骨髓增殖性腫瘤中JAK2V617F突變與Ⅰ型細(xì)胞因子受體的相關(guān)性

尹鳳雷，許衛(wèi)星，李淑晨，張 薇，王 娟，馬洪玉，趙 芳，劉 靜

（滄州市中心醫(yī)院血液內(nèi)一科，河北 滄州 061000）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一類克隆性造血干細(xì)胞疾病[1]。在經(jīng)典型MPN 中，真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）與原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）合稱經(jīng)典型BCR-ABL陰性MPN。疾病之間可互相轉(zhuǎn)化或合并存在，由于患者血細(xì)胞過(guò)度增殖，可導(dǎo)致血液淤滯、粘稠度增加，成為各種心腦血管疾病的高危因素。PV、ET的早期危險(xiǎn)因素是血栓栓塞性疾病，主要是心肌梗死和腦梗塞，其次是出血和間歇性跛行；其晚期危險(xiǎn)因素大多是骨髓纖維化所造成的嚴(yán)重貧血和心力衰竭、巨脾、出血和反復(fù)感染而導(dǎo)致的死亡，部分患者最終轉(zhuǎn)化為急性白血病[2]。細(xì)胞因子受體-JAK-STAT 通路作為比較重要的一個(gè)細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)激活這一通路，不僅可以對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，還能對(duì)細(xì)胞增殖起到一定的促進(jìn)作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，大部分PMF、ET 以及PV 患者中，往往存在酪氨酸激酶JAK2的獲得性點(diǎn)突變JAK2V617F。JAK2V617F 作為激活性的一種突變，其酪氨酸激酶活性較好，可以將下游JAK-STAT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活[5]。研究表明[6]，在PV 等BCR/ABL 陰性MPN 患者的發(fā)生和發(fā)展中，JAK2V617F 是比較重要的一個(gè)因素，但需要注意的是，其組成性激活活性的發(fā)生與Ⅰ型細(xì)胞因子受體密切相關(guān)。本研究旨在分析MPN 中Ⅰ型細(xì)胞因子受體[血小板生成素受體（c-Mpl）、粒細(xì)胞集落刺激因子受體（GCSFR）以及促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）]的mRNA 表達(dá)水平及其與JAK2V617F 突變之間的關(guān)系，以期為MPN 患者的靶向治療提供有效理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月-2021年4月滄州市中心醫(yī)院收治的MPN 患者50 例設(shè)為MPN組，另選擇同期健康者45 例設(shè)為正常對(duì)照組和15 例慢性粒細(xì)胞白血病（CML）患者設(shè)為CML組。MPN組女22 例，男28 例；年齡30～77 歲，平均年齡（53.63±9.21）歲；疾病類型：PMF 15 例、ET 15 例、PV 20 例；病史：初治21 例，治療29 例。CML組女10 例，男5例；年齡28～76 歲，平均年齡（53.43±9.31）歲。正常對(duì)照組女20 例，男25 例；年齡27～77 歲，平均年齡（53.34±9.45）歲。三組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者知情同意并簽署同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完善；②符合CML 和MPN 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)骨髓相關(guān)指標(biāo)檢查確診；③患者意識(shí)清醒，可正常交流和溝通。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重意識(shí)障礙或精神異常者；②依從性較差者。

1.3 方法

1.3.1 儀器和試劑 選擇讀膠儀、基因測(cè)序儀、ABI prism700 熒光定量PCR 儀以及核酸蛋白紫外分析儀，引物則包括SYBR Green Real Master Mix 和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。

1.3.2 合成引物 由北京賽百盛公司合成引物，研究基因及PCR 引物序列見表1。

表1 FQPCR 擴(kuò)擴(kuò)增引物序列

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照常規(guī)方法，對(duì)新鮮肝素抗凝外周血或骨髓液進(jìn)行采集，在Ficoll 液中對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離備用，然后運(yùn)用TRIzol 對(duì)細(xì)胞總RNA 進(jìn)行提取，電泳鑒定RNA 并定量，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄使cDNA 合成。同時(shí)，再行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，其中SYBR 反應(yīng)體系共25 μl，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置，60 ℃1 min，94 ℃45 s，94 ℃5 min，循環(huán)40 個(gè)，其中熒光本底信號(hào)為PCR 反應(yīng)前3～15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，對(duì)基線進(jìn)行調(diào)節(jié)，直到適宜處，其中C（t）值為基線與熒光曲線之間的交叉點(diǎn)。根據(jù)C（t）βactin/C（t）Gene=△C（t），對(duì)檢測(cè)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，其中數(shù)值與檢測(cè)基因mRNA 表達(dá)水平呈正比。

1.3.4 半定量PCR 選擇8 μl 上述JAK2V617F 擴(kuò)增產(chǎn)物，運(yùn)用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行處理后，在紫外燈下對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，然后運(yùn)用讀膠儀AlphaImager1200進(jìn)行掃描，在83 bp 位置上，若可見條帶，則判斷為JAK2V617F 突變陽(yáng)性；若沒(méi)有，則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組JAK2V617F 突變情況 MPN組中30 例存在JAK2/V617F 點(diǎn)突變，占比60.00%（30/50），其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的陽(yáng)性率分別為53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20）；正常對(duì)照組和CML組無(wú)JAK2V617F 突變，見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)JAK2V617F 突變圖

2.2 三組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較CML組c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表達(dá)水平均高于MPN組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MPN組GCSFR、EPOR的mRNA 表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但MPN組與正常對(duì)照組c-Mpl的mRNA 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。2.3MPN組不同病史JAK2 突變患者各項(xiàng)指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較 MPN組中JAK2V617F 突變陰性初治和JAK2V617F 突變陽(yáng)性初治、JAK2 突變陰性治療和JAK2 突變陽(yáng)性治療患者的c-Mpl、GCSFR以及EPOR的mRNA 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 三組各項(xiàng)指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組各項(xiàng)指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表3 MPN組不同病史JAK2 突變患者各項(xiàng)指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表3 MPN組不同病史JAK2 突變患者各項(xiàng)指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

3 討論

細(xì)胞因子受體-JAK-STAT 通路是比較重要的一條細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)激活這一通路，能夠?qū)?xì)胞增殖起到一定的促進(jìn)作用，從而對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制[7]。細(xì)胞因子結(jié)合受體后，可對(duì)受體產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使寡聚體形成，并且與JAK 互相作用，激活JAK 和受體，使下游多種含特定SH2 結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分析活化，誘導(dǎo)二聚體形成進(jìn)入核內(nèi)，從而提高轉(zhuǎn)錄因子活性[8，9]。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，在一些MPN 患者中纈氨酸被苯丙氨酸代替，這一突變體作為組成性激活的一種酪氨酸激酶，在細(xì)胞因子缺乏的條件下，能夠?qū)⒓?xì)胞因子受體和自身受體激活，從而將下游信號(hào)傳導(dǎo)通路激活。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPN組中30 例存在JAK2V617F 點(diǎn)突變，占比60.00%，其中PMF 患者、ET 患者以及PV 患者的陽(yáng)性率分別為53.33%（8/15）、73.33%（11/15）、55.00%（11/20），但是正常對(duì)照組和CML組無(wú)JAK2V617F 突變，這一結(jié)果與田輝云等[11]、Mullally A 等[12]研究報(bào)道基本一致。通常情況下，在JAK2V617F 參與MPN 發(fā)病中Ⅰ型細(xì)胞因子受體發(fā)揮著極其重要的作用，二者只有相互作用，才能增強(qiáng)組成性激活活性，若JAK2V617F 脫離Ⅰ型細(xì)胞因子受體后，其生物活性則得不到有效發(fā)揮[13，14]。同時(shí)，細(xì)胞表面Ⅰ型因子受體如c-Mpl、GCSFR 以及EPOR 等，作為一種同源二聚體，當(dāng)細(xì)胞因子結(jié)合其受體后，可使JAK2的二聚體形成，并且互相磷酸化，然后增強(qiáng)STAT5的轉(zhuǎn)錄因子活性，從而導(dǎo)致造血細(xì)胞的分化、增殖以及生成[15，16]。若細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體缺乏，則會(huì)導(dǎo)致造血細(xì)胞凋亡[17，18]。過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子能夠使JAK2V617F組成激活作用增強(qiáng)，提示JAK2V617F 需要細(xì)胞因子受體作為橋梁，并且在信號(hào)傳導(dǎo)與激活中發(fā)揮著極其重要的作用。此外，本研究結(jié)果顯示，CML組c-Mpl、GCSFR、EPOR的mRNA 表達(dá)水平均高于MPN組、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MPN組GCSFR、EPOR的mRNA 表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但MPN組與正常對(duì)照組c-Mpl的mRNA 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MPN組中JAK2V617F 突變陰性初治和JAK2V617F突變陽(yáng)性初治、JAK2 突變陰性治療和JAK2 突變陽(yáng)性治療患者的c-Mpl、GCSFR 以及E POR的mRNA 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示與正常對(duì)照組比較，MPN 患者GCSFR、EPOR的mRNA 表達(dá)水平較高，但是經(jīng)對(duì)癥治療后，MPN組中JAK2V617F 突變陽(yáng)性治療患者的GCSFR、EPOR表達(dá)水平下降，這一結(jié)果與王曉培等[19]研究報(bào)道一致，提示其與JAK2V617F 是否突變無(wú)關(guān)。

綜上所述，JAK2V617F 或Ⅰ型細(xì)胞因子參與MPN的發(fā)展，并且在多種造血系統(tǒng)腫瘤疾病中Ⅰ型細(xì)胞因子的表達(dá)水平較高，但其并不是決定MPN 發(fā)病的唯一因素。