納/微秒復(fù)合脈沖提高細(xì)胞電融合效率的仿真與實(shí)驗(yàn)研究

李成祥 李新皓 柯 強(qiáng) 姚 成 姚陳果

納/微秒復(fù)合脈沖提高細(xì)胞電融合效率的仿真與實(shí)驗(yàn)研究

李成祥 李新皓 柯 強(qiáng) 姚 成 姚陳果

（輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶大學(xué)） 重慶 400030）

傳統(tǒng)的細(xì)胞電融合技術(shù)通常采用持續(xù)時(shí)間為微秒級(jí)的短時(shí)高壓電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，高幅值微秒脈沖在促進(jìn)細(xì)胞電融合的同時(shí)易導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度穿孔而死亡，從而限制了細(xì)胞的融合效率。為進(jìn)一步提高細(xì)胞電融合率，該文基于納秒脈沖電場(chǎng)所誘導(dǎo)的“超穿孔現(xiàn)象”，結(jié)合常規(guī)的微秒脈沖電融合技術(shù)，提出納/微秒復(fù)合脈沖協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞電融合的方法。以SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用COMSOL軟件分析復(fù)合脈沖作用下細(xì)胞膜上跨膜電壓與穿孔密度的分布，并進(jìn)行初步的電融合實(shí)驗(yàn)，探究該融合方法對(duì)細(xì)胞融合率和死亡率的影響。仿真結(jié)果顯示，傳統(tǒng)微秒脈沖作用下，細(xì)胞膜的兩極與接觸區(qū)域的跨膜電壓均超過(guò)穿孔閾值，顯著穿孔面積超過(guò)10%。而等劑量的納/微秒復(fù)合脈沖作用下，跨膜電壓僅在細(xì)胞接觸區(qū)域達(dá)到較高值，電穿孔也集中于該區(qū)域。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明，該方法能夠保證較低細(xì)胞死亡率（10%）的同時(shí)達(dá)到較高的細(xì)胞融合效率（75%）。該研究為細(xì)胞電融合技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了新的思路。

細(xì)胞電融合 納/微秒復(fù)合脈沖 融合效率 跨膜電壓 穿孔密度

0 引言

細(xì)胞融合作為細(xì)胞工程的一項(xiàng)核心技術(shù)，在生產(chǎn)生活中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[1]。采用人工干預(yù)的細(xì)胞融合為某些疾病提供了全新的治療方式，如糖尿病[2]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生[3]、自身免疫疾病[4]以及惡性腫瘤[5]等疾病均可通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)物得到有效治療。根據(jù)所采用干預(yù)方式的不同，細(xì)胞融合技術(shù)可分為化學(xué)融合法[6]（聚乙二醇）、生物融合法[7]（仙臺(tái)病毒、日本血凝病毒）和物理融合法[8]（離心、振動(dòng)、電融合）等。其中，細(xì)胞電融合作為物理融合方法的一種，相較化學(xué)融合法、生物融合法以及其他物理因子所誘導(dǎo)的細(xì)胞融合方法，具有可重復(fù)性高、操作簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、便于實(shí)時(shí)觀(guān)察等突出優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為最有效、最具前景的細(xì)胞融合技術(shù)之一[1]。

事實(shí)上，細(xì)胞電融合技術(shù)是由人們所熟知的微秒脈沖電場(chǎng)（microsecond Pulsed Electric Fields,msPEF）誘導(dǎo)細(xì)胞電穿孔現(xiàn)象發(fā)展而來(lái)。維爾茲堡大學(xué)的U. Zimmermann[8]利用msPEF進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)脈沖處理的部分細(xì)胞發(fā)生了融合，由此便創(chuàng)立了一種全新的細(xì)胞融合方法——電融合法?；趍sPEF的細(xì)胞電融合技術(shù)一經(jīng)提出便得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和持續(xù)研究，日本學(xué)者M(jìn). Senda等[9]利用msPEF成功實(shí)現(xiàn)了植物原生質(zhì)體的電融合，并迅速將該技術(shù)推廣到動(dòng)物、微生物的原生質(zhì)體融合中，推動(dòng)了電融合技術(shù)的跨越式發(fā)展；南開(kāi)大學(xué)汪和睦團(tuán)隊(duì)[10-11]實(shí)現(xiàn)了鼠源B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的電融合，并在此基礎(chǔ)上制備了多種不同抗性的雜交瘤細(xì)胞株；盧布雅爾納大學(xué)的D. Miklavcic等[12]采用電場(chǎng)強(qiáng)度1.2kV/cm、脈寬100ms、頻率1Hz的8個(gè)脈沖分別單獨(dú)處理B16-F1細(xì)胞和CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞都能夠進(jìn)行融合，但融合效率有所差別；瓦倫西亞理工大學(xué)的J. Cardona- Costa等[13]采用不同電場(chǎng)強(qiáng)度、脈寬的msPEF處理太平洋牡蠣受精卵，探討受精卵融合效率與微秒脈沖參數(shù)的依賴(lài)關(guān)系；上海瑞金醫(yī)院李雁等[14]研究發(fā)現(xiàn)，200V、25ms的直流脈沖是人體細(xì)胞核移植的最佳電融合參數(shù)，融合率達(dá)到53.6%。除了上述理論研究成果之外，基于msPEF的細(xì)胞電融合在設(shè)備研制方面也取得了積極的進(jìn)展。重慶大學(xué)Hu Ning等[15]為提高融合效率，研制出高通量細(xì)胞電融合芯片；東京大學(xué)K. Sugahara等[16]開(kāi)發(fā)了有利于大細(xì)胞高效配對(duì)的動(dòng)態(tài)微陣列電融合設(shè)備。

盡管基于msPEF的電融合技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是在融合過(guò)程中仍存在較高的細(xì)胞死亡率，極大地限制了融合效率的進(jìn)一步提升。為此，M. Kanduser等[17]提出通過(guò)添加脂質(zhì)抗氧化劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)以有效降低細(xì)胞死亡率；Qu Pengxiang等[18]則嘗試通過(guò)添加褪黑素來(lái)達(dá)到降低死亡率的效果。然而，化學(xué)試劑的添加無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致步驟的增加、生產(chǎn)工序的繁雜以及經(jīng)濟(jì)成本的提高。M.Kanduser等[19]研究發(fā)現(xiàn)，融合細(xì)胞的死亡率之所以居高不下，其關(guān)鍵在于msPEF施加過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞膜上出現(xiàn)大面積穿孔。因此，欲從根本上提升細(xì)胞電融合效率，應(yīng)在保證產(chǎn)生滿(mǎn)足電融合需求的穿孔的同時(shí)，盡可能地避免細(xì)胞膜過(guò)度穿孔情況的出現(xiàn)。

近年來(lái)，脈寬相對(duì)更窄的納秒脈沖電場(chǎng)（nano- second Pulsed Electric Fields, nsPEF）以其獨(dú)特的“細(xì)胞內(nèi)電處理”效應(yīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的關(guān)注[20-21]。同時(shí)，也有大量的仿真和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，nsPEF同樣可以作用在細(xì)胞外膜，并使其產(chǎn)生大量納米級(jí)尺寸的微孔，即所謂的“超穿孔”（supra- electroporation）現(xiàn)象。Hu Qingfang等[22]基于分子動(dòng)力學(xué)仿真發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)強(qiáng)度100kV/cm、脈寬10ns的nsPEF能在細(xì)胞外膜上快速產(chǎn)生納米級(jí)微孔；L. M. Mir等[23]采用電場(chǎng)強(qiáng)度40kV/cm、脈寬10ns的單個(gè)nsPEF處理DC-3F細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)nsPEF同樣可以使細(xì)胞膜穿孔，但穿孔尺寸較小，常用的大分子染色劑并不能通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；G. Saulis 等[24]也同樣證實(shí)nsPEF作用下細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔洞數(shù)量遠(yuǎn)大于msPEF，但尺寸較小，恢復(fù)時(shí)間較短，不易造成細(xì)胞死亡。

鑒于此，本文嘗試將nsPEF引入細(xì)胞電融合，使其首先在細(xì)胞膜上產(chǎn)生尺寸相對(duì)較小的微孔，繼而再施加低幅值msPEF對(duì)孔洞進(jìn)行維持和擴(kuò)張，以避免直接施加高幅值msPEF造成細(xì)胞膜大面積穿孔，從而降低死亡率，最終達(dá)到提高細(xì)胞融合效率的目的。為此，本文選擇小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為研究對(duì)象，建立融合細(xì)胞動(dòng)態(tài)電穿孔模型，對(duì)比分析msPEF及納/微秒復(fù)合脈沖作用下，細(xì)胞膜的跨膜電壓（Transmembrane Voltage, TMV）分布及穿孔變化情況，并初步開(kāi)展細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡觀(guān)察染色細(xì)胞的融合情況，探究納/微秒復(fù)合脈沖提高細(xì)胞電融合效率的可行性。

1 模型建立與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 數(shù)值仿真模型的建立

在COMSOL Multiphysics中建立相互接觸的雙細(xì)胞模型，采用有限元方法，對(duì)脈沖作用下細(xì)胞跨膜電壓的分布及細(xì)胞膜穿孔情況進(jìn)行仿真分析。

1.1.1 雙細(xì)胞幾何模型

由于細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)是在低滲融合緩沖液中進(jìn) 行[25]，待融合細(xì)胞會(huì)略微膨脹接近球體，因此，本文將細(xì)胞簡(jiǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)球體[19]。標(biāo)準(zhǔn)球體具有空間軸對(duì)稱(chēng)性，可以建立二維幾何模型來(lái)減少計(jì)算量，以縮短仿真時(shí)間。細(xì)胞融合仿真模型示意圖如圖1所示，用一個(gè)長(zhǎng)200mm、寬200mm的空間來(lái)模擬細(xì)胞融合時(shí)的外環(huán)境，兩側(cè)的條狀矩形用于模擬銅制極板，其中，左側(cè)極板施加高電位，右側(cè)極板接地。細(xì)胞的物理尺寸按SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的實(shí)際尺寸進(jìn)行設(shè)置，其中，細(xì)胞半徑為5.6mm，細(xì)胞核半徑為4.723mm，細(xì)胞核質(zhì)比約為70%。令兩細(xì)胞相互接觸并沿電場(chǎng)方向排列，接觸區(qū)域垂直于電場(chǎng)，長(zhǎng)度設(shè)置為2mm。將細(xì)胞各部分簡(jiǎn)化為各向同性的線(xiàn)性均勻介質(zhì)，分別用電導(dǎo)率和介電常數(shù)表示細(xì)胞模型各部分的電特性，各區(qū)域邊界設(shè)置為電絕緣，計(jì)算時(shí)用三角形進(jìn)行剖分，并對(duì)需要重點(diǎn)求解的細(xì)胞膜部分進(jìn)行二次細(xì)化，剖分單元為12 368個(gè)域單元（999個(gè)邊界元）。

1.1.2 動(dòng)態(tài)電穿孔模型

圖1 細(xì)胞融合仿真模型示意圖

式中，DY為跨膜電壓；i為膜的內(nèi)電位；o為膜的外電位。

在外加電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞內(nèi)外離子運(yùn)動(dòng)并聚集在膜兩側(cè)，細(xì)胞膜和核膜的穿孔可以描述為磷脂雙分子層受電位變化影響形成大量親水微孔。穿孔的形成為跨膜電流提供新的通道，大量的穿孔將顯著提高膜的導(dǎo)電性。此時(shí)，整體的跨膜電流密度可以表示[26-27]為

式中，為電流密度；m0為膜的初始電導(dǎo)率；m為細(xì)胞外溶液介電常數(shù)；m為細(xì)胞膜厚度；ep為跨膜電流密度增量，其計(jì)算公式由K. A. De Bruin和W. Krassowska提出[28]，有

其中

式中，ep為流過(guò)單個(gè)微孔的電流；為孔密度；p為孔隙電導(dǎo)率；為微孔半徑；0為孔隙阻礙能量系數(shù)；為孔隙相對(duì)密度；為法拉第常數(shù)；為氣體常數(shù)；為熱力學(xué)溫度?？酌芏瘸蕜?dòng)態(tài)變化，可通過(guò)Smoluchowsky方程[28]求解，有

式中，0為初始孔密度；ep為電穿孔特征電壓；為穿孔有效形成率系數(shù)；為穿孔系數(shù)。ep決定了細(xì)胞膜的穿孔閾值T，文獻(xiàn)[27]給出了二者之間的關(guān)系，生物質(zhì)膜的T通常取值為500～1 000mV，本文選取T=1 000mV（ep=258mV）[19, 29]。

將式（5）～式（7）代入式（4），可得到電流增量為

膜電導(dǎo)率m與孔密度呈正相關(guān)，膜動(dòng)態(tài)電導(dǎo)率由初始電導(dǎo)率及穿孔后的電導(dǎo)率增量相加得到[30-31]，有

電場(chǎng)作用下穿孔半徑的變化情況[30-31]為

式中，為孔半徑擴(kuò)散系數(shù)；為玻耳茲曼常數(shù)；為空間排斥能；為邊緣能量；h和t為平流速度常數(shù)；max為T(mén)MV=1V時(shí)的最大電動(dòng)力；*為親水孔最小半徑；eff為膜有效張力系數(shù)，可求得eff為

仿真研究中細(xì)胞所有幾何參數(shù)和電氣參數(shù)的取值及其來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 仿真模型幾何參數(shù)與電氣參數(shù)

Tab.1 The geometric and electrical parameters used in the simulation

1.1.3 復(fù)合脈沖電穿孔效應(yīng)仿真

利用COMSOL軟件中的AC-DC模塊和PDE模塊對(duì)兩個(gè)接觸細(xì)胞在脈沖作用下的電穿孔情況進(jìn)行瞬態(tài)仿真。為了準(zhǔn)確地對(duì)比單msPEF和納/微秒復(fù)合脈沖的作用效果，本文采用等劑量的脈沖施加方式，脈沖劑量[32, 35]為

式中，V為第個(gè)脈沖的幅值；T為第個(gè)脈沖的脈寬；為脈沖個(gè)數(shù)。

脈沖波形示意圖如圖2所示。參考細(xì)胞融合儀（ECM2001，美國(guó)BTX Corporation）參數(shù)推薦，選用電場(chǎng)強(qiáng)度2.21kV/cm，脈寬40ms的單個(gè)msPEF作為對(duì)照組的脈沖施加方案（見(jiàn)圖2a）。鑒于單個(gè)nsPEF對(duì)細(xì)胞膜作用有限[19]，本文經(jīng)過(guò)初步實(shí)驗(yàn)探究，選取5個(gè)電場(chǎng)強(qiáng)度6kV/cm，脈寬200ns的nsPEF，結(jié)合一個(gè)電場(chǎng)強(qiáng)度2kV/cm，脈寬40ms的msPEF作為復(fù)合脈沖的組合方式（見(jiàn)圖2b）。nsPEF的施加間隔為1ms，兩種脈沖轉(zhuǎn)換間隔設(shè)置為5ms。對(duì)整個(gè)模型區(qū)域進(jìn)行有限元仿真計(jì)算，由于雙細(xì)胞模型的對(duì)稱(chēng)性，為避免重復(fù)，在進(jìn)行細(xì)胞膜分析時(shí)僅對(duì)部分膜區(qū)域進(jìn)行展示，具體區(qū)域如圖3加粗部分所示。

圖2 脈沖波形示意圖

圖3 仿真分析區(qū)域示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

本文通過(guò)開(kāi)展細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證納/微秒復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合的可行性。為更好地對(duì)比納/微秒復(fù)合脈沖及msPEF的作用效果，采用三種不同的脈沖劑量分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞融合效率和死亡率，所涉及的實(shí)驗(yàn)方法和材料如下。

1.2.1 融合緩沖液配置

低滲融合緩沖液通常用于脈沖處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，該緩沖液（90mOsm/L）包含Mg2+（0.1mmol/L）、Ca2+（0.1mmol/L）、牛血清蛋白（1mg/mL）以及D-甘露醇（所有試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma Corporation）。等滲融合緩沖液含120mmol/L D-甘露醇，該緩沖液僅用于洗滌細(xì)胞。用電導(dǎo)率儀測(cè)試兩種緩沖液的電導(dǎo)率，電導(dǎo)率均為0.01S/m。

1.2.2 細(xì)胞處理

實(shí)驗(yàn)所用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）購(gòu)自上海雅潔生物科技有限公司，培養(yǎng)在37℃、5% CO2加濕的環(huán)境中，含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基上。在脈沖處理前，先將清洗、消化、潤(rùn)洗后的細(xì)胞通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并配制成細(xì)胞密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液。將0.5mL的細(xì)胞懸液和0.5mL的Hoechst 33342（10mg/mL，美國(guó)Solarbio Corporation）加入培養(yǎng)皿中充分混合，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min充分染色。染色完成后使用5mL磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline, PBS）洗滌兩次，以去除剩余染料。再用5mL等滲融合緩沖液洗滌一至兩次，即可將細(xì)胞置于500mL低滲融合緩沖液中，進(jìn)行脈沖處理。

1.2.3 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

取Hoechst染色完成的細(xì)胞接種于平行電極（45-0105，美國(guó)BTX Corporation）進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，該電極由帶有矩形極板的玻璃微載玻片制成，電極間距為3.2mm，體積為650mL。細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為課題組自行設(shè)計(jì)，如圖4所示。數(shù)字信號(hào)發(fā)生器和功率放大器用于生成正弦波形，并輸入脈沖發(fā)生器進(jìn)行統(tǒng)一控制。脈沖發(fā)生器中有納微秒脈沖發(fā)生模塊及切換模塊，可以輸出不同脈寬的方波脈沖或正弦電壓波形。不同波形之間的切換由繼電器（JPK43A234，中國(guó) WPVAC）實(shí)現(xiàn)，并通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列（Field Programmable Gate Array, FPGA）（EP4CE6，中國(guó) ALINX）進(jìn)行控制。示波器（DPO3024，美國(guó)Tektronix）用于顯示電流傳感器（2100，美國(guó)Pearson）和高壓探頭（PPE5kV，美國(guó)LeCroy）采集的電流和電壓信號(hào)。融合實(shí)驗(yàn)所施加的脈沖參數(shù)見(jiàn)表2，脈沖施加結(jié)束繼續(xù)培養(yǎng)10min，在細(xì)胞懸液中加入20mL碘化丙啶（PI；1mg/mL，美國(guó)Life Technologies Corporation）并靜置8min，用熒光顯微鏡（美國(guó)Life Technologies Corporation）觀(guān)察Hoechst 33342以及PI對(duì)細(xì)胞的染色情況。Hoechst 33342用于細(xì)胞核染色，融合實(shí)驗(yàn)后通過(guò)觀(guān)察熒光場(chǎng)和明場(chǎng)圖像可以判斷兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞是否融合。PI用于死亡細(xì)胞的染色，若細(xì)胞被PI染成紅色，則認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。

圖4 細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

表2 實(shí)驗(yàn)脈沖參數(shù)

Tab.2 Experimental pulse parameter

1.2.4 細(xì)胞電融合效率統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)胞融合率通常被定義為參與融合的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比[19, 32]，細(xì)胞死亡率為被PI染色的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比。若參與融合的細(xì)胞同時(shí)被PI染色，則計(jì)入死亡細(xì)胞，不計(jì)入融合細(xì)胞。

所有數(shù)據(jù)均以四組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對(duì)不同脈沖組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，用Origin 2019b進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 跨膜電壓仿真分析

在外加脈沖電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜由于電容效應(yīng)的存在表現(xiàn)出充放電過(guò)程，跨膜電壓隨之發(fā)生變化，本節(jié)對(duì)單msPEF及納/微秒復(fù)合脈沖作用下，雙細(xì)胞模型跨膜電壓分布情況進(jìn)行分析。圖5所示為兩種脈沖作用后細(xì)胞膜表面跨膜電壓沿弧長(zhǎng)的分布情況（分析區(qū)域見(jiàn)圖3）。根據(jù)仿真結(jié)果可知，單msPEF作用下細(xì)胞膜跨膜電壓分布（虛線(xiàn)部分）呈“W”型，細(xì)胞模型的左右兩極及接觸區(qū)域（黑色點(diǎn)劃線(xiàn)范圍）的跨膜電壓均達(dá)到了較高值（＞1V），說(shuō)明這些區(qū)域均存在較大可能被誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著穿孔。在納/微秒復(fù)合脈沖作用時(shí)（實(shí)線(xiàn)部分），細(xì)胞接觸區(qū)域產(chǎn)生的跨膜電壓略大于msPEF作用，而在細(xì)胞兩極的跨膜電壓則僅為0.3～0.5V，遠(yuǎn)小于細(xì)胞膜的穿孔閾值。

圖5 細(xì)胞膜跨膜電壓分布情況

2.2 穿孔密度仿真分析

當(dāng)細(xì)胞跨膜電壓達(dá)到穿孔閾值時(shí)，會(huì)在膜上誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的親水孔，這些孔洞的產(chǎn)生與分布和所施加的脈沖參數(shù)密切相關(guān)。本節(jié)分別選取細(xì)胞模型的兩個(gè)極點(diǎn)以及接觸區(qū)域的中點(diǎn)（見(jiàn)圖3）來(lái)研究脈沖作用時(shí)膜上孔密度隨時(shí)間的變化情況，并分析脈沖作用結(jié)束后發(fā)生顯著穿孔（孔密度＞1×1013/m2）的區(qū)域[19,32]。

圖6為msPEF及納/微秒復(fù)合脈沖分別誘導(dǎo)細(xì)胞融合產(chǎn)生的孔密度隨時(shí)間的變化情況。由圖6a可見(jiàn)，msPEF單獨(dú)作用時(shí)，前3ms孔密度并沒(méi)有發(fā)生明顯變化，隨后B點(diǎn)（見(jiàn)圖3）率先出現(xiàn)穿孔，并于7ms左右率先達(dá)到了顯著穿孔臨界點(diǎn)，并最終維持在2.5×1014/m2左右。隨著脈沖的持續(xù)作用，兩級(jí)位置的孔密度分別于8ms（A點(diǎn)）和10ms（C點(diǎn)）開(kāi)始增加，并先后超過(guò)了1×1013/m2，但上升趨勢(shì)較緩，最終穩(wěn)定的孔密度在1013/m2量級(jí)，略小于接觸區(qū)域孔密度。

納/微秒復(fù)合脈沖作用下的細(xì)胞膜穿孔情況如圖6b所示。由圖可見(jiàn)，在nsPEF作用時(shí)間段（前5ms），細(xì)胞膜接觸區(qū)域的孔密度迅速上升，并最終穩(wěn)定在1.17×1015/m2，在此期間，兩極位置的孔密度幾乎沒(méi)有變化。隨著msPEF的施加，A點(diǎn)和C點(diǎn)的孔密度開(kāi)始緩慢增加，增加的速率明顯小于單msPEF作用結(jié)果，直至脈沖施加結(jié)束，兩極的孔密度均沒(méi)有超過(guò)1×1013/m2，而B(niǎo)點(diǎn)的孔密度在msPEF作用下一直保持到脈沖作用結(jié)束。

圖6 細(xì)胞膜孔密度隨時(shí)間變化情況

顯著穿孔分布如圖7所示。為了更加直觀(guān)地展示細(xì)胞膜上顯著穿孔的分布，在圖7中將膜上孔密度大于1×1013/m2的區(qū)域用粗實(shí)線(xiàn)標(biāo)出。由圖7a可知，msPEF作用下，細(xì)胞膜表面約有10%的膜區(qū)域發(fā)生了顯著穿孔，除了接觸區(qū)域，細(xì)胞的左右兩極也發(fā)生了大面積的顯著穿孔，且靠近正電極的左側(cè)極點(diǎn)區(qū)域的顯著穿孔面積要大于靠近接地電極的右側(cè)極點(diǎn)區(qū)域。而納/微秒復(fù)合脈沖作用下（見(jiàn)圖7b），細(xì)胞膜顯著穿孔都集中在細(xì)胞膜接觸區(qū)域，其余區(qū)域并沒(méi)有發(fā)生顯著穿孔。

圖7 顯著穿孔分布

仿真結(jié)果表明，納/微秒復(fù)合脈沖這種脈沖組合方式能有效地將穿孔集中于細(xì)胞接觸區(qū)域并可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)有效地維持，而對(duì)其余膜區(qū)域的影響較小。從理論上分析，該現(xiàn)象有利于降低融合細(xì)胞的死亡率，提高細(xì)胞的融合效率。

2.3 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

使用已經(jīng)過(guò)Hoechst 33342染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行電融合實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行脈沖處理前需先施加20s的高頻正弦電壓（100V/cm，1MHz）進(jìn)行細(xì)胞排隊(duì)，正弦電壓作用結(jié)束后在較短時(shí)間內(nèi)切換為脈沖電壓誘導(dǎo)細(xì)胞融合。細(xì)胞在電處理結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)10min，再經(jīng)過(guò)PI染色，即可分別獲取經(jīng)Hoechst和PI染色的細(xì)胞明場(chǎng)圖像及紅色和藍(lán)色的細(xì)胞熒光圖像。每種脈沖施加方案分別進(jìn)行四組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行融合細(xì)胞、死亡細(xì)胞及細(xì)胞總量的計(jì)數(shù)，取平均數(shù)計(jì)算各組細(xì)胞融合率和死亡率。

實(shí)驗(yàn)中獲得的細(xì)胞排隊(duì)圖像及熒光成像結(jié)果如圖8所示，其中，圖8a為細(xì)胞排隊(duì)圖像，在交變電壓導(dǎo)致的介質(zhì)電泳效應(yīng)作用下，細(xì)胞沿電場(chǎng)方向排列成珍珠串狀。圖8b為假處理對(duì)照組，該組不進(jìn)行脈沖處理，其余步驟及培養(yǎng)時(shí)間均與實(shí)驗(yàn)組相同。圖8c和圖8d分別為總劑量為286kV2·ms/cm2的msPEF和復(fù)合脈沖作用電融合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8 熒光染色實(shí)驗(yàn)成像

圖9 細(xì)胞融合率、死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

msPEF和納/微秒復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合時(shí)，細(xì)胞死亡率的變化情況如圖9b所示。由對(duì)照組死亡率可知，細(xì)胞排隊(duì)所用的高頻正弦電壓也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定傷害，死亡率約為6%；在單msPEF作用時(shí)，隨著脈沖劑量的上升，細(xì)胞死亡率從19.12%上升到了27.83%、53.16%，死亡率增長(zhǎng)十分顯著；而納/微秒復(fù)合脈沖作用下，隨著脈沖劑量的提升，細(xì)胞的死亡率分別為13.58%、9.76%、39.35%。由此可見(jiàn)，相較于單個(gè)較高幅值的msPEF，高幅值nsPEF結(jié)合較低幅值的msPEF這種脈沖施加方式能夠顯著降低細(xì)胞死亡率，并且在一定的脈沖劑量范圍內(nèi)，復(fù)合脈沖作用下的細(xì)胞死亡率不會(huì)隨著劑量的增加發(fā)生明顯變化。

3 討論

外加脈沖電場(chǎng)會(huì)改變細(xì)胞膜內(nèi)外原有的離子分布狀態(tài)，造成跨膜電壓的變化。而跨膜電壓的提高會(huì)降低膜脂重排所需的能量，從而導(dǎo)致親水孔的形成[36]。通過(guò)分析細(xì)胞膜上跨膜電壓分布（見(jiàn)圖5）可知，持續(xù)時(shí)間足夠短的脈沖（納秒級(jí)別）可以在細(xì)胞膜接觸區(qū)域有選擇性地進(jìn)行大量穿孔，通過(guò)計(jì)算脈沖作用引起的跨細(xì)胞膜的孔密度變化進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)（見(jiàn)圖6）。在脈寬40ms的msPEF作用下，細(xì)胞膜接觸區(qū)域的電穿孔同時(shí)伴隨著細(xì)胞兩極區(qū)域的較大范圍穿孔（見(jiàn)圖7a），靠近正極板的細(xì)胞左極由于靜息電位的影響比右極附近區(qū)域穿孔更加嚴(yán)重[37]。而在脈沖劑量相同的情況下，先施加5個(gè)高幅值nsPEF，再使用低幅值msPEF作用只會(huì)導(dǎo)致接觸區(qū)域發(fā)生顯著電穿孔，對(duì)細(xì)胞膜上其他區(qū)域則影響較?。ㄒ?jiàn)圖7b）。過(guò)度的細(xì)胞電穿孔容易導(dǎo)致細(xì)胞死亡，本文的數(shù)值仿真結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，單msPEF作用時(shí)，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的高死亡率相一致。

有研究表明[24, 38]，細(xì)胞膜上的電穿孔數(shù)量由施加脈沖的幅值決定，而孔洞的尺寸則更多受脈沖施加時(shí)間的影響。在較高幅值的納秒級(jí)別脈沖作用下，孔隙的生成速率會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于孔擴(kuò)張的速率（超穿孔現(xiàn)象），但較短的脈沖持續(xù)時(shí)間不足以支撐孔的擴(kuò)張，生成的微孔半徑僅為0.8nm左右，且極容易重新封閉。根據(jù)電融合基本條件，細(xì)胞融合過(guò)程的持續(xù)時(shí)間約為數(shù)分鐘[39]，在這個(gè)過(guò)程中需要微孔一直保持“打開(kāi)”的狀態(tài)才能保證細(xì)胞的成功融合，若通過(guò)提高nsPEF的頻率和數(shù)量來(lái)延長(zhǎng)孔隙的維持時(shí)間，則可能因?yàn)閚sPEF的高頻透膜性誘導(dǎo)其他生物效應(yīng)的產(chǎn)生而對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響[40-41]。因此，本文利用msPEF僅靶向作用細(xì)胞膜的特點(diǎn)[42]，對(duì)已經(jīng)生成的孔隙進(jìn)行維持和擴(kuò)張。低幅值msPEF作用產(chǎn)生的跨膜電壓很難達(dá)到穿孔閾值，因此不易在其他區(qū)域產(chǎn)生大面積穿孔，造成細(xì)胞死亡。

本文對(duì)SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行了電融合實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證nsPEF協(xié)同msPEF進(jìn)行細(xì)胞電融合的可行性。圖9表明，在SP2/0細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合脈沖作用的細(xì)胞融合效率普遍大于傳統(tǒng)msPEF作用結(jié)果，而細(xì)胞死亡率則普遍小于msPEF作用結(jié)果，該現(xiàn)象證實(shí)本文提出的納/微秒復(fù)合脈沖協(xié)同作用的細(xì)胞電融合效率高于傳統(tǒng)微秒脈沖。與msPEF作用相似，隨著脈沖劑量的增加，復(fù)合脈沖作用下細(xì)胞融合效率也經(jīng)歷了先增大后減小的過(guò)程，但通過(guò)細(xì)胞死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，復(fù)合脈沖作用時(shí)，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)細(xì)胞死亡率不會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的提升而發(fā)生顯著改變。此現(xiàn)象說(shuō)明，納/微秒復(fù)合脈沖可以在提高細(xì)胞融合效率的同時(shí)不增加細(xì)胞的死亡率。

若將本文的研究?jī)?nèi)容擴(kuò)展到實(shí)際應(yīng)用中，可為脈沖組合的選取提供依據(jù)和理論支撐。本實(shí)驗(yàn)中所采用的5個(gè)脈寬200ns，電場(chǎng)強(qiáng)度6kV/cm的nsPEF結(jié)合1個(gè)脈寬40ms，電場(chǎng)強(qiáng)度2.5kV/cm的msPEF的復(fù)合脈沖組合方式雖然已經(jīng)超過(guò)了傳統(tǒng)msPEF的電融合效率，但是并沒(méi)有考慮到脈沖參數(shù)的優(yōu)化問(wèn)題，40ms的微秒脈沖也僅為細(xì)胞融合儀推薦使用的脈沖參數(shù)，并不一定為復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合的最優(yōu)脈沖參數(shù)，最優(yōu)脈沖組合問(wèn)題仍需后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。另一方面，本文僅通過(guò)細(xì)胞融合率來(lái)表征復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合的結(jié)果，而在實(shí)際雜交瘤制備過(guò)程中，融合的細(xì)胞不一定都能有效存活并發(fā)展成為雜交瘤細(xì)胞，因此，在后續(xù)研究中需要引入雜交瘤培養(yǎng)技術(shù)，來(lái)探究納/微秒復(fù)合脈沖電融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的實(shí)際生產(chǎn)效率。

4 結(jié)論

本文從數(shù)值仿真和實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)方面，開(kāi)展了納/微秒復(fù)合脈沖作用細(xì)胞電融合融合效率及細(xì)胞死亡率的研究，證明了該融合方法提高細(xì)胞融合效率、降低細(xì)胞死亡率的可行性。

對(duì)脈沖作用下細(xì)胞跨膜電壓分布及穿孔動(dòng)態(tài)過(guò)程的仿真研究中，發(fā)現(xiàn)納/微秒復(fù)合脈沖具有明顯的細(xì)胞接觸區(qū)域靶向穿孔的特性，能夠?qū)⒋┛准杏诩?xì)胞接觸位置并維持較長(zhǎng)時(shí)間，而對(duì)細(xì)胞膜其他區(qū)域的影響較小。該研究結(jié)果證明，納/微秒復(fù)合脈沖能夠結(jié)合兩種脈沖各自的優(yōu)勢(shì)，避免了高幅值微秒脈沖作用下細(xì)胞膜過(guò)度穿孔情況的出現(xiàn)。通過(guò)SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)納/微秒復(fù)合脈沖與微秒脈沖相比，可以降低細(xì)胞死亡率，提高細(xì)胞融合效率。同時(shí)，該融合方法的作用效果同樣對(duì)脈沖劑量具有一定的依賴(lài)性，最優(yōu)的電融合脈沖組合仍需進(jìn)一步探索。

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Mi Yan, Li Pan, Liu Quan, et al. Dose effect of the activity of skin cancer cells treated by nanosecond pulsed electric field combined with multi-walled carbon nanotubes[J]. Transactions of China Elec- trotechnical Society, 2019, 34(22): 4849-4857.

[41] 米彥, 劉權(quán), 李盼, 等. 低強(qiáng)度納秒脈沖電場(chǎng)聯(lián)合靶向金納米棒對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞的殺傷效果研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2020, 35(12): 2534-2544.

Mi Yan, Liu Quan, Li Pan, et al. Study of killing effects of A375 melanoma cells treated by low intensity nanosecond pulsed electric fields combined with targeted gold nanorods[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2019, 35(12): 2534-2544.

[42] 姚陳果, 寧郡怡, 劉紅梅, 等. 微/納秒脈沖電場(chǎng)靶向不同尺寸腫瘤細(xì)胞內(nèi)外膜電穿孔效應(yīng)研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2020, 35(1): 115-124.

Yao Chenguo, Ning Junyi, Liu Hongmei, et al. Study of electroporation effect of different size tumor cells targeted by micro-nanosecond pulsed electric field[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2020, 35(1): 115-124.

Simulation and Experimental Research on Improving the Efficiency of Cell Electrofusion by Nano-Microsecond Pulsed Electric Fields

（State Key Laboratory of Power Transmission Equipment & System Security and New Technology Chongqing University Chongqing 400030 China）

Cell electrofusion technology is usually performed by short-term high-voltage electrical pulses with a duration of microseconds to induce cell electroporation. However, exposure to high amplitude microsecond pulses can easily lead to excessive cell electroporation while promoting cell electrofusion, resulting in the death of the fused cells, thereby limiting the efficiency of cell fusion. To increase the rate of cell electrofusion, this paper proposes a method of synergistic induction of cell electrofusion by combining nanosecond and microsecond pulsed electric fields, based on the phenomenon of “super-electroporation” induced by nanosecond pulsed electric field. In this paper, SP2/0 mouse myeloma cells are used as the experimental object. The COMSOL software is used to analyze the distribution of transmembrane voltage and electroporation density on the cell membrane under the exposure of the composite pulse, and preliminary electrofusion experiments are performed to explore the mortality and fusion rate of the fusion method. The simulation results show that under the traditional microsecond pulse, the transmembrane voltage across the two poles of the membrane and the contact area both exceed the perforation threshold, and the significant perforation area exceeds 10%. Besides, under the action of the same dose of nano/microsecond composite pulse, the transmembrane voltage only reaches a higher value in the cell contact area, and the electroporation is also concentrated in this area. Experimental results also prove that this method can guarantee a lower mortality rate (10%) while achieving a higher cell fusion efficiency (75%), which provides new ideas for the further development of cell electrofusion technology.

Cell electrofusion, nano-microsecond pulsed electric fields, fusion efficiency, transmembrane voltage, electroporation density

10.19595/j.cnki.1000-6753.tces.201315

TM11; TM836; Q64

李成祥 男，1979年生，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)中的電工新技術(shù)、脈沖強(qiáng)磁場(chǎng)工業(yè)應(yīng)用技術(shù)及電力設(shè)備在線(xiàn)監(jiān)測(cè)及故障診斷。E-mail: lichengxiang@cqu.edu.cn（通信作者）

李新皓 男，1997年生，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)中的電工新技術(shù)。E-mail: lixinhao@cqu.edu.cn

2020-09-29

2021-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金專(zhuān)項(xiàng)基金（81727802）和國(guó)家自然科學(xué)基金面上（51677017）資助項(xiàng)目。

（編輯 崔文靜）