延夢瑤, 沈 文*, 劉樹興, 葛雪梅, 敖 芬, 吳立新
(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.南京林業(yè)大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院, 江蘇 南京 210037)
冷鮮肉是畜禽屠宰后經(jīng)過冷卻工藝處理,并在經(jīng)營過程中環(huán)境溫度始終保持0 ℃~4 ℃的肉[1].然而,制冷條件不能完全抑制微生物的生長和繁殖,大量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)容易氧化變質(zhì),很難達(dá)到較長的保質(zhì)期[2].因此,必須采用簡單的加工和包裝,以保持產(chǎn)品良好的外觀和屬性,延長其貨架期.
近年來,可食用膜[3,4]被人們所關(guān)注到,它在滿足冷鮮肉需求和延長其貨架期中有巨大的潛力,它不影響冷鮮肉的再分割與烹調(diào),方便了冷鮮肉的加工.因此,冷鮮肉的抗氧化可食用薄膜的開發(fā)越來越受到重視[5-8].此外,由于與原始食品成分的相互作用,將抗氧化劑直接添加到食品中可能導(dǎo)致其快速氧化降解.納米粒子可以提供高負(fù)載能力和穩(wěn)定性、持續(xù)釋放以及跨細(xì)胞膜和生物屏障攜帶親水性和親脂性物質(zhì)的能力[9],有利于抗氧化劑作用于冷鮮肉時發(fā)揮更優(yōu)作用.張力[10]用自組裝制備丁香酚納米微粒應(yīng)用于冷鮮肉,發(fā)現(xiàn)丁香酚具有抗氧化活性,能有效防止豬肉中肌球蛋白的交聯(lián)變性,抑制其持水力下降,對冷鮮肉的貯藏保鮮有改善作用.利用納米技術(shù)開發(fā)綠色、可食的材料,不僅可以保護(hù)食物感官特性,還能保證營養(yǎng)價值,延長貨架期[11].從Sekhon[12]的研究中發(fā)現(xiàn),將納米粒子加入可食用膜中具有雙重優(yōu)勢:一是對于食物來說,食品表面的氧化作用最為強(qiáng)烈,納米粒子的加入能夠提高食品包裝材料的性能,并能夠持續(xù)釋放針對食品表面的抗氧化劑.二是從包裝材料中控制釋放抗氧化劑可以延長食品的保質(zhì)期.因此,利用納米技術(shù),開發(fā)出一種含抗氧化劑納米粒的抗氧化可食用膜可以被認(rèn)為是克服這些限制的新策略.
本研究利用殼聚糖(Chitosan,CS)和三聚磷酸鈉(Sodium tripolyphosphate,TPP)之間的離子交聯(lián)作用,以疏水性多酚結(jié)構(gòu)的姜黃素(Curcumin,Cur)為功能因子制備了姜黃素納米粒子(Curcumin nanoparticles,CNPs).選用具有良好阻隔性能和機(jī)械性能的羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl cellulose,CMC)作為成膜材料,將CNPs加入CMC膜中制備了抗氧化羧甲基纖維素可食用膜(CMC/CNPs).研究了不同濃度CNPs加入CMC薄膜中對厚度、力學(xué)性能的影響,并用掃描電鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜(FTIR)和X-射線衍射(XRD)對其進(jìn)行表征,并評價了其抗氧化活性和探究了不同相對濕度(Relative humidity,RH)對Cur在CMC/CNPs膜中釋放的影響.
1.1.1 主要材料
姜黃素(Cur,純度≥98.0 %,博美生物技術(shù)有限公司);殼聚糖,食品級,購買于青島金華甲殼制品有限公司;羧甲基纖維素鈉,食品級,購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三聚磷酸鈉、甘油、聚乙二醇400、無水乙醇、硝酸鎂、氯化鈉,分析純,購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司.
1.1.2 主要儀器
AI-7000-NGD伺服高低溫控制多功能拉力試驗機(jī),上海發(fā)瑞儀器科技有限公司;X射線衍射儀,日本理學(xué)Rigaku公司;S4800場發(fā)射掃描電鏡,日本理學(xué)Rigaku公司;VECTOR-22傅立葉紅外光譜儀,德國布魯克Bruker公司;UV-1800型紫外可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司等.
1.2.1 CNPs的制備
將適量的Cur粉末溶于無水乙醇中,制備不同濃度的Cur溶液.稱取0.900 g CS粉末溶于100 mL的1%的醋酸溶液中配置0.9%的CS溶液,稱取1.200 g的TPP粉末溶于100 mL的容量瓶中制備濃度為1.2%的TPP溶液.在高速攪拌條件下,取1 mL制備好的不同濃度Cur溶液加入到20 mL 0.9%的CS溶液中,形成混合溶液.在500 r/min的磁力攪拌下,通過恒流泵以3 mL/min向混合溶液中按1∶1(CS∶TPP)的體積比滴加1.2%的TPP溶液,CNPs自發(fā)形成.在機(jī)械攪拌30 min下獲得具有透明黃色的溶液,然后用4 000 r/min離心15 min獲得,隨后將該CNPs用于薄膜制備.
1.2.2 CMC/CNPs可食用膜的制備
首先,稱取2.000 g CMC粉末與100 mL蒸餾水混合,并在50 ℃下攪拌以使其完全溶解,同時,添加1 mL甘油和1 mL聚乙二醇400作為增塑劑形成混合溶液.將先前制備好的不同濃度的CNPs溶液(分別含有0.250 mg,0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg的Cur)以1∶10的體積比添加到混合溶液中.然后,繼續(xù)在50 ℃下攪拌1 h并通過超聲脫氣10 min獲得所需的薄膜溶液.最后,將成膜液通過流延法鋪于玻璃板上,在35 ℃下干燥24 h,揭下.在實(shí)驗使用之前,將取下的薄膜在干燥器(溫度25 ℃,RH為50 %)中平衡至少48 h.采用與對照相同的方法制備不含CNPs的空白CMC膜.CMC/CNPs可食用膜制備用量在表1中顯示.將用不同濃度CNPs溶液(分別含有0.250 mg,0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg的Cur)制備的CMC膜命名為CMC/CNPs-0.250,CMC/CNPs-0.375,CMC/CNPs-0.500,CMC/CNPs-0.625,CMC/CNPs-0.750.
表1 CMC/CNPs可食用膜的制備用量
1.3.1 厚度的測定
用厚度計(DR86,山東威海量具有限公司)測量薄膜厚度,將薄膜從玻璃板(25.4 mm×76.2 mm)上剝離,測量薄膜的厚度.在每個薄膜上隨機(jī)取五個位置進(jìn)行測量,至少重復(fù)3次,取平均值.
1.3.2 力學(xué)性能的測試
使用伺服高低溫控制多功能拉力試驗機(jī)(AI-7000-NGD,上海發(fā)瑞儀器科技有限公司)測量薄膜的抗拉強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長率(Eb).取薄膜樣品(76.2 mm×25.4 mm)放入伺服高低溫控制多功能拉力試驗機(jī)中,固定膜的上端與下端后,測試前在儀器上輸入膜的規(guī)格,然后對多功能拉力試驗機(jī)的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置,具體參數(shù)為:夾具距離為40 mm,標(biāo)點(diǎn)距離為40 mm,拉伸速率為 10 mm/min,這薄膜一直拉到破為止,對每個薄膜至少重復(fù)測量3次,取平均值.
1.3.3 SEM
通過掃描電子顯微鏡(S4800,日本理學(xué)Rigaku公司)觀察薄膜的表面形貌.將薄膜樣品粘貼在導(dǎo)電膠上,然后在薄膜上噴金處理,以觀察表面形態(tài).
1.3.4 FTIR
使用傅里葉變換紅外光譜儀(VECTOR-22,德國布魯克Bruker公司)對薄膜的基本結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行表征,采用薄膜法制樣,取相同厚度樣品,在50 ℃烘24 h后進(jìn)行測試以排除樣品質(zhì)量、含水量對測試的影響,掃描波長范圍4 000~500 cm-1,分辨率為4 cm-1.
1.3.5 XRD
使用X-射線衍射儀(Smart Lab 9kW,日本理學(xué)Rigaku公司)對薄膜進(jìn)行表征.將制備好的薄膜樣品裁剪成10 mm×10 mm的形狀,用膠帶固定在樣品架上,工作電壓和電流分別是40 kV、60 mA,樣品在散射角(2θ)范圍內(nèi),掃描速度為30 °/min,從5 °到60 °,掃描步長為0.01 °,在該條件下記錄數(shù)據(jù),得到薄膜樣品的圖譜.
通過DPPH自由基清除試驗測定CMC/CNPs可食用膜的自由基清除活性,首先,將7.8 mg DPPH試劑溶解在100 mL的無水乙醇中,制備2×10-4M的DPPH溶液.將CMC/CNPs可食用膜(10 mm×10 mm)放入50 mL的離心管中,依次加入2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液,將離心管避光儲存30 min,并用紫外可見分光光度計(UV-1800,上海美譜達(dá)儀器有限公司)在517 nm處測定所得溶液的吸光度.使用下面公式(1)來計算CMC/CNPs可食用膜的DPPH自由基清除活性:
(1)
式(1)中:A0為無膜的DPPH乙醇溶液的吸光度;Ai為CMC/CNPs膜的DPPH溶液吸光度.
大多數(shù)發(fā)表的研究都是模擬液體食品,而沒有在不同相對濕度條件下測試真正的食品.因此,本實(shí)驗設(shè)置不同相對濕度來研究CMC/CNPs可食用膜中Cur的釋放.室溫條件下(25 ℃),在密閉環(huán)境中分別使用硅膠、硝酸鎂、氯化鈉、水蒸汽制備飽和鹽溶液,將RH固定在25±5、50±5、75±5、95±5.將制得的CMC/CNPs-0.250,CMC/CNPs-0.375,CMC/CNPs-0.500,CMC/CNPs-0.625,CMC/CNPs-0.750可食用膜放入不同RH條件下自然釋放,隔0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、12 h、24 h、48 h、60 h用棉簽蘸取所有可食用膜表面的Cur,溶到5 mL的無水乙醇溶液中,超聲10 min加速溶解,再用紫外分光光度計在426 nm下測定Cur的吸光度,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Cur的含量,計算Cur的釋放率,對每個樣品進(jìn)行三次重復(fù).用下面公式(2)計算薄膜中Cur的累計釋放率:
(2)
式(2)中:mi是樣品中Cur的初始含量;V是稀釋Cur所用無水乙醇的體積(5 mL);Ci是求和公式中Cur的濃度變量;Cn是第n個樣品中Cur的濃度.
表2顯示了不同濃度CNPs的加入對CMC膜厚度和機(jī)械性能的影響.薄膜的厚度很大程度上取決于薄膜的性質(zhì)和組成,從表2可以看出CMC/CNPs可食用膜的厚度在0.117 mm到0.137 mm之間變化不大,加入CNPs會增加CMC膜的厚度.
薄膜的力學(xué)性能與聚合物薄膜中形成的網(wǎng)絡(luò)中分子間和分子內(nèi)的相互作用力有關(guān)[13].抗拉強(qiáng)度(TS)是通過測量拉伸應(yīng)力下試樣的斷裂點(diǎn)來確定的,作為承受拉力的能力,可以用來描述試樣的強(qiáng)度.斷裂伸長率(Eb)是試樣受到外力時,長度從其原始長度到斷裂點(diǎn)長度的延伸,這與聚合物材料的彈性有關(guān),可以用來描述試樣的柔韌性[14].表2統(tǒng)計比較了加入不同濃度CNPs的CMC膜的機(jī)械性能.從表2可以看出,與CMC膜相比,隨著CNPs濃度的增大,CMC/CNPs膜的TS從3.99±0.98 MPa增加到12.98±2.95 MPa,CMC/CNPs膜的Eb從16.55±2.91 %增加到27.24±1.38 %,TS的增加可能因為CNPs加入CMC的聚合物網(wǎng)絡(luò)中,減小了大分子鏈間的距離,使薄膜結(jié)構(gòu)更加緊湊.隨著CNPs濃度的增大,體系中氫鍵數(shù)目增多,分子內(nèi)和分子間的作用力增強(qiáng),使得CMC/CNPs膜的TS增大[15].Ruan等[16]研究發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯加入后通過氫鍵交聯(lián)海藻酸鈉和羧甲基纖維素,填補(bǔ)了海藻酸鈉和羧甲基纖維素骨架之間的空隙,形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而增加了可食用膜的TS.Nieto-Suaza等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)加入納米粒子后提高了淀粉膜的TS,是因為納米粒子具有高比表面積,尺寸小,淀粉納米粒子的表面含有大量羥基,與聚合物基質(zhì)形成更多的氫鍵,提高了納米粒子和聚合物基質(zhì)之間的相互作用,使得應(yīng)力從聚合物基質(zhì)轉(zhuǎn)移到納米粒子,從而增強(qiáng)了薄膜的強(qiáng)度.因此,加入CNPs后,CMC/CNPs膜的抗拉強(qiáng)度增加.
Eb值的增加表明CNPs的加入使CMC膜具有更高的柔韌性,膜配方成分甘油和聚乙二醇400在一定程度上也起到了增強(qiáng)薄膜流動性的作用.上述結(jié)果表明,在CMC膜液中加入CNPs,可以改善CMC膜的機(jī)械性能.此外,CNPs可能發(fā)揮增塑劑作用并增加聚合物的流動性.
表2 CMC/CNPs可食用膜的厚度和機(jī)械性能
采用SEM觀察CMC膜和CMC/CNPs-0.250膜的表面形貌,如圖1(a)所示,CMC膜表面雖有褶皺產(chǎn)生,但無裂痕,無孔洞,可能是因為在干燥過程中由于水分蒸發(fā)而發(fā)生了皺縮.然而,CMC/CNPs-0.250(圖1(b))膜褶皺減少,能看見凸起的小顆粒,可能是因為在干燥過程中納米粒子中的Cur釋放了出來,然而,這種形貌并沒有降低CMC/CNPs-0.250膜的機(jī)械性能.結(jié)果表明,添加CNPs會影響CMC膜的形貌,但是沒明顯的相分離現(xiàn)象.
(a)CMC膜 (b)CMC/CNPs-0.250膜圖1 CMC膜和CMC/CNPs-0.250膜的SEM圖
薄膜的FTIR光譜在4 000~500 cm-1范圍內(nèi)如圖2所示.由圖2可知,F(xiàn)TIR光譜圖用于表征CMC膜和CMC/CNPs膜中官能團(tuán)的變化.CMC膜在3 404 cm-1、2 910 cm-1、1 654 cm-1、1 430 cm-1、1 091 cm-1波長處有特征峰,CMC/CNPs-0.250膜在3 440 cm-1處的特征峰與-OH基團(tuán)的伸縮振動和分子間和分子內(nèi)氫鍵的作用有關(guān)[18].隨著CNPs的加入,拉伸頻率向更高的波長移動(3 404 cm-1到3 440 cm-1),峰值變寬,隨著CNPs濃度的增大,該處的特征峰變的更寬更清晰,振幅逐漸增大.結(jié)果表明,所制備的CMC/CNPs膜中具有較強(qiáng)的-OH基團(tuán),分子間和分子內(nèi)的氫鍵作用增強(qiáng).CMC/CNPs-0.250膜在2 925 cm-1處的特征峰與C-H的伸縮振動有關(guān),在1 660 cm-1和1 448 cm-1附近處的特征峰分別歸因于不對稱COO-的伸縮振動和對稱COO-的伸縮振動[16],峰值變小.在1 105 cm-1附近處的特征峰與醚鍵的不對稱伸縮振動有關(guān)[6].此外,在CMC/CNPs膜的紅外光譜圖中,沒有觀察到額外的峰.這些結(jié)果表明,CNPs和CMC之間存在相互作用,CNPs主要為薄膜提供-OH基團(tuán),分子間和分子內(nèi)的氫鍵作用增強(qiáng),分子間作用力增大,有利于CMC/CNPs膜的力學(xué)性能增強(qiáng),這與力學(xué)性能表征結(jié)果保持一致.
a:CMC;b:CMC/CNPs-0.250; c:CMC/CNPs-0.375;d:CMC/CNPs-0.500;e:CMC/CNPs-0.625;f:CMC/CNPs-0.750圖2 CMC/CNPs膜的傅里葉紅外圖譜
圖3顯示了不同濃度CNPs嵌入CMC膜的X射線衍射圖.由圖3可知,對于CMC膜衍射圖譜,CMC膜在 15~28 °處出現(xiàn)寬峰,說明CMC存在非晶體結(jié)構(gòu)[19].在 CMC 膜中加入不同濃度CNPs后,沒有觀察到任何新的特征峰,CMC/CNPs-0.250,CMC/CNPs-0.375,CMC/CNPs-0.500,CMC/CNPs-0.625,CMC/CNPs-0.750膜的 XRD 圖譜與 CMC膜的幾乎是一樣的.結(jié)果表明:CMC的無定形結(jié)構(gòu)并沒有受CNPs加入的影響.
圖3 CMC/CNPs膜的X-射線衍射圖譜
圖4顯示了在RH為25±5、50±5、75±5、95±5條件下CMC/CNPs-0.250、 CMC/CNPs-0.375、CMC/CNPs-0.500、CMC/CNPs-0.625、CMC/CNPs-0.750膜中Cur的釋放特性曲線.圖4(a)顯示的是CMC/CNPs-0.250膜在不同RH下的釋放曲線.由圖可以看出,在RH為95±5的條件下,在前2 h內(nèi)迅速上升,釋放率達(dá)到47.81%,在接下來的2天內(nèi)持續(xù)釋放,釋放率到81.41%,低于最初2個小時內(nèi)的釋放率.在RH為75±5的條件下,CMC/CNPs膜中Cur的釋放率在前2 h為18.82%,在隨后的2天內(nèi)的釋放率達(dá)到52.62%,高于前2 h的釋放率.在RH為50±5的條件下,CMC/CNPs膜中Cur的釋放率在前2 h內(nèi)為14.93 %,在之后的2天內(nèi),釋放率上升到41.67 %.在RH為25±5的條件下,CMC/CNPs膜中Cur的釋放率相對較低,呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢,在前2 h內(nèi)釋放率為1.56%,在之后的2天內(nèi),釋放率保持平穩(wěn)達(dá)到6.5 %,但相對高于前2 h內(nèi)的釋放率.結(jié)果表明,RH越大,Cur在前2 h內(nèi)的釋放率越大,可能是因為密閉環(huán)境中的水分子滲透到薄膜的表面,薄膜開始溶脹,使得Cur更容易釋放出來.
水分子能夠降低生物材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度并增加其自由體積,因此,它可以被歸類為“天然”的增塑劑.在Barbut等[20]的研究中發(fā)現(xiàn),RH可能會影響薄膜的機(jī)械性能,是因為薄膜中的水具有塑化作用.在Kurek等[21]的研究中也發(fā)現(xiàn)RH對香芹酚的釋放有影響是因為殼聚糖基質(zhì)被水塑化,水滲透到薄膜表面,薄膜表面開始出現(xiàn)裂縫,從而釋放香芹酚.此外,Benbettaieb等[22]發(fā)現(xiàn)水可以輕松且緊密地與極性或親水性生物聚合物結(jié)合,當(dāng)水占據(jù)高能極性結(jié)合位點(diǎn)時,它不容易被其他物質(zhì)替換.因此當(dāng)環(huán)境中的RH較高時,水蒸氣的積累導(dǎo)致活性物質(zhì)的釋放.
從圖4(b)~(e)可以看出,CMC/CNPs-0.375、CMC/CNPs-0.500、CMC/CNPs-0.625、CMC/CNPs-0.750膜中Cur的釋放模式幾乎相似,其特征是在RH為95±5的條件下前2 h內(nèi)Cur的釋放率迅速上升,在之后的2天內(nèi)持續(xù)釋放.在RH為25±5、50±5、75±5的條件下,CMC/CNPs膜中Cur在前2 h的釋放率低于在后2天內(nèi)的釋放率,呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢.這是因為Cur被包埋形成納米粒子,同時CMC的存在增加了Cur擴(kuò)散路徑的曲折性,增加了薄膜結(jié)構(gòu)的緊湊性,從而阻礙了Cur的釋放.而隨著時間的延長,膜的結(jié)構(gòu)可能更加疏松,導(dǎo)致分子間的作用力大大降低,Cur也被更多得釋放出來.由此可以看出,RH對活性物質(zhì)的釋放影響很大,當(dāng)包裝置于RH較高的地方時,尤其是冷鮮肉,水蒸氣的積累會誘導(dǎo)活性物質(zhì)的釋放,活性物質(zhì)包埋形成納米粒子的形式加入到成膜溶液中可以延緩它的釋放,從而實(shí)現(xiàn)其功能效果.
(a)CMC/CNPs-0.250
(b)CMC/CNPs-0.375
(c)CMC/CNPs-0.500
(d)CMC/CNPs-0.625
(e)CMC/CNPs-0.750圖4 不同濕度下Cur的釋放圖
抗氧化活性是檢測薄膜的重要指標(biāo),本研究采用DPPH自由基清除活性檢測不同濃度CMC/CNPs膜的抗氧化活性.在溫度為25 ℃、RH為75的條件下,以分別添加0.250 mg,0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg Cur的CMC膜作為對照組.從圖5可以看出,CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除活性隨著CNPs的濃度的增加而增加.尤其是CMC/CNPs-0.750膜表現(xiàn)出較高的抗氧化活性(85.22 %),而CMC/CNPs-0.250表現(xiàn)出相對較低的抗氧化活性(51.29%),CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除能力高于對照組.結(jié)合上述釋放實(shí)驗,Cur被包埋形成CNPs,當(dāng)RH較高時,水分會逐步進(jìn)入薄膜中,其過程會導(dǎo)致薄膜溶脹,使得Cur從膜中更加緩慢的被釋放出來.而隨著CNPs濃度的增大,Cur的含量也更多,清除DPPH自由基的能力也隨之提高.因此,把CNPs加入CMC膜中仍具有很強(qiáng)的抗氧化活性.主要原因是CNPs的形成,Cur得到了有效的保護(hù).
圖5 CMC/CNPs膜的DPPH自由基清除活性圖
Cur與CS和TPP形成的CNPs成功的結(jié)合到可食用性CMC膜中,采用流延法成功制備了負(fù)載CNPs的抗氧化CMC/CNPs可食用膜.CNPs的加入提高了CMC薄膜的TS和Eb.SEM圖像表明添加CNPs會影響CMC膜的形貌,但沒有明顯的相分離現(xiàn)象.FTIR和XRD表明CNPs和CMC之間存在相互作用.DPPH自由基清除試驗表明CMC/CNPs膜比空白CMC膜具有更高的抗氧化活性.
此外,不同RH下CMC/CNPs膜中Cur的釋放情況不同.RH對活性物質(zhì)的釋放影響很大,當(dāng)薄膜置于RH較高的地方時,尤其是冷鮮肉,水蒸氣的積累誘導(dǎo)活性物質(zhì)的釋放,活性物質(zhì)包埋形成納米粒子的形式加入到成膜溶液中可以延緩它的釋放.因此,在實(shí)際應(yīng)用中,CMC/CNPs可食用膜是延緩冷鮮肉氧化變質(zhì),延長其貨架期的一種方法.