檳榔林下間作平托花生土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

顏彩繽，趙 亞，胡福初，芮 凱，陳 哲，張世青，范鴻雁*

（1．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南 三亞 572000；2．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?？跓釒Ч麡淇茖W(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南省熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶果樹育種工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571100；3．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，海南 海口 571100）

檳榔（Areca catechu L.）是中國(guó)四大南藥之一，棕櫚科常綠喬木是海南第二大特色經(jīng)濟(jì)作物，其果實(shí)被當(dāng)作咀嚼嗜好品，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。檳榔原產(chǎn)于馬來(lái)西亞，于熱帶、亞洲熱帶地區(qū)廣泛栽培，在我國(guó)主要分布在海南、云南及臺(tái)灣等地區(qū)［2］。隨著檳榔種植面積擴(kuò)大，檳榔黃化現(xiàn)象發(fā)生范圍廣、蔓延快，給產(chǎn)量造成了嚴(yán)重?fù)p失，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，檳榔減產(chǎn)達(dá)10%～60%不等，每年因黃化現(xiàn)象損失20 億元以上［3］。平托花生又稱蔓花生、野花生，是一種熱帶亞熱帶豆科牧草，多年生宿根草本，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，可無(wú)性繁殖和種子繁殖，原產(chǎn)于巴西，主要用于人工觀賞草坪、生物覆蓋和果園生草栽培。本研究選用的‘熱研12 號(hào)’平托花生是1991 年中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草研究中心從哥倫比亞國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心引進(jìn)，其在熱帶亞熱帶地區(qū)能保持常綠并周年生長(zhǎng)開花，廣泛適應(yīng)華南地區(qū)酸性紅壤種植，不僅具有耐酸瘠及貧瘠土壤、耐旱和耐蔭的特點(diǎn)，而且還具有增加土壤肥力、提高保水性能、改善園內(nèi)小氣候和控制雜草生長(zhǎng)等作用，是生態(tài)果園優(yōu)良的間作植物，間作時(shí)間越長(zhǎng)保水性能越好［4-6］。

土壤細(xì)菌是土壤微生物類群的重要組成部分，主要參與有機(jī)物分解、生物地球化學(xué)循環(huán)等活動(dòng)，幾乎與土壤中所有生化反應(yīng)都有關(guān)系，不僅在改善土壤肥力以及生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)方面有顯著作用［7］，而且具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和防治病蟲害等重要作用［8］。檳榔黃化發(fā)生嚴(yán)重，但目前尚未找到有效的防治方法，檳榔間作是重要的農(nóng)業(yè)防治方法之一，可以預(yù)防和減緩該病害的發(fā)生。國(guó)外在檳榔園中混合種植了小豆蔻、菠蘿、生姜、姜黃、香蕉、可可和黑胡椒等多種作物，我國(guó)僅單一間作香草蘭、胡椒和糯米香茶等作物［9］。Castro 等［10］和Sujatha 等［11］研究發(fā)現(xiàn)檳榔園間作香草蘭可提高土壤pH、土壤速效養(yǎng)分含量以及單位面積經(jīng)濟(jì)效益；吳鳳芝等［12］提出間作具有顯著增加土壤微生物群落多樣性、減輕病害發(fā)生以及提高黃瓜產(chǎn)量的作用；王華等［13］研究檳榔不同株行距間作香草蘭時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌數(shù)量較香草蘭單作顯著提高，且細(xì)菌數(shù)量與有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效鐵和有效硼等含量呈顯著正相關(guān)；戴晉等［14］的研究表明，辣椒小麥套種、再間作芝麻的種植模式可減少辣椒“日灼病”的發(fā)生率；馮曉敏［15］研究發(fā)現(xiàn)，燕麥間作豆科作物不僅對(duì)燕麥根部土壤微生物環(huán)境具有良好的調(diào)節(jié)作用，而且能增加燕麥產(chǎn)量。

目前，我國(guó)關(guān)于檳榔林下間作平托花生對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響還尚未見報(bào)道。平托花生根系長(zhǎng)度經(jīng)測(cè)量平均值為10 ～20 cm，為探討檳榔林下間作平托花生土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，本試驗(yàn)以檳榔林下間作平托花生和檳榔單作地區(qū)10 ～20 cm 土層的土壤為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌群落V4 ～V5 區(qū)片段進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，從分子水平上揭示檳榔林下間作平托花生和檳榔單作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的變化，以期為深入研究檳榔林下間作平托花生對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響和防治檳榔黃化病提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試檳榔品種為‘熱研1 號(hào)’，于2010 年定植，種植規(guī)格為2 m×2.5 m；間作物平托花生品種為‘熱研12 號(hào)’，2019 年初定植，平托花生于檳榔林下全覆蓋種植，本試驗(yàn)平托花生不進(jìn)行收割還田。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于海南省瓊海市大路鎮(zhèn)禮合村委會(huì)的檳榔種植園（110.47026°E，19.449614°N），海拔31 m，屬熱帶季風(fēng)及海洋濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫24 ℃，年平均降水量2072 mm，年平均日照2155 h，年平均輻射量118.99 kJ/m2。土壤為磚紅壤，多為砂質(zhì)粘壤土。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)2 個(gè)處理，檳榔林下間作平托花生（BP）和檳榔單作（CK），每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，分別編號(hào)為BP-1、BP-2、BP-3 和CK-1、CK-2、CK-3。

1.3.2 土壤樣品采集

2019 年12 月分別在檳榔林下間作平托花生和檳榔單作試驗(yàn)處理區(qū)，在平托花生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期采集土壤樣品，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)采取五點(diǎn)取樣法選擇5 株檳榔，在距離檳榔莖基部約15 cm處的東西南北4 個(gè)點(diǎn)，拔開平托花生莖蔓后挖取10 ～20 cm 土層根際土壤，混勻后裝入無(wú)菌瓶，密封好放入裝有冰袋的保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)將無(wú)菌瓶?jī)?nèi)土壤樣品的雜根去除，分裝于50 mL 滅菌離心管，-20℃下保存，用于高通量測(cè)序；與上述選點(diǎn)取樣方法相同，取樣后采用四分法去除多余土壤，裝入密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)1 mm 篩，常溫下保存，用于土壤理化因子分析。

1.3.3 土壤理化因子的分析

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［16］。采用水合熱重鉻酸鉀氧化法測(cè)定土壤有機(jī)碳；采用半微量凱氏定氮法測(cè)定全氮；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮；采用王水酸溶鉬銻抗比色法測(cè)定全磷；采用雙酸浸提鉬銻抗比色法測(cè)定酸性土壤有效磷；采用堿熔—火焰光度法測(cè)定全鉀；采用醋酸銨浸提—火焰光度法測(cè)定速效鉀；采用鋁盒烘干法測(cè)定干濕比；采用酸度計(jì)測(cè)定土壤pH。

1.3.4 土壤總DNA 的提取

使 用FastDNA?SPIN Kit for Soil 試 劑 盒 提 取樣本土壤微生物基因組DNA，干冰運(yùn)輸，由上海天昊生物科技有限公司采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行16S 擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序（V4 ～V5）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，獲得更為精準(zhǔn)、高質(zhì)量、可用于分析的序列；應(yīng)用usearch、QIIME根據(jù)序列97%的相似度，將序列歸并劃分為多個(gè)OUTs。利用Mothur、R 計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1 和ACE 以及多樣性指數(shù)Simpson 和Shannon，并進(jìn)行Alpha 多樣性分析；同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌群落分布、聚類分析和細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析。用SPSS 20.0 獨(dú)立t檢驗(yàn)分析土壤理化因子差異性，用Canoco 5 構(gòu)建細(xì)菌菌門與土壤理化因子的相關(guān)性，用SPSS 20.0 Spearman’s rho test 分析細(xì)菌菌屬和土壤理化因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作對(duì)土壤理化因子的影響

由表1 可知，檳榔林下間作平托花生后，土壤理化因子與檳榔單作有顯著性差異。間作模式下酸性有效磷含量極顯著提高95.99%；全磷含量顯著提高33.33%；全鉀含量顯著提高32.64%；速效鉀含量顯著提高21.93%；有機(jī)碳、全氮和堿解氮無(wú)顯著性差異；土壤pH 顯著提高。

表1 土壤理化性質(zhì)

2.2 不同種植模式下土壤細(xì)菌群落多樣性變化

2.2.1 Alpha 多樣性分析

Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)兼顧群落均勻度，均與群落多樣性成正比，結(jié)果見表2。檳榔間作模式較單作模式下的物種數(shù)目平均顯著增加5.5%，Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)分別顯著提高4.95%、4.60%，表明間作后物種豐富度明顯提高，而Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)均提高但未達(dá)到顯著水平。物種覆蓋率達(dá)到99%以上，說(shuō)明土壤微生物樣本序列檢出率高。

表2 不同樣品的α 多樣性指數(shù)

2.2.2 Beta 多樣性分析

本研究通過(guò)非度量多維尺度分析（NMDS）方法［17］，觀測(cè)樣本之間的差異。每個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)樣本，兩點(diǎn)之間的距離越近，表明2 個(gè)樣本之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度越高。圖1 是對(duì)檳榔單作和間作模式下土壤中OTU 組成的分析，由圖1 可知，間作與單作各自的3 個(gè)土壤樣品分別聚類，說(shuō)明兩組土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有差異。

2.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

2.3.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平的分析

兩種檳榔種植模式下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)平均相對(duì)豐度大于1%的門類群共有12 個(gè)，相對(duì)豐度較高的門類群分別是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等（圖2）。結(jié)果表明，檳榔林下間作平托花生后并沒有改變細(xì)菌門水平上的主要種類組成，但提高了變形菌門、放線菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門等的相對(duì)豐度，其中變形菌門、放線菌門的相對(duì)豐度分別增加2.57%、2.84%；酸桿菌門、綠彎菌門、奇古菌門和擬桿菌門等的相對(duì)豐度均降低，尤其是酸桿菌門、綠彎菌門相對(duì)豐度降低幅度較大，分別降低4.61%、2.31%。在單作模式下酸桿菌門相對(duì)豐度最高，而間作模式下變形菌門相對(duì)豐度最高。

2.3.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平的分析

供試細(xì)菌菌群平均相對(duì)豐度大于1%的屬類群共有15 個(gè)，詳見圖3。酸桿菌門的Gp1、Gp2、Gp4、Gp5、Gp6 和Gp7 亞 群 均 為 優(yōu) 勢(shì) 菌 屬；其中，間作提高Gp6、Gp4 的相對(duì)豐度但降低了其余Gp 屬的相對(duì)豐度，尤其是Gp6 增加幅度最大（為1.79%）；Gp1、Gp2 和Gp5 比例分別降低2.79%、2.44%和0.14%；Gp6 在單作和間作模式下相對(duì)豐度均最高。相對(duì)豐度較高的還有亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、Gaiella、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Pseudolabrys、硝化螺菌屬（Nitrospira）和紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）等菌屬，其中間作提高Gaiella、芽單胞菌屬和Pseudolabrys 的相對(duì)豐度，降低亞硝化球菌屬、硝化螺菌屬和紅游動(dòng)菌屬的相對(duì)豐度；Gp3（1.3%）和Terrimonas（1.2%）在檳榔單作下為優(yōu)勢(shì)菌屬。兩種檳榔種植模式下無(wú)明確分類信息或分類名稱（No_Rank）的菌屬占25.09%～27.51%，無(wú)任何分類信息（Unassigned）的菌屬占18.40%～17.43%。

圖1 非度量多維尺度分析圖

圖2 土壤門水平上的細(xì)菌群落組成

圖3 土壤屬水平上的細(xì)菌群落組成

2.4 土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

2.4.1 門水平上土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

在門分類水平上，對(duì)土壤總細(xì)菌中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌進(jìn)行冗余分析，以探究特定細(xì)菌與土壤理化因子的關(guān)系?？傋儺悢?shù)為0.01839，解釋變量占96.5%（調(diào)整后解釋變化為82.3%），排序軸1 對(duì)土壤總細(xì)菌變異程度的解釋度為83.96%，排序軸2 解釋了8.71%的變異，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解釋度總共高達(dá)92.67%（表3）。其中速效鉀解釋了最多的變異程度，解釋度為76.2%，有機(jī)碳、全氮、干濕比解釋度分別為3.5%、7.6%、9.1%（表4）。由圖4 可見，放線菌門、芽單胞菌門、變形菌門與速效鉀、有機(jī)碳、全氮和干濕比均呈正相關(guān)；酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）與速效鉀和干濕比呈負(fù)相關(guān)。單作模式（CK）的土壤樣品主要分布在第三象限全氮和有機(jī)碳含量延長(zhǎng)線之間，說(shuō)明CK 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異主要是由全氮和有機(jī)碳含量的變化引起的；間作模式（BP）的土壤樣品分布第一（BP-3）、第三（BP-1）和第四象限（BP-2），由于BP-1 與CK 聚類很近，因此作為異常值不做考慮，說(shuō)明其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受速效鉀和干濕比的影響。

2.4.2 屬水平上土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

表3 土壤因子與土壤細(xì)菌門水平RDA 分析結(jié)果

表4 主要土壤因子RDA 結(jié)果

圖4 門水平上土壤總細(xì)菌類群與土壤理化因子之間的關(guān)系

在屬分類水平上，對(duì)土壤總細(xì)菌中相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)性分析，以了解優(yōu)勢(shì)菌屬與土壤理化因子的相關(guān)性。亞硝化球菌屬與有機(jī)碳、堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)；硝化螺菌屬與全磷、全鉀分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)；Gp1、Gp2 和Gp3 均與pH 呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)；Gp6 與pH 呈顯著正相關(guān)；Gp4 與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)；紅游動(dòng)菌屬與全氮呈顯著正相關(guān)；Gaiella、芽單胞菌屬和Pseudolabrys均與全鉀呈極顯著或顯著正相關(guān)。

表5 屬水平上土壤細(xì)菌與土壤理化因子相關(guān)性分析

2.5 土壤細(xì)菌菌群代謝功能預(yù)測(cè)

對(duì)兩種檳榔種植模式的細(xì)菌菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，細(xì)菌基因序列中共發(fā)現(xiàn)來(lái)自6 類代謝通路的41 個(gè)子功能類群，選擇相對(duì)豐度最高的top30 功能繪制熱圖。氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸、能量代謝是細(xì)菌群落的主要代謝功能群。單作和間作模式下菌群功能差異性分析結(jié)果見圖5，間作平托花生后能量代謝的功能基因顯著增加，影響苯丙素、類黃酮、甜菜紅色素和吲哚生物堿等次生代謝產(chǎn)物的生物合成功能基因、輔助因子和維生素的代謝以及控制晝夜節(jié)律-植物的功能基因顯著減少，說(shuō)明間作除了提高細(xì)菌能量代謝功能外，其余代謝功能均降低。

圖5 t-檢驗(yàn)差異KEGG 功能相對(duì)豐度條形圖

3 討論

3.1 間作對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

磷和鉀是植株生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基本元素，具有促進(jìn)植物根系發(fā)育、防止植株瘦弱低矮、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)以及抵抗不良土壤環(huán)境等作用，土壤全磷、全鉀含量即反映磷和鉀的貯量狀況，土壤有效磷、有效鉀容易被作物吸收利用，是體現(xiàn)土壤磷、鉀養(yǎng)分供應(yīng)水平的指標(biāo)［18-21］。本研究中，檳榔林下間作平托花生顯著提高了土壤酸性有效磷、全磷、全鉀以及速效鉀含量，尤其是土壤酸性有效磷含量極顯著提高了95.99%（表1），說(shuō)明間作平托花生后土壤磷、鉀的貯量和供應(yīng)能力均顯著或極顯著提高。初步分析是由于土壤pH 影響離子的選擇性，在土壤pH 大于5.5 時(shí)，磷離子、鉀離子與鋁離子和Al（OH）x在競(jìng)爭(zhēng)吸附位點(diǎn)中占優(yōu)勢(shì)，使溶液中的磷、鉀易被土壤吸附［22-23］。本研究結(jié)果與其一致，單作模式下土壤pH 為5.47 而間作模式為5.72，說(shuō)明間作平托花生能夠提高土壤pH，從而導(dǎo)致部分養(yǎng)分含量增加，最終能夠改善由于缺素造成的檳榔黃化現(xiàn)象。

3.2 間作對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

前人在研究檳榔根際土壤微生物與檳榔黃化病的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，根際土壤細(xì)菌數(shù)量隨著黃化程度增加呈減少的趨勢(shì)，即根際細(xì)菌數(shù)量表現(xiàn)為健康檳榔＞輕度黃化檳榔＞中度黃化檳榔，細(xì)菌數(shù)量還與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷呈顯著或極顯著正相關(guān)［24-25］。本研究通過(guò)間作平托花生發(fā)現(xiàn)，物種數(shù)目以及Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)均顯著提高（表2），說(shuō)明間作平托花生可以提高土壤細(xì)菌數(shù)量及群落多樣性，從而增強(qiáng)植株抗黃化能力。

3.3 間作對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

兩組樣本的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異（圖2、3），各菌群相對(duì)豐度的不同反映了土壤環(huán)境的變化。在門水平上，兩種模式下變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門均為優(yōu)勢(shì)菌群。變形菌門是反映土壤營(yíng)養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)之一［26］，其相對(duì)豐度在營(yíng)養(yǎng)較為豐富的土壤中更高［27］，表現(xiàn)為隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量增多而增多［28-29］。本研究中，檳榔間作模式下變形菌門的相對(duì)豐度提高了2.57%，說(shuō)明間作平托花生提高了土壤營(yíng)養(yǎng)豐富度。放線菌作為植物根際土壤的一種重要微生物，有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、防治病害的作用［30-31］，放線菌門的相對(duì)豐度與土壤碳氮比呈顯著正相關(guān)關(guān)系［32］，因此，間作平托花生后放線菌門相對(duì)豐度的顯著提高，導(dǎo)致土壤碳氮比提高以及土壤營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化。酸桿菌是廣泛分布在土壤中的嗜酸菌［33-35］，酸桿菌門的比例體現(xiàn)土壤的酸性條件［36-37］，已有研究表明，酸桿菌門與土壤pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)［38］，而且土壤pH 降低能夠?qū)е录?xì)菌群落多樣性減少［39］。本研究間作模式下酸桿菌門相對(duì)豐度降低4.61%，pH 顯著增加（表1），說(shuō)明檳榔林下間作平托花生能夠增加土壤細(xì)菌群落多樣性以及改良土壤酸化狀況；在間作模式下優(yōu)勢(shì)亞群中Gp6、Gp4 增加，Gp1、Gp2 和Gp3 菌群均減少；pH 與Gp1、Gp2 和Gp3 呈 顯 著 負(fù) 相 關(guān) 但 與Gp6 呈顯著正相關(guān)（表5），說(shuō)明土壤環(huán)境pH 主要受到Gp1、Gp2、Gp3 以及Gp6 菌屬的影響，這與前人得出的Gp1、Gp2 和Gp3 的相對(duì)豐度在酸性土壤中較高［40］的研究結(jié)果一致。綠彎菌門在貧瘠土壤條件下更具優(yōu)勢(shì)，與全氮和堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)［41］，與本研究結(jié)果不一致，間作平托花生后土壤細(xì)菌中綠彎菌門的相對(duì)豐度降低2.31%，全氮含量降低但差異不明顯（表1），綠彎菌門與全氮含量呈正相關(guān)，考慮平托花生為豆科作物，具有固氮作用；對(duì)兩種模式下土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的還有Terrimonas 屬，Terrimonas 屬為擬桿菌門（Bacteroidetes）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）、泉發(fā)菌科（Crenotrichaceae），是一類能夠降解蒽類物質(zhì)的好氧反硝化細(xì)菌［42］。本研究中檳榔單作模式下Terrimonas 的相對(duì)豐度達(dá)1.2%，說(shuō)明間作平托花生后土壤環(huán)境發(fā)生改善，從而抑制Terrimonas 細(xì)菌生長(zhǎng)，本研究在屬水平下的No_Rank 和Unassigned 菌屬在兩種模式所占比例分別為25%以上和17%以上，說(shuō)明檳榔林下土壤還存在大量需要進(jìn)一步鑒定研究的未知或稀有細(xì)菌。

3.4 土壤細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性分析

從相關(guān)性分析（圖4，表5）得出速效鉀、有機(jī)碳、全氮和干濕比是影響土壤細(xì)菌門結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。速效鉀解釋度最高，其含量與放線菌門、芽單胞菌門和變形菌門呈極顯著正相關(guān)，與酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、疣微菌門以及Gp1、Gp2 呈顯著負(fù)相關(guān)；Gaiella、芽單胞菌屬和Pseudolabrys 均與全鉀呈極顯著或顯著正相關(guān)。因此，鉀元素為影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要理化因子。與氮有關(guān)的菌屬為亞硝化球菌屬、Gp4 菌屬和紅游動(dòng)菌屬，亞硝化球菌屬與堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)，紅游動(dòng)菌屬與全氮呈顯著正相關(guān)，Gp4 菌屬與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)，間作均降低了亞硝化球菌屬、紅游動(dòng)菌屬的相對(duì)豐度，但提高了Gp4 菌屬的相對(duì)豐度，說(shuō)明間作平托花生具有良好的固氮效果，并且可以改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。單作模式細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異主要由全氮和有機(jī)碳含量的變化引起，間作模式細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受速效鉀和干濕比的影響。本研究結(jié)果表明，影響兩種模式下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化因子多數(shù)差異不顯著，因此，有必要進(jìn)一步開展間作模式的改良以及持續(xù)監(jiān)測(cè)。

3.5 土壤細(xì)菌代謝功能預(yù)測(cè)

在揭示土壤細(xì)菌群落組成的基礎(chǔ)上，進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測(cè)（圖5）能反映環(huán)境因子的變化，為打破傳統(tǒng)耕作、實(shí)現(xiàn)持久耕作奠定基礎(chǔ)。兩組樣本的土壤細(xì)菌群落主要代謝功能為氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸和能量代謝。能量代謝功能主要表現(xiàn)為細(xì)菌有機(jī)物分解或無(wú)機(jī)物氧化過(guò)程中釋放的能量，通過(guò)底物磷酸化或氧化磷酸化合成ATP的過(guò)程［43］，間作后細(xì)菌能量代謝功能增強(qiáng)的原因可能是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，尤其是與化能異養(yǎng)菌、光能營(yíng)養(yǎng)菌還有化能自養(yǎng)菌相對(duì)豐度密切相關(guān)；但化能異養(yǎng)菌如Terrimonas 和化能自養(yǎng)菌如硝化螺菌屬相對(duì)豐度的減少還有待進(jìn)一步研究；間作后苯丙素、類黃酮、甜菜紅色素和吲哚生物堿的生物合成功能基因顯著減少，其原因可能是苯丙素、類黃酮和甜菜紅素等是在植物逆境脅迫下產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)［44-46］，而間作平托花生后改善了土壤環(huán)境因子；崔曉瑩等［47］探究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌接種連作大豆根系后的輔助因子和維生素的代謝功能基因均減少；董艷輝等［48］研究表明藜麥連作后的輔因子和維生素代謝功能基因減少，與本研究結(jié)果一致；晝夜節(jié)律是植物通過(guò)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋調(diào)節(jié)環(huán)路對(duì)環(huán)境中的信號(hào)如溫度和光照進(jìn)行整合從而適應(yīng)外界環(huán)境的一種內(nèi)在分子機(jī)制，幾乎影響植物新陳代謝的方方面面［49-50］，本研究間作后植物晝夜節(jié)律功能基因減少，原因可能是溫度和光照等環(huán)境因子的改變對(duì)植株生物鐘造成影響。綜上，代謝功能基因增減與土壤理化性質(zhì)以及環(huán)境因子改變密切相關(guān)，對(duì)檳榔種植具有良好的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

間作模式下酸性有效磷、全磷、全鉀和速效鉀含量分別顯著或極顯著增加95.99%、33.33%、32.64%和21.93%，土壤pH 顯著提高，檳榔林下間作平托花生后土壤質(zhì)量以及酸化狀況得到明顯改善。

間作模式下細(xì)菌菌群數(shù)量增加5.5%，Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)分別顯著增加4.95%、4.60%，表明檳榔林下間作平托花生可有效提高土壤細(xì)菌豐富度以及多樣性。

間作還能提高變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門等的相對(duì)豐度，降低酸桿菌門、綠彎菌門、奇古菌門、擬桿菌門等的相對(duì)豐度；在屬水平上提高Gaiella、芽單胞菌屬、Pseudolabrys 的相對(duì)豐度，降低亞硝化球菌屬、硝化螺菌屬、紅游動(dòng)菌屬、Gp3和Terrimonas 等的相對(duì)豐度，說(shuō)明檳榔林下間作平托花生能改變土壤細(xì)菌群落特性。

檳榔林下土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異主要是受速效鉀、有機(jī)碳、全氮和干濕比等理化因子的影響。放線菌門、芽單胞菌門、變形菌門與速效鉀、有機(jī)碳和全氮呈正相關(guān)；酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、疣微菌門與速效鉀和干濕比呈負(fù)相關(guān)；亞硝化球菌屬與全碳、堿解氮呈極顯著負(fù)相關(guān)；硝化螺菌屬與全磷、全鉀分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)；酸桿菌門中Gp1、Gp2 和Gp3 與pH 呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)；Gp6 與pH 呈顯著正相關(guān)；Gp4 與全氮呈顯著正相關(guān)；紅游動(dòng)菌屬（屬變形菌門）與全氮呈顯著正相關(guān)；Gaiella（屬放線菌門）、芽單胞菌屬（屬芽單胞菌門）和Pseudolabrys 屬（屬變形菌門）均與全鉀呈顯著正相關(guān)，表明土壤細(xì)菌影響土壤質(zhì)量。

氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸和能量代謝為檳榔林下細(xì)菌群落的主要代謝功能群，間作平托花生明顯改善了細(xì)菌群菌代謝功能，表現(xiàn)為能量代謝功能基因顯著增加，苯丙素、類黃酮、甜菜紅色素、吲哚生物堿等次生代謝產(chǎn)物的生物合成功能基因顯著減少，輔助因子和維生素的代謝功能基因以及影響晝夜節(jié)律-植物的功能基因顯著減少。代謝功能的變化能夠反映土壤微環(huán)境的狀況，為篩選良好的檳榔種植模式奠定理論基礎(chǔ)。