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    川芎嗪聯(lián)合CIK細胞對裸鼠肝癌HepG2細胞的影響*

    2019-07-17 05:56:32盧彥達曾江正桑圣剛
    中國藥業(yè) 2019年14期
    關(guān)鍵詞:微絲細胞骨架肌動蛋白

    黃 芬,王 波,盧彥達,曾江正,桑圣剛

    (1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,海南 ???570102; 2.海南省人民醫(yī)院,海南 ???570102)

    川芎主要成分為川芎嗪,具有活血行氣、祛風止痛功效,臨床多用于治療瘀血阻滯的各種病癥,稱為“血中氣藥”[1]。細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞是新型免疫活性細胞,增殖能力強,細胞毒作用強,具有一定的免疫特性,擬用于心血管、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)疾病的治療[2-3]。本研究中分析了川芎嗪聯(lián)合CIK細胞對裸鼠肝癌HepG2細胞的影響。現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 動物、細胞、儀器與試藥

    動物:裸鼠 46 只,雄性,(5.5±0.67)周齡,體質(zhì)量175~225 g,由南華大學醫(yī)學院動物實驗中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2004-0009。在無特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng),自由進食、飲水,適宜溫度、濕度,人工黑暗和光照交替。

    細胞:HepG2細胞(上海紀寧實業(yè)有限公司);PB003F-C單個核細胞(美國Allcells公司)。

    儀器:HN-25S型CO2恒溫培養(yǎng)箱(青島聚創(chuàng)世紀環(huán)??萍加邢薰荆?;IN Cell Analyzer 2500HS型高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)(美國 Molecular Devices公司);xCELLigence RTCA SP型實時無標記細胞功能分析儀(美國 ACEA Biosciences公司);LWD300-38LT型倒置生物顯微鏡(西安測維光電技術(shù)有限公司)。

    試藥:鹽酸川芎嗪氯化鈉注射液(湖南康都制藥有限公司,國藥準字H20041437,規(guī)格為每100 mL含鹽酸川芎嗪40 mg);細胞遷移分析試劑盒(美國Biovision公司,貨號為K906-100);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司);4%多聚甲醛(美國Sigma公司);注射用氨西林鈉(湖南科倫制藥有限公司,國藥準字H43022217,規(guī)格為每支1.0g);其余試劑均為分析純。

    1.2 方法

    HepG2細胞培養(yǎng):將HepG2細胞接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),壁貼,放置2~3 d。

    CIK細胞培養(yǎng):用完全培養(yǎng)液(100 mL/L胎牛血清,50 mg/L 注射用氨西林鈉,10 mmol/L Hepes緩沖液,50 μmol/L 2-疏基乙醇)將外周血單個核細胞(PBMC)密度調(diào)至 1.5 ×109/L,在 CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,即得CIK細胞。

    模型建立及分組、給藥:取對數(shù)生長期的HepG2細胞進行試驗。將HepG2細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后接種于裸鼠皮下,其消化過程為將無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞并接種于事先預備的孔板上,再將培養(yǎng)板置其上作用30 min后注入裸鼠皮下。建模成功后,按隨機數(shù)字表法分為川芎嗪50 mg/L聯(lián)合CIK細胞組(A組)、川芎嗪100 mg/L聯(lián)合CIK細胞組(B組)和川芎嗪200 mg/L聯(lián)合CIK細胞組(C組),各12只,灌胃給藥3次,間隔8 h;經(jīng)尾靜脈一次性輸注1.5×107個CIK細胞。另將10只建模成功裸鼠設(shè)為模型組(D組)。

    1.3 觀察指標

    細胞侵襲和遷移能力:采用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度后再次加入細胞懸液,培養(yǎng)24 h,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,重復2次,加4%多聚甲醛固定15 min,染色,顯微鏡下觀察細胞遷移情況,并計算遷移抑制率。細胞遷移抑制率=(D組遷移或侵襲細胞數(shù)-用藥組遷移或侵襲細胞數(shù))/D組遷移或侵襲細胞數(shù)×100%。

    基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)蛋白水平:采用流式細胞儀檢測,激發(fā)波長為488 nm,采用Expo 32 ADC系統(tǒng)分析免疫熒光數(shù)據(jù),結(jié)果均取平均值[4]。

    細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲:采用IN Cell Analyzer 2500HS高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)檢測,取消毒后的鈦板,置一次性培養(yǎng)皿中,接種細胞懸液8 mL,培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至一次性培養(yǎng)皿中用PBS清洗,清洗2次后采用封閉液封閉60 min后染色,采用顯微鏡觀察,采用Leica TCS軟件測量視野中細胞的鋪展面積。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示,行t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,行 χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細胞侵襲和遷移能力

    與D組比較,B組和C組遷移和侵襲細胞顯著減少,抑制率顯著升高(P<0.05)。詳見表 1。隨著時間的增加,A組、B組和C組細胞遷移數(shù)均明顯低于D組,且C組<B組<A組,遷移率與時間及劑量呈正相關(guān)。詳見圖 1 和表 2。

    表1 各組細胞侵襲和遷移能力比較(±s)

    表1 各組細胞侵襲和遷移能力比較(±s)

    注:與D組比較,#P<0.05。下表同。

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    表2 各組細胞侵襲情況比較( ± s,個/視野)

    表2 各組細胞侵襲情況比較( ± s,個/視野)

    組別A組B組C組D組質(zhì)量濃度(mg/L)50 100 200 24 h 0.47±0.11 0.44±0.09 0.45±0.13 0.36±0.13 48 h 1.69±0.15#1.69±0.14#1.71±0.16#1.24±0.16 72 h 2.39±0.19#2.41±0.20#2.40±0.21#1.51±0.20

    2.2 MMP-2和TIMP-2蛋白表達水平

    與D組比較,A組、B組、C組細胞MMP-2蛋白表達顯著降低,TIMP-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。詳見表 3。

    2.3 細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲

    與D組比較,A組、B組、C組細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積顯著縮?。≒<0.05)。詳見表 3。

    3 討論

    侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展過程中的危險階段,一旦出現(xiàn)將對預后造成嚴重影響[5]。細胞黏附性喪失及細胞骨架重建均會導致細胞運動和遷移[6-7]。川芎為無色針狀結(jié)晶,對心臟、血管(尤其是冠狀動脈)及腦部等部位病變有一定改善作用[8]。川芎嗪能抑制乳腺癌、肺癌細胞的體外增殖,作用機制為抑制腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤細胞繁殖及逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性等[9]。CIK細胞是影響腫瘤的歸巢能力及異常腫瘤微環(huán)境的重要因素[10]。

    表3 各組細胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表達水平及細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積比較(±s)

    表3 各組細胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表達水平及細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積比較(±s)

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    本研究結(jié)果顯示,隨川芎嗪質(zhì)量濃度的增加,HepG2細胞侵襲和遷移能力逐漸降低,且川芎嗪聯(lián)合CIK細胞作用72 h后抑制細胞侵襲能力明顯強于24 h后,說明川芎嗪可抑制HepG2細胞的遷移及侵襲,進而具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。A組、B組、C組的MMP-2蛋白表達水平均明顯低于D組,但TIMP-2蛋白表達水平均明顯高于D組,顯示MMP-2表達量降低時,TIMP-2表達量會隨之升高。細胞骨架是由蛋白纖維交織而成的立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu),并充滿整個細胞質(zhì),細胞骨架與細胞膜及核膜存在結(jié)構(gòu)聯(lián)系,能保持細胞形狀,且細胞骨架與細胞運動具有一定聯(lián)系;微管、微絲和纖維是組成細胞骨架主要結(jié)構(gòu),微絲在腫瘤細胞中被修飾,與腫瘤細胞生長特點相關(guān),而肌動蛋白是構(gòu)成微絲的主要成分,在細胞遷移及侵襲中起至關(guān)重要的作用[11]。本研究中,A組、B組、C組裸鼠的細胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積明顯小于D組,川芎嗪聯(lián)合CIK細胞能降低肝癌HepG2細胞骨架面積,可通過調(diào)節(jié)細胞松弛素達到減少微絲形成的目的,但川芎嗪聯(lián)合CIK細胞是否可以獲得新的間質(zhì)表型仍有待研究。

    綜上所述,川芎嗪聯(lián)合CIK細胞能抑制裸鼠HepG2細胞遷移及侵襲,作用機制可能與下調(diào)細胞MMP-2和上調(diào)TIMP2蛋白表達,以及抑制骨架微絲重排有關(guān)。

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