展商業(yè)化應(yīng)用[13]。

1.3 影響RNAi在害蟲防治應(yīng)用方面的因素

將RNAi應(yīng)用于害蟲防治，需要的基本條件包括有效的靶標(biāo)分子和高效的遞送系統(tǒng)。然而，并不是所有的昆蟲都具有高效的RNA干擾途徑，而dsRNA遞送方式的便捷性、成本等也是影響RNAi作為一種害蟲防治手段的關(guān)鍵因素。

1.3.1 干擾效率及差異因素

RNAi的干擾效率在不同昆蟲類群中差異顯著?？傮w來說，RNAi在鞘翅目昆蟲中是高效且系統(tǒng)性的。在許多經(jīng)濟(jì)上重要的鞘翅目昆蟲[14-16]中，注射或口服dsRNA可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的系統(tǒng)性RNAi反應(yīng)。而RNAi效率在鱗翅目、雙翅目、膜翅目和半翅目昆蟲中卻具有不確定性，這些目包含了很多重要害蟲、病媒和有益昆蟲[17-19]。

對于不同昆蟲RNAi干擾效率的研究證明，以鱗翅目等為代表的RNAi不敏感類群聚集了諸多不利于RNAi行使功能的因子。首先，鱗翅目和半翅目昆蟲的核酸酶活性高于其他昆蟲[20-21]。dsRNA被取食后第一道關(guān)卡是消化道內(nèi)的dsRNA酶。對昆蟲核酸酶降解dsRNA的比較研究表明[20]，RNA干擾效率不同的昆蟲，其核酸酶活性存在顯著差異。第二，dsRNA不能被細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。在鞘翅目昆蟲中，dsRNA可以通過內(nèi)吞作用等被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為siRNA；而在鱗翅目昆蟲中，如草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda，RNAi不能有效工作，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸效率低下，大多數(shù)dsRNA不能從內(nèi)涵體逃逸，因此不能轉(zhuǎn)化為siRNA[18]；不同的昆蟲組織對dsRNA的吸收也存在差異，例如，注射到飛蝗Locusta migratoria的dsRNA不會被卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞吸收，因此在這些組織中不會觸發(fā)RNA干擾[22]。第三，dsRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后通過Dicers加工成siRNA，而dsRNA轉(zhuǎn)化為siRNA的過程因昆蟲而異。異翅亞目、鱗翅目、直翅目和雙翅目昆蟲的dsRNA加工成siRNA的效率不如鞘翅目昆蟲[20]；最近的研究表明，僅在鞘翅目昆蟲中檢測到一種RNA結(jié)合蛋白Staufen C，它參與將dsRNA加工成siRNA，而在其他昆蟲中未檢測到該蛋白[23]。第四，重要RNAi功能基因Ago的分化。基因進(jìn)化的研究表明，Ago基因經(jīng)歷了頻繁的進(jìn)化擴(kuò)展，導(dǎo)致其功能分化[24-25]。最后，不同昆蟲體內(nèi)的生理?xiàng)l件也會影響RNAi效率。例如鱗翅目昆蟲中觀察到的消化腔內(nèi)高堿性pH值，可能對成功的RNAi有害[26]。

在RNAi干擾研究中，可采取一定措施提升干擾效率。例如，對于鱗翅目昆蟲，適當(dāng)加大dsRNA注射量，可提高干擾效率。例如，增大美國白蛾Hyphantria cunea幼蟲dsRNA的注射量，可增加干擾效果持續(xù)時間[11]，這可能是足量的dsRNA抵消了一部分降解帶來的不利影響。同時，也應(yīng)注意干擾時期的選擇，把握目的基因的表達(dá)規(guī)律，在表達(dá)高峰期進(jìn)行干擾，才能獲得最佳干擾效果[11]。對于飛蝗，選擇注射dsRNA才能高效干擾靶標(biāo)基因，而飼喂dsRNA則效果欠佳[27]。

RNAi靶標(biāo)基因的選擇在害蟲防治中受到多方面影響，并非所有基因都適合作為控制害蟲的靶標(biāo)基因。首先，殺蟲靶標(biāo)基因應(yīng)該是對昆蟲生長、發(fā)育、行為具有重要影響的基因；其次，鑒于卵和蛹期昆蟲處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，與外界互動較少，難于實(shí)施RNAi，因此幼蟲和成蟲發(fā)育時期的關(guān)鍵基因更有可能作為候選的致死基因；最后，基于安全性考慮，靶標(biāo)基因的篩選不僅要考慮能夠殺死害蟲，同時還要確保對非靶標(biāo)生物如人類和哺乳動物等的安全性，避免脫靶效應(yīng)(off-target effects)對非目標(biāo)生物的潛在危害等。這些因素都可能影響RNAi的效率，因此在害蟲靶標(biāo)基因篩選過程中，需要綜合考慮。

1.3.2 dsRNA遞送方法的研究進(jìn)展

RNAi干擾效率研究能解決高效靶標(biāo)分子的獲得問題，如何將靶標(biāo)基因的dsRNA便捷高效地遞送到害蟲體內(nèi)，并發(fā)揮干擾作用，則是影響RNAi能否最終成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素。靶標(biāo)基因的dsRNA遞送到昆蟲體內(nèi)發(fā)揮作用，基本的方式可以通過注射、經(jīng)皮(浸泡)、經(jīng)口(飼喂)三種途徑。這方面的研究近幾年獲得長足進(jìn)步[28]。

注射法可以繞開表皮和腸道上皮的屏障作用、核酸酶及不利生理環(huán)境等，將dsRNA有效而精準(zhǔn)的傳遞到昆蟲體內(nèi)，還可以在特定發(fā)育階段立即直接將定量dsRNA輸送到昆蟲體內(nèi)，甚至輸送到特定的身體部位，因此對于靶標(biāo)基因的功能分析具有獨(dú)到的優(yōu)勢。然而，注射法對儀器有較高要求，微小昆蟲操作起來存在不便，最重要的是不適用于田間應(yīng)用。

經(jīng)皮和經(jīng)口導(dǎo)入dsRNA，在昆蟲中具有操作便利、有應(yīng)用潛力的優(yōu)點(diǎn)。近年來，針對昆蟲dsRNA導(dǎo)入效率提升的最新進(jìn)展，大部分結(jié)合了經(jīng)皮和經(jīng)口導(dǎo)入方式。

1.3.2.1 植物介導(dǎo)的昆蟲dsRNA遞送方式 植物介導(dǎo)的dsRNA遞送，實(shí)際上是經(jīng)口導(dǎo)入的優(yōu)化。直接在植物中表達(dá)目標(biāo)害蟲的靶標(biāo)dsRNA，可以精準(zhǔn)控制目標(biāo)害蟲，無需多余的人力物力投入，具有巨大的應(yīng)用潛力。實(shí)際上，第一個被批準(zhǔn)且商業(yè)化種植的防治玉米根螢葉甲的轉(zhuǎn)基因玉米就是基于植物介導(dǎo)dsRNA遞送[13]。2007年兩篇論文幾乎同時在《Nature Biotechnology》發(fā)表，表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物分別是靶向棉鈴蟲Helicoverpa armigera的棉花[29]和靶向玉米根螢葉甲的玉米[30]。該遞送方式的這兩項(xiàng)突破性進(jìn)展，引發(fā)了一系列利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)dsRNA來控制害蟲的研究。

然而，該方式對于許多昆蟲的控制效率并不高。究其原因，是植物中表達(dá)的dsRNA大部分被加工成siRNA，大大減少昆蟲取食植物時攝入的dsRNA，從而影響了在昆蟲體內(nèi)的干擾效果[31]。針對該問題，張江教授團(tuán)隊(duì)利用植物葉綠體中缺乏Dicer酶的特征，將dsRNA表達(dá)定位于植物葉綠體DNA，效果遠(yuǎn)優(yōu)于普通的細(xì)胞核轉(zhuǎn)化方式[32]。該方法適用于取食細(xì)胞和組織的害蟲(如咀嚼式)，具有未來進(jìn)一步擴(kuò)大利用RNAi進(jìn)行害蟲防治的前景。

1.3.2.2 基于穩(wěn)定性和穿透效率提升的dsRNA遞送方式 并不是所有植物都便于轉(zhuǎn)基因并頻繁種植，例如森林生態(tài)系統(tǒng)中的大部分多年生植物更替較慢，替換表達(dá)dsRNA的植株周期長，不具有可操作性。此外，轉(zhuǎn)基因植物的公眾接受度和潛在風(fēng)險(xiǎn)也限制了植物表達(dá)dsRNA方式的運(yùn)用。因此，改進(jìn)dsRNA自身的遞送方式，開發(fā)具有時間短、開發(fā)成本低、抗性風(fēng)險(xiǎn)低、調(diào)控過程簡單、對所有作物都具有可行性優(yōu)勢的方式，其意義重大。

dsRNA對害蟲表皮的穿透能力和穩(wěn)定性有限是RNAi效率的重要影響因素，因此在實(shí)際害蟲防治過程中，需要設(shè)法進(jìn)一步提高其穿透效率和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高對靶標(biāo)的干擾效率。納米材料因尺度微小，具有表面積大、表面能高等諸多優(yōu)勢，其與dsRNA結(jié)合組成的納米遞送系統(tǒng)，具有高效、穩(wěn)定、緩釋、無污染等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展迅速。殼聚糖是一種天然納米材料，安全性好、可降解，是首批用于dsRNA遞送系統(tǒng)的納米材料[33]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的星形陽離子聚合物(star polycation，SPc)，在提高外源dsRNA穿透害蟲體壁能力、提升殺蟲效率方面效果顯著，在害蟲防治領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[34]。

脂質(zhì)體遞送是另外一種提高dsRNA遞送效率的方式。陽離子脂質(zhì)和帶負(fù)電的dsRNA互作后形成脂質(zhì)復(fù)合體，可有效增加dsRNA的吸收效率，延緩其在腸道內(nèi)的降解，從而提高干擾效率[35]。

1.3.2.3 微生物介導(dǎo)的dsRNA遞送方式 微生物能夠快速、低成本合成dsRNA。如果表達(dá)dsRNA的微生物能夠與昆蟲共存，則可源源不斷地提供dsRNA，具有可持續(xù)性、時間短、抗性低等優(yōu)勢，結(jié)合植物表達(dá)dsRNA和外源提供dsRNA的雙重優(yōu)勢，撇棄了植物表達(dá)dsRNA周期長和外源提供dsRNA不可持續(xù)的缺點(diǎn)，具有很大的應(yīng)用潛力。

要想達(dá)到表達(dá)dsRNA的微生物與昆蟲共存的效果，腸道共生菌是理想的表達(dá)容器。鑒定和分離合適的昆蟲腸道共生菌，并對目標(biāo)共生菌進(jìn)行改造，獲得 RNase III缺陷(不降解 dsRNA)、生產(chǎn)雙鏈RNA的菌株[36]，借助共生菌通過種群水平傳播或者垂直傳播途徑可以實(shí)現(xiàn)害蟲種群的防治。值得指出的是，后腸的核酸酶含量較低[37]，后腸共生菌用于dsRNA遞送也具有相應(yīng)的優(yōu)勢，在未來可加強(qiáng)鑒定和研究。

微生物介導(dǎo)的dsRNA遞送系統(tǒng)，不僅可以瞄準(zhǔn)昆蟲本身攜帶的微生物，也可以借助植物的內(nèi)生菌、病毒表達(dá)dsRNA，并間接遞送給害蟲。該方法對于多年生植物、或者轉(zhuǎn)基因難度大的植物較為適用。

1.3.2.4 dsRNA 遞送方式的選擇 dsRNA 的遞送方式多種多樣，實(shí)際研究和應(yīng)用中可以根據(jù)昆蟲特性、研究目的選擇合適的dsRNA遞送方式。

注射法具有定量、快速等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行基因功能研究的首選，然而，該方法不適于害蟲防治。對于某些昆蟲，如直翅目中的飛蝗，只選取注射法來進(jìn)行RNAi[27]。對于個體微小、操作不便的昆蟲，或者一些幼齡期昆蟲，可以采取經(jīng)皮(浸泡)的方式，對靶標(biāo)基因進(jìn)行高通量篩選[38]。植物表達(dá)dsRNA需要構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，因此針對某些飼喂干擾效果較好的專食性昆蟲、重要性經(jīng)濟(jì)作物的重大害蟲比較實(shí)用[29-30]。對于廣食性害蟲、寄主更替較慢的害蟲(如森林害蟲)，工程菌介導(dǎo)的dsRNA由于在成本、大量繁殖方面具有優(yōu)勢而更加實(shí)用。

當(dāng)然，dsRNA的遞送方式不是唯一的，可以利用注射來篩選合適的靶標(biāo)基因，再選擇合適的遞送方式開發(fā)害蟲控制技術(shù)；而納米技術(shù)等增強(qiáng)dsRNA效率的技術(shù)也可用于注射、浸泡、飼喂等多方面，提高各種基因的干擾效率。

1.4 森林害蟲RNAi研究進(jìn)展

RNAi作為害蟲防治的新技術(shù)在森林害蟲中展開嘗試是近幾年才開始的，且集中在幾種危害嚴(yán)重的森林害蟲中[39-40]。目前，鞘翅目森林害蟲相關(guān)研究進(jìn)展迅速。最早在2015年，白蠟窄吉丁Agrilus planipennis的 RNAi通路重要基因鑒定工作完成[41]，大多數(shù)參與RNA干擾途徑的基因被鑒定。隨后在該蟲中開展了一系列基因的RNAi效果測定和靶標(biāo)篩選[16]，并使用L4440菌株表達(dá)dsRNA的方式嘗試飼喂法進(jìn)行害蟲基因干擾，為防治打下了基礎(chǔ)[42]。在光肩星天牛Anoplophora glabripennis中也進(jìn)行了相似的研究[43]，獲得了可用于防治的靶標(biāo)基因[44-45]。最近，在幾種大小蠹中開展了RNA干擾有效性測試，并進(jìn)行基因功能研究或者防治靶標(biāo)篩選。這些大小蠹包括華山松大小蠹Dendroctonus armandi[46-47]，美國南方松大小蠹Dendroctonus frontalis[48]以及中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae等[49]。RNAi作為鞘翅目森林害蟲一種防治策略已經(jīng)受到越來越多的研究人員重視，相信未來相關(guān)研究會蓬勃發(fā)展。

除了鞘翅目害蟲，僅在鱗翅目幾種害蟲中展開了RNAi研究，包括美國白蛾[50]、舞毒蛾Lymantria dispar[51]、柚木駝蛾Hyblaea puera[52]和云杉色卷蛾Choristoneura fumiferana等[53]。其中，美國白蛾的RNAi防治研究工作開展較為深入。美國白蛾的RNAi始于幾丁質(zhì)脫乙酰酶和中腸氨肽酶N功能研究[54-55]。最近，中國林業(yè)科學(xué)研究院的張真課題組對美國白蛾開展了RNAi靶標(biāo)篩選[11]，并構(gòu)建了帶有美國白蛾幾丁質(zhì)酶dsRNA表達(dá)載體的菌株[56]，為該物種的基因功能研究和防治提供新技術(shù)支持。

總體上，RNAi已經(jīng)是森林害蟲基因功能研究的重要手段[50-51，57]，為基于RNAi的森林害蟲防治提供了良好靶標(biāo)。所使用的dsRNA導(dǎo)入方式以注射和飼喂為主，個別物種開展了L4440菌株表達(dá)dsRNA飼喂、轉(zhuǎn)基因植物[58]介導(dǎo)的嘗試。未來，在增加高效靶標(biāo)基因篩選的基礎(chǔ)上，應(yīng)推進(jìn)更多的林業(yè)害蟲dsRNA導(dǎo)入技術(shù)研究和應(yīng)用，如轉(zhuǎn)基因植物(對于那些更新較快的樹種)、納米載體導(dǎo)入、微生物介導(dǎo)的dsRNA導(dǎo)入等。

2 基于遺傳防控的害蟲分子調(diào)控研究進(jìn)展

害蟲遺傳防治(genetic pest management，GPM)是一種利用遺傳學(xué)原理防治害蟲的新方法，旨在利用害蟲的自然交配系統(tǒng)，以便將不育、致死或以其他方式改變種群的性狀引入害蟲種群[59-60]。20世紀(jì)30年代前，國外有關(guān)GPM的研究就已經(jīng)開始，到現(xiàn)在已經(jīng)積累了很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)，新的技術(shù)手段也層出不窮[61-63]。21世紀(jì)之前，GPM的主要技術(shù)手段有昆蟲不育技術(shù)(sterile insect technique，SIT)、染色體易位(chromosome translocation)[64-65]。傳統(tǒng)不育技術(shù)是采用化學(xué)藥劑處理、射線輻射等方式使昆蟲不育。21世紀(jì)之后，分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等的快速發(fā)展促進(jìn)了一系列新型GPM技術(shù)手段的產(chǎn)生，包括顯性致死昆蟲釋放技術(shù)(release of insects carrying a dominant lethal，RIDL)、歸巢核酸內(nèi)切酶基因(homing endonuclease gene，HEG)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease)、CRISPR/Cas系統(tǒng)等[66-67]。本綜述重點(diǎn)總結(jié)基于分子生物學(xué)技術(shù)的新型遺傳防治研究相關(guān)進(jìn)展。

2.1 遺傳防治的策略

2.1.1 顯性致死昆蟲釋放技術(shù)

1982年，Rubin和Spradling利用P轉(zhuǎn)座子，將外源基因插入到黑腹果蠅Drosophila melanogaster的基因組中，獲得了世界上第一個人為控制的轉(zhuǎn)基因昆蟲，啟發(fā)了專家學(xué)者通過轉(zhuǎn)座子技術(shù)開發(fā)新型害蟲遺傳防治策略[68]。RIDL首先被Thomas和他的團(tuán)隊(duì)們命名。他們利用黑腹果蠅作為研究對象，開發(fā)出了雌性特異性條件致死系統(tǒng)。第一個系統(tǒng)使用性別特異性啟動子或增強(qiáng)子來驅(qū)動可抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而控制有毒基因產(chǎn)物的表達(dá)，第二個系統(tǒng)使用可抑制轉(zhuǎn)錄因子的非性別特異性表達(dá)來調(diào)節(jié)選擇性致死基因產(chǎn)物[69]；同年，Heinrich和Scott也利用黑腹果蠅作為研究對象，基于相同的原理，體外構(gòu)建了一個復(fù)合轉(zhuǎn)座子(transposons with armed cassettes，TAC)，導(dǎo)入黑腹果蠅體內(nèi)形成轉(zhuǎn)基因昆蟲[70]。利用特殊遺傳標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化品系是構(gòu)建RIDL過程中的重要步驟，目前常用手段是添加熒光基因并使用啟動子驅(qū)動，這樣既能夠大幅度降低篩選的難度，也利于后期監(jiān)測[72]。目前開發(fā)的RIDL品系主要來自英國 Oxitec公司，大多數(shù)以蚊子為主，包括埃及伊蚊Aedes aegypti、岡比亞按蚊Anopheles gambiae等。

2.1.2 基因驅(qū)動

基因驅(qū)動的理念源于歸巢核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的超孟德爾遺傳現(xiàn)象(super-Mendelian inheritance)[72]，即某些特定基因型或特定性狀在種群中被有偏好性地遺傳給后代的現(xiàn)象。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，人們提出了基于該技術(shù)便捷的基因編輯能力發(fā)展的基因驅(qū)動模型[73]。前面提到的輻射不育技術(shù)和RIDL技術(shù)，都是自我限定(self-limiting)的遺傳控制策略，它們在遵守孟德爾遺傳定律的前提下，能夠?qū)⑼蛔兓蜻z傳給下一代，但是在種群中的比例是逐漸減少并可能消失的，因此需要源源不斷地釋放改造后的昆蟲來維持控制效果；而基因驅(qū)動技術(shù)則能夠?qū)⑼蛔兓蚩焖贁U(kuò)散，從而能夠自我維持(self-sustaining)，甚至完全替代野生種群。簡單來說，某些特定基因型或特定性狀在種群中有被偏好性地遺傳給后代的現(xiàn)象，也稱為超孟德爾遺傳(super-Mendelian inheritance)，人們利用該現(xiàn)象中的元件，構(gòu)建出能夠使目的基因在種群內(nèi)以超孟德爾頻率傳播的基因驅(qū)動系統(tǒng)。該策略已經(jīng)在黑腹果蠅[74]、斯氏按蚊Anopheles stephensi[75]以及岡比亞按蚊[73]等模式昆蟲中加以實(shí)踐。該策略的強(qiáng)大控制效果拓展了害蟲遺傳防控的應(yīng)用潛力，甚至由于其極強(qiáng)的種群侵入性和不可逆性，引起了人們對安全和道德問題的擔(dān)憂。未來，需要在如何科學(xué)利用現(xiàn)代工具、合理控制害蟲方面進(jìn)一步開展工作。

2.1.3 遺傳防控中的最新基因操作工具CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)是成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，廣泛存在于許多原核生物中，包括大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌。這些短重復(fù)序列與侵入細(xì)菌的外來DNA序列(如病毒DNA)互補(bǔ)。當(dāng)病毒感染細(xì)菌時，細(xì)菌會產(chǎn)生病毒DNA的互補(bǔ)序列與病毒DNA結(jié)合，然后使用一種叫做Cas的核酸酶將入侵的DNA切割成碎片。因此，CRISPR/Cas是原核生物對抗病毒的一種獲得性免疫防御機(jī)制，它也是一種自然產(chǎn)生的基因組編輯工具[76]。CRISPR最早是在1987年從大腸桿菌中克隆出的[77]，2005年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了其在細(xì)菌防御機(jī)制中的功能[78]。2012年，兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告稱，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以在體外重建。體外重建的CRISPR/Cas系統(tǒng)具有生物學(xué)功能，能切割單個DNA片段，為使用CRISPR/Cas作為基因組編輯工具提供了基礎(chǔ)[79-80]。

根據(jù)Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為I，II，III型。 其中II型 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成簡單，研究相對比較深入，也是目前被改造最成功的人工核酸酶系統(tǒng)，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)。其工作原理簡介如下:Cas9是一個1 049個氨基酸的核酸酶，含有RuvC-like和HNH兩個結(jié)構(gòu)域，在細(xì)菌中，Cas9能夠?qū)﹄p鏈 DNA進(jìn)行切割，但是需要 CRISPR RNA(crRNA)和tracerRNA介導(dǎo)。后續(xù)研究表明，crRNA和tracerRNA可以一起構(gòu)建，形成一個單一的嵌合合成RNA分子，稱為單導(dǎo)向RNA(sgRNA)。實(shí)際利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯時，只要根據(jù)需要設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)的crRNA，然后將其和tracerRNA拼裝起來得到sgRNA。Cas9上的HNH結(jié)構(gòu)域切斷與sgRNA配對的目標(biāo)鏈，而另一個結(jié)構(gòu)域RuvC-like切割目標(biāo)鏈的互補(bǔ)鏈。雙鍵斷裂后，有機(jī)體會對DNA進(jìn)行修復(fù)，從而產(chǎn)生突變、缺失等[80]。目前利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯逐漸成為潮流，在害蟲遺傳防治方面也有所進(jìn)展。

2.2 遺傳防治的成功案例

基于SIT的庫拉索島新大陸螺旋蠅Cochliomyia hominivorax[81-83]拔除計(jì)劃和坦桑尼亞桑給巴爾的溫古賈島采采蠅Glossina austeni[84]消滅項(xiàng)目，是早期害蟲遺傳防控的典型案例。而基于分子生物學(xué)的現(xiàn)代遺傳防治在蚊子中得到系列應(yīng)用。

以伊蚊和按蚊為代表的蚊類給人類生活帶來了極大困擾，蚊媒病毒的傳播更威脅到了很多人的生命，因此人類與蚊子的斗爭由來已久[85]。Oxitec公司開發(fā)的蚊子RIDL品系在多個地區(qū)應(yīng)用并取得了顯著的效果。埃及伊蚊OX513A品系最早開發(fā)于2007年，室內(nèi)和野外試驗(yàn)都表明該品系與野生型在個體大小、生殖力、抗性、營養(yǎng)利用、飛行能力等方面接近。2010年Oxitec與馬來西亞政府合作對該品系進(jìn)行的非棲息地野外釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，釋放的轉(zhuǎn)基因雄蚊與當(dāng)?shù)匾吧托巯x在平均壽命和交配競爭力等方面沒有顯著差異[86]。隨后進(jìn)行的棲息地釋放測試表明，OX513A雄蟲不僅與當(dāng)?shù)匾吧托巯x競爭力相當(dāng)[87]，而且能夠有效降低野生埃及伊蚊的種群密度[88]，從而阻止登革熱等疾病的傳播。2014年以來，印度、巴拿馬等國家也利用RIDL蚊子對病原蚊源進(jìn)行防控[89]。隨著基因驅(qū)動技術(shù)的發(fā)展，蚊子成為基因驅(qū)動技術(shù)應(yīng)用的先驅(qū)物種之一，斯氏按蚊[75]和岡比亞按蚊[73]中都成功開發(fā)了基因驅(qū)動系統(tǒng)。最近，英國倫敦帝國理工學(xué)院利用基因驅(qū)動技術(shù)開發(fā)了只產(chǎn)生雄蟲的岡比亞按蚊品系[90]，從而控制蚊子叮咬人類和傳播疾病。未來在進(jìn)一步保障安全的基礎(chǔ)上，遺傳防控技術(shù)可以為科學(xué)防蚊、阻斷蚊媒疾病提供科技支撐。

2.3 森林害蟲遺傳防治研究進(jìn)展

森林害蟲遺傳不育技術(shù)也有一定的研究進(jìn)展。輻射不育技術(shù)吸引人們對天牛類害蟲遺傳防控的嘗試，其中松墨天牛Monochamus alternatus[91-93]、桑天牛Apriona germari[94-95]、光肩星天牛[96]都進(jìn)行了輻射劑量篩選和不育效果測試等方面的嘗試，未見大規(guī)模應(yīng)用。

基于基因編輯的森林害蟲遺傳調(diào)控技術(shù)在美國白蛾中有較為深入進(jìn)展。劉慧慧等[97]通過對重要發(fā)育基因Wnt-1的研究明確，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)可以對美國白蛾基因組進(jìn)行高效編輯，HcWnt-1突變造成美國白蛾胚胎期死亡，可作為未來美國白蛾遺傳防治的靶標(biāo)基因。美國白蛾性別特異性致死遺傳防控體系的構(gòu)建，離不開對其性別確定機(jī)制的研究。doublesex基因(dsx)在性別決定中起著關(guān)鍵作用，由于其性別特異性剪接，它還顯示了害蟲管理中的應(yīng)用潛力。最近，Li等[98]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行靶向敲除獲得3種Hcdsx突變體，發(fā)現(xiàn)很多性二態(tài)性征的突變表型，導(dǎo)致突變體無法完成正常的交配、產(chǎn)卵和受精等生殖行為，造成性別特異性不育表型。這為美國白蛾遺傳防控品系的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。此外，在重要針葉林食葉害蟲松毛蟲中也實(shí)現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特定位點(diǎn)突變[99]，為害蟲遺傳防控提供了技術(shù)支持。

3 問題與展望

森林害蟲是我國森林生態(tài)系統(tǒng)的主要威脅之一，對于我國生物安全和生態(tài)文明建設(shè)造成重要影響。害蟲分子調(diào)控技術(shù)的開發(fā)是解決森林害蟲現(xiàn)有威脅的新策略之一。當(dāng)前害蟲遺傳調(diào)控技術(shù)研究以衛(wèi)生害蟲為主[6]，以RNAi為手段的害蟲調(diào)控技術(shù)在農(nóng)業(yè)害蟲中也有一系列進(jìn)展[100]，但是對于每年都能造成巨大損失的森林害蟲來說，有關(guān)遺傳調(diào)控和RNAi的研究還較少，且集中于個別類群中。

未來，森林害蟲分子調(diào)控技術(shù)的開發(fā)還需要在靶標(biāo)鑒定和實(shí)施技術(shù)開發(fā)兩方面改進(jìn)。首先，加強(qiáng)森林害蟲成災(zāi)機(jī)制的研究，從而挖掘適用于分子防控的高效靶標(biāo)。其次，借助最新技術(shù)提高dsRNA導(dǎo)入技術(shù)效率，從而為基于RNAi的分子調(diào)控技術(shù)開發(fā)鋪平道路。再次，森林害蟲分子遺傳防治技術(shù)的開發(fā)需進(jìn)一步完善，為構(gòu)建用于防治的森林害蟲新品系提供基礎(chǔ)，從而在復(fù)雜的森林生態(tài)系統(tǒng)中充分利用分子調(diào)控技術(shù)的便捷、可持續(xù)等特性。分子調(diào)控技術(shù)在森林害蟲防治中的應(yīng)用，還要注重生物安全的問題，從而使得這些新型技術(shù)得到合理應(yīng)用。

任何一種技術(shù)都存在優(yōu)勢和不足，如何協(xié)調(diào)新型分子調(diào)控技術(shù)和傳統(tǒng)害蟲防治技術(shù)，從而使不同的害蟲防治技術(shù)發(fā)揮最佳效果，是未來害蟲綜合防控和生態(tài)管理需要研究的重要方面。