單細胞測序技術(shù)及其在畜牧科學(xué)研究中的應(yīng)用

康彥東, 王興東, 郭韶珂, 曹夢麗, 郭 憲

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原畜禽遺傳育種重點實驗室，甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室,蘭州 730050)

細胞是構(gòu)成生命體的基本單位，即便來自同一個體、同一組織、同一細胞系，可能也會因為不同細胞亞群、在基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組發(fā)揮不同的作用[1]。單細胞測序的基本原理是將分離得到的單個細胞進行微量RNA擴增，然后通過高通量測序得到單個細胞的表達量，鑒定細胞類型，分析細胞發(fā)育的時空歷程[2]。第1個單細胞RNA測序結(jié)果于2009年，由北京大學(xué)的湯富酬教授[3]發(fā)表在NatureMethods上，首次探索了小鼠單細胞轉(zhuǎn)錄范圍的異質(zhì)性。此后，單細胞測序技術(shù)不斷應(yīng)用于各種科學(xué)研究中。Navin等[4]在2011年發(fā)表了第1篇關(guān)于單細胞核測序(SNS，一種單細胞測序)在乳腺癌中應(yīng)用的文章。Kim等人[5]分析了來源于肺腺癌患者的異種移植物(PDX)腫瘤組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組，使用跨細胞的高度異質(zhì)性基因的集合，包括KRASG12D，揭示了腫瘤內(nèi)SNV和表達異質(zhì)性。隨著單細胞測序的快速發(fā)展，單細胞測序不僅在干細胞、免疫、生殖等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮出重要的作用，在畜牧科學(xué)領(lǐng)域也開始應(yīng)用，并提供了有效的研究手段。

1 單細胞測序技術(shù)

單細胞測序技術(shù)以單個細胞作為研究對象，對單個細胞的遺傳物質(zhì)進行擴增，標(biāo)記構(gòu)建文庫后進行測序，最后對單個細胞基因組或轉(zhuǎn)錄組開展數(shù)據(jù)分析，其技術(shù)原理主要包括單細胞分離、擴增測序和數(shù)據(jù)分析3個方面[6]。單細胞測序(SCS)主要包括單細胞基因組測序(single cell DNA sequencing，scDNA-seq)、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)、單細胞表觀基因組測序(single cell epigenome sequencing)，這三類測序可以從不同角度揭示細胞各個階段的功能和特性[7]。

1.1 單細胞基因組測序

單細胞基因組測序是在單細胞分離技術(shù)基礎(chǔ)之上，獲取單個細胞全基因組DNA，并對其進行擴增和測序，從而獲取單個細胞的全部基因組信息。Guo等人[8]通過scDNA-seq分析，CNA積累遵循雙階段拷貝數(shù)進化模型，即一個標(biāo)點階段，然后是一個漸進階段，漸進期延長的肝癌患者顯示出更高的腫瘤異質(zhì)性和更差的無病生存率。該技術(shù)通常用于研究細胞間異質(zhì)性信息和細胞群體之間的關(guān)系[9]。

1.2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是一種在單個細胞水平上利用RNA測序?qū)μ囟毎后w進行基因表達譜定量的高通量實驗技術(shù)[10]。Vu等[11]通過scRNA-seq識別乳腺癌中一個復(fù)發(fā)性細胞水平突變與PDGFRA基因中的框內(nèi)缺失高度相關(guān)。

1.3 單細胞表觀基因組測序

單細胞表觀基因組測序是基于表觀基因組學(xué)對表觀遺傳學(xué)改變的研究[12]，利用單細胞測序技術(shù)可以構(gòu)建詳細的表觀基因組圖譜，并用來描述DNA甲基化或染色質(zhì)狀態(tài)[13]。Nagano等[14]通過引入單細胞Hi-C結(jié)合全基因組統(tǒng)計分析和單拷貝X染色體的結(jié)構(gòu)建模，顯示可變的細胞間染色體結(jié)構(gòu)，首次描述了表觀基因組測序。

2 單細胞測序方法

2.1 單細胞分離

單細胞測序首先是要對所研究的細胞進行分離。通常先將目標(biāo)組織進行剪碎并用消化酶消化成單細胞懸液。單細胞樣本的回收則需要根據(jù)實驗的需要進行選擇不同的回收方式，單細胞分離的方法主要有連續(xù)稀釋法[15]、顯微操作法[16]、熒光激活流式分選(FACS)[17]、激光捕獲顯微切割(LCM)[18]、微流控芯片[19]。不同的單細胞分離技術(shù)各有優(yōu)缺點，可以在面對不同試驗需求時提供相應(yīng)的選擇。

2.1.1 連續(xù)稀釋法 連續(xù)稀釋法分離細胞比較簡單，成本較低，但是分離效率低且成功率不高，耗時長，通量低[15]。

2.1.2 顯微操作法 顯微操作法用于目標(biāo)細胞量比較少的樣本，可以直接在顯微鏡下觀察到細胞，比較直觀，回收單細胞的成功率比較高。但由于是人工操作，對操作人員的技術(shù)要求比較高，回收通量比較低[20]。

2.1.3 熒光激活流式細胞分選技術(shù) 熒光激活流式細胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)是基于預(yù)先用熒光標(biāo)記的細胞表面特異性分子標(biāo)志或細胞光散射的特性，通過流式細胞儀分選出單個細胞或某些特殊細胞群的技術(shù)。FACS具有全自動、低成本、高精度和高通量的特點，還可以根據(jù)目標(biāo)細胞特異性篩選細胞。不適用于細胞量少且比較珍貴的細胞[21]。

2.1.4 激光捕獲顯微切割技術(shù) 激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)是利用激光從固定組織切片上進行顯微切割并且分離出單個細胞，優(yōu)點是保留了細胞原有的空間位置信息、能夠快速準(zhǔn)確地獲取單一細胞或者細胞亞群，有效解決了細胞異質(zhì)性的問題。LCM不用對組織進行酶解，不過組織切片制作難度較大，容易造成細胞丟失或被破壞，通量低，比較費時費力，對于設(shè)備要求較高，且由于激光溫度較高，容易造成RNA等的降解[18]。

2.1.5 微流控裝置 微流控裝置利用微流孔道將細胞分離到微滴或微孔中，可對微量樣品進行處理，具有自動化、通量高、檢測速度快、成本低的特點。由于微流控芯片中的精準(zhǔn)微閥操控，對于一些稀有樣本以提高效率和質(zhì)量[22]。

2.2 擴增測序

單細胞測序首先需要分離單個細胞，其次需要進行將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，擴增的cDNA用于測序文庫的制備。常用的測序平臺有SMART-seq2[23]、Fluidigm C1[24]、10X Genomics[25]、BD Rhapsody[26]、MARS-seq[24]等；不同方法在工作流程、靈敏度、數(shù)據(jù)質(zhì)量和成本方面的優(yōu)勢和局限性都不同。目前主流的scRNA-Seq平臺是基于微流體設(shè)計的，其中10X Genomics開發(fā)的Chromium系統(tǒng)由于高通量、低成本的優(yōu)勢使用較為廣泛[27]；10X基因組學(xué)平臺只能檢測轉(zhuǎn)錄本的3’或5’端，并且需要單個樣品中豐富的細胞，不適合檢測含有少量細胞的稀有樣本[28]。SMART-seq2在對轉(zhuǎn)錄本的整個長度進行描述時，仍然被認為是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，因為它的靈敏度、精度、低成本、可擴展性和易于在自動化平臺上安裝的優(yōu)點[29]。單細胞標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄測序(STAT-C1)就是基于Fluidigm C1的一種靈活的scRNA-seq方法，在微流體芯片上進行并引入UMI，允許在單細胞水平精確、敏感和高效的對轉(zhuǎn)錄本分子計數(shù)[30]。BD Rhapsody是基于微孔的技術(shù)，在重力作用下，單個細胞被隨機沉淀到微孔陣列中，將帶有細胞條形碼和UMI的珠子飽和組合在微孔陣列，mRNAs與珠子雜交并用于逆轉(zhuǎn)錄、擴增和測序。BD Rhapsody對于RNA的捕獲機制使得其可以容忍更少的細胞活力，更適用于不易獲取的樣本[26]。MARS-seq采用3’末端技術(shù)的mRNA測序方法，產(chǎn)生cDNA轉(zhuǎn)錄物(非全長)，在擴增之前用條形碼和唯一的分子標(biāo)識符(UMI)對cDNAs進行標(biāo)記，UMI能定量單個細胞內(nèi)單個基因的表達水平，從而減少擴增技術(shù)中的技術(shù)偏差[27]。

2.3 數(shù)據(jù)分析

單細胞測序數(shù)據(jù)分析中，由于研究目的不同，采用的數(shù)據(jù)分析流程也不同。單細胞基因組測序和單細胞表觀組測序與傳統(tǒng)的高通量測序數(shù)據(jù)分析方法類似[31]。單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程一般包括序列比對、質(zhì)控、修正批次效應(yīng)、降維、細胞分群等[32]，其分析內(nèi)容有基因表達、可變剪切、T細胞受體譜或B細胞受體譜、細胞聚類、擬時序分析等[33]。

3 單細胞測序在畜牧科學(xué)研究中的應(yīng)用

3.1 生殖系統(tǒng)方面

種公畜在種群性能改良和生產(chǎn)當(dāng)中發(fā)揮著巨大的作用。因為種公畜需要提供優(yōu)質(zhì)的精液，以保證優(yōu)秀的遺傳性狀可以穩(wěn)定地遺傳，所以繁殖性能對于種公畜至關(guān)重要。利用單細胞測序技術(shù)探究公畜睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的遺傳機理和分子調(diào)控機制，對于選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種畜具有重要意義。

高源[34]利用scRNA-seq技術(shù)對性成熟前后牛睪丸細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過聚類分析將睪丸細胞分為12個類群。包括9種體細胞和3種生殖細胞；并鑒定出一些牛睪丸不同類群細胞的特異標(biāo)記基因，如ARSE、CLEC12B、GAS1、KRT8、LOC101908015、HIGD1B、CCL21、ESX1、MEIOB、SPATA19等；這為解釋牛睪丸發(fā)育和精子生產(chǎn)的機制提供了理論依據(jù)。雷佩佩等[35]通過對150日齡豬睪丸細胞scRNA-seq技術(shù)分析，通過降維聚類將細胞進行分類，并篩選出CDH1和CD99為未分化精原細胞的潛在分子標(biāo)記，PODXL2為分化精原細胞的潛在分子標(biāo)記；為深入探究豬精原細胞分化和精子發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。于秀偉[36]在研究中篩選并鑒定了關(guān)中奶山羊精原細胞的特異性表達基因TKTL1和AES，并在綿羊數(shù)據(jù)中驗證了TKTL1和AES的表達。利用scRNA-seq技術(shù)首次對關(guān)中奶山羊精子發(fā)生過程進行解析，從單細胞水平對主要細胞類型進行了鑒定，闡明了精子發(fā)生過程中基因表達變化情況及青春期關(guān)中奶山羊體細胞發(fā)育情況，為關(guān)中奶山羊育種研究提供了有力的理論和技術(shù)支撐。牦牛性成熟較晚，繁殖效率較低[37,49]。單細胞測序技術(shù)應(yīng)用于牦牛繁殖性能的研究，主要集中在睪丸組織[38-39]。但由于細胞異質(zhì)性，阻礙了在不同發(fā)育階段對不同細胞類型的研究，使其研究更具有挑戰(zhàn)性[40]，因此利用單細胞測序技術(shù)對牦牛繁殖性能進行探究就顯得十分必要。

王俊杰[41]通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序研究濟寧青山羊卵泡發(fā)育過程中，卵母細胞與顆粒細胞的基因表達和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過分析，揭示產(chǎn)羔數(shù)差異個體的生殖細胞發(fā)育規(guī)律。石仙[42]通過單細胞轉(zhuǎn)錄組研究首次獲得了牦牛卵母細胞成熟過程中其顆粒細胞的基因表達譜，并且進一步證實了細胞周期蛋白CCND1和CCND2可以通過影響顆粒細胞的增殖分化而影響卵母細胞的發(fā)育，為篩選優(yōu)質(zhì)卵母細胞、改善體外成熟體系以及牦牛細胞發(fā)育機制研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 胚胎發(fā)育方面

鄧瑞之[43]通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序探究山羊在體內(nèi)植入前胚胎基因表達模式，以及對不同發(fā)育階段胚胎基因模式進行分類注釋獲得合子基因組激活關(guān)鍵基因，為驗證山羊轉(zhuǎn)座子元件在胚胎發(fā)育中的作用提供了幫助。張恒等[44]通過對豬體內(nèi)早期胚胎單卵裂球進行轉(zhuǎn)錄組測序，并進行生物信息學(xué)分析，揭示了相比于小鼠，豬等大動物早期胚胎發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與小型動物存在巨大的差別。李斐然[45]對不同來源綿羊早期胚胎發(fā)育的3個階段利用單細胞RNA體系Smart-seq V4建立了cDNA文庫，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄組，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，同一發(fā)育時期的SCNT胚胎、IVF胚胎與IVO胚胎的區(qū)別在于其差異基因表現(xiàn)在代謝進程、發(fā)育進程以及環(huán)狀大分子代謝、氮代謝等分子功能；通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)3種胚胎的差異基因表達主要分布在ATP結(jié)合盒式蛋白、氧化磷酸化、cAMP通路等細胞通路上。

3.3 組織器官方面

張愨[46]利用scRNA-seq技術(shù)，對豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞的異質(zhì)性進行了系統(tǒng)分析，篩選出一些潛在的特異性標(biāo)記基因，例如豬皮下脂肪多能干細胞的THY1、SFRP4和PI15，前體脂肪細胞的VCAM1、CD36和TXNIP，脂肪形成調(diào)節(jié)細胞的F3、SERPINE1和LMCD1等，揭示了豬皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞中的共同細胞類型。葉娜[47]在單細胞分辨率水平構(gòu)建了天祝白牦牛生長期毛囊的單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜?；趖-SNE聚類分析，成功鑒定了生長期毛囊發(fā)育過程中涉及的表皮細胞(KRT14、KRT15)，上皮分化細胞(SBSN、KRTDAP、KRT1、KRT10)、毛干細胞(LHX2、SHH)、DP細胞(LEF1、MSX1)、真皮細胞(VIM、COL3A1)、漏洞樣細胞(TOP2A、UBE2C)、伴隨層細胞(KRT79、APOE)以及內(nèi)跟鞘細胞(KRT28、KRT71)，闡述了牦牛毛囊發(fā)育過程中涉及的不同類型細胞的基因表達譜以及功能富集分析。吳天戈[48]在研究中對湖羊小花和直毛兩種花紋類型的皮膚組織進行了單細胞測序與分析，通過對差異表達基因PAPPA2的深入研究，發(fā)現(xiàn)其能夠通過調(diào)節(jié)IGFBP5促進DPCs增值，最終影響湖羊羔皮性狀。

4 總結(jié)與展望

單細胞測序能夠獲取單個細胞完整的全基因組，克服了大樣本量和細胞異質(zhì)性的問題。目前，單細胞測序技術(shù)主要應(yīng)用于人的腫瘤、免疫、生殖等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在畜牧科學(xué)中研究較少，主要集中在提高動物繁殖性能、促進胚胎發(fā)育等方面。因此在育種方面，可以利用單細胞測序技術(shù)探索畜禽生殖細胞異質(zhì)性，挖掘良種繁殖潛力，探究相關(guān)分子發(fā)生機制；在品種資源開發(fā)利用方面，可以利用單細胞測序技術(shù)為相關(guān)性狀的分子育種提供理論基礎(chǔ)。隨著單細胞測序技術(shù)的深入發(fā)展，在畜牧科學(xué)中的研究將會有很大的應(yīng)用空間，促進畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展。