雙歧桿菌制劑對大鼠腫瘤模型化療引起腸道炎癥的影響

潘 捷，段達(dá)榮

（臺州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)門診部1，檢驗(yàn)科2，浙江 臺州 318020）

化學(xué)藥物療法（chemotherapy）是腫瘤常用的治療方法之一，隨著該方法的廣泛使用和療效的提高，使得腫瘤患者的壽命大大延長；而化療藥物可誘發(fā)腸道黏膜的微炎癥，造成腸道屏障功能破壞、腸道通透性增加等改變，臨床上表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)，進(jìn)而腸道細(xì)菌穿過腸道屏障進(jìn)入血流，引起嚴(yán)重的血流感染，從而影響到治療的進(jìn)程，甚至危及患者生命[1-3]。有研究顯示[4，5]，化療期間補(bǔ)充雙歧桿菌可能減輕腸道黏膜微炎癥，雙歧桿菌所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）類物質(zhì)可明顯減輕患者體內(nèi)的結(jié)腸炎及化療誘導(dǎo)的腸道黏膜微炎癥反應(yīng)，降低化療患者血流感染的發(fā)生率。本研究在對SD 大鼠腫瘤應(yīng)用氟尿嘧啶治療過程中加入不同劑量的雙歧桿菌，觀察大鼠腸道炎癥指標(biāo)的變化，以明確雙歧桿菌對減少氟尿嘧啶化療過程中發(fā)生血流感染的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康SD 大鼠24 只，重量160～180 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SYLK（浙）2015-0008。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程遵循了國際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會(huì)《關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識》和本地及國家法規(guī)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麻醉下進(jìn)行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其痛苦和死亡。

1.2 試劑與儀器 雙歧桿菌制劑采用酪酸梭菌雙歧桿菌二聯(lián)活菌（商品名：常樂康，山東科興生物制品有限公司，批號：S20190015，規(guī)格：500 mg/袋）；氟尿嘧啶主要作用成份為5-氟尿嘧啶（海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)股份有限公司，批號：1904221，規(guī)格：0.5 g/支）；糞便隱血（OB）試劑盒（匹拉米酮半定量檢測法，中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：B190402）；革蘭染色液（中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：A190301）、腸組織髓過氧化物酶（MPO）（美國R&D公司，批號：19082101），促炎因子NF-κB（美國Santa Cruz 公司，批號：191106），H22 腫瘤細(xì)胞（購自中科院細(xì)胞研究所）；酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司，型號：TECAN HB-150E）；顯微鏡（日本OLYMPUS 型號：CX31）。

1.3 動(dòng)物腫瘤模型的建立及相關(guān)指標(biāo)的檢測 取H22腫瘤細(xì)胞，3000 r/min 離心5 min，再用生理鹽水洗3次，并做適當(dāng)稀釋。取40 μl 細(xì)胞懸液加入10 μl 0.4%溴酚藍(lán)染色并鏡檢計(jì)數(shù)，并制成3×106個(gè)/ml 腫瘤細(xì)胞懸液，分別給予SD 大鼠右腋皮下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml。接種完成后，逐日進(jìn)行觀察，如果出現(xiàn)腫瘤迅速增長，符合大鼠腫瘤模型。將符合大鼠腫瘤模型的大鼠分為A、B、C、D 4組，每組6 只。A組作為對照，B組給予氟尿嘧啶，C組給予氟尿嘧啶+低劑量雙歧桿菌，D組給予氟尿嘧啶+高劑量雙歧桿菌。氟尿嘧啶按10 mg/（kg·d）喂量，低劑量雙歧桿菌按10 mg/（kg·d）喂量，高劑量雙歧桿菌按50 mg/（kg·d）喂量，對照組不使用氟尿嘧啶或雙歧桿菌喂養(yǎng)。每日觀察大鼠的體重、活動(dòng)、飲食情況及糞便隱血情況，并對糞便進(jìn)行革蘭染色評估，判斷革蘭陽性菌及革蘭陰性菌。連續(xù)7 d 后對大鼠進(jìn)行注射麻醉解剖，觀察腸道充血、水腫、潰瘍情況，檢測MPO、NF-κB 活性。

1.4 檢測指標(biāo)及賦值 MPO、NF-κB的檢測方法參照試劑使用說明書進(jìn)行，對腸組織進(jìn)行冷凍切片，進(jìn)行HE 染色，HE 染色過程參照相關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行，糞便革蘭染色過程參照相關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行，球菌與桿菌比值按比值計(jì)算。糞便隱血采用匹拉米酮半定量檢測法，判讀陰性、1+、2+、3+、4+，并分別賦值0、1、2、3、4。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，行x2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠相關(guān)檢測指標(biāo)情況 B、C、D組大鼠體重均小于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但D組大鼠體重高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組糞便細(xì)菌染色的球桿比高于A組，D組糞便細(xì)菌染色的球桿比高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組糞便隱血、腸組織MPO 和NF-κB 低于B、C、D組，B組隱血、MPO 和NF-κB 低于C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠相關(guān)檢測指標(biāo)情況（±s）

表1 各組大鼠相關(guān)檢測指標(biāo)情況（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別A組B組C組D組體重（g）178.61±5.03 160.14±6.78a 166.47±3.86a 169.52±3.83ab球桿比0.41±0.14 2.27±0.33a 2.21±0.49a 0.91±0.13abc隱血0.24±0.13 3.47±0.52a 1.26±1.48ab 1.12±1.04ab MPO 19.62±2.08 76.34±8.21a 76.18±8.13a 53.51±5.25abc NF-κB 1.49±0.90 8.94±1.52a 8.31±0.54a 5.24±0.69abc

2.2 各組大鼠腸組織HE 染色情況 對大鼠腸組織進(jìn)行HE 染色發(fā)現(xiàn)，A組無明顯炎性細(xì)胞浸潤，基本正常結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)；B組腸組織的黏膜、黏膜下炎癥細(xì)胞重度浸潤；C組黏膜下層炎癥明顯細(xì)胞浸潤，腺體減少；D組黏膜下輕度炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠腸組織HE 染色（×200）

3 討論

人體腸道上皮細(xì)胞內(nèi)含有特殊的耐受性樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生許多抗炎細(xì)胞因子，從而下調(diào)炎癥反應(yīng)，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[6，7]。腸道內(nèi)正常菌群或其代謝產(chǎn)物可通過與腸上皮細(xì)胞表面的Toll 樣受體（toll-likereceptors，TLR）結(jié)合，啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等），維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8，9]。一些藥物（特別是化療藥物）的使用可改變這種穩(wěn)定狀態(tài)，化療期間腸道黏膜微炎癥的發(fā)生與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化密切相關(guān)，腸道菌群可發(fā)生改變[10]，而這些改變的菌群會(huì)合成多種代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了作用，不利于腫瘤的治療。Konishi H 等[11]研究指出，腸道共生菌，特別是雙歧桿菌、梭狀桿菌等革蘭陰性益生菌能夠改變腫瘤微環(huán)境，明顯減輕患者體內(nèi)的結(jié)腸炎及化療誘導(dǎo)的腸道黏膜微炎癥反應(yīng)[12]。如果在化療過程中加入大量雙歧桿菌等益生菌，可以提高機(jī)體對于寡核苷酸介導(dǎo)的腫瘤治療和鉑類化療的療效，有效降低化療血流感染風(fēng)險(xiǎn)，提高治療成功率[13]。

氟尿嘧啶是目前臨床上應(yīng)用最廣的抗嘧啶類藥物，對消化道癌及其他實(shí)體瘤有良好療效，在腫瘤治療中占有重要地位，是一種常見的腫瘤化療藥物。氟尿嘧啶主要通過酶將其轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸，5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成[14]。此外，氟尿嘧啶的代謝物也可以以代謝物的形式摻入到RNA 和DNA 中，影響細(xì)胞功能，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但其對腫瘤細(xì)胞作用的同時(shí)也會(huì)對正常細(xì)胞產(chǎn)生影響[15]。

MPO 是中性粒細(xì)胞的重要組成部分，是炎癥和組織損傷的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)[16，17]，實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物和炎癥性腸炎的MPO 活性增加，提示腸道炎癥發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，采用氟尿嘧啶治療大鼠腸道腫瘤過程中MPO 活性明顯增強(qiáng)，說明雙歧桿菌能有效緩解腫瘤化療過程中對腸道上皮細(xì)胞的炎性損傷；同時(shí)，增加雙歧桿菌制劑的劑量后MPO 活性降低，說明雙歧桿菌有助于減少腸道炎癥的發(fā)生。部分研究發(fā)現(xiàn)[18，19]，對有腸道腫瘤的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行氟尿嘧啶單藥化療的過程當(dāng)中，其腸道菌群的總數(shù)在化療期間明顯減低，特別是雙歧桿菌、梭狀桿菌集落Ⅳ及梭狀桿菌集落ⅪVa 等有益菌株的數(shù)量下降明顯。這種腸道微生態(tài)的改變更有利于致病菌的生長，增加化療誘導(dǎo)腹瀉等毒副反應(yīng)的發(fā)生率，增加血流感染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示，化療會(huì)導(dǎo)致大鼠腸道菌群中球菌與桿菌比例倒置，影響菌群平衡，不利于腫瘤的治療，而加入雙歧桿菌會(huì)改善這一狀況，與報(bào)道結(jié)果基本一致[20，21]。促炎因子NF-κB 可以激活細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[22]，參與結(jié)腸炎及其它腸道炎癥的表達(dá)。NF-κB的活性可反映炎癥的嚴(yán)重程度。研究發(fā)現(xiàn)[23，24]，使用化療藥對動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)會(huì)導(dǎo)致NF-κB的活性加強(qiáng)，引起腸道炎性感染，最終導(dǎo)致治療失敗。本研究顯示，化療藥物治療后大鼠腸道NF-κB的活性大幅增加，但在加入大劑量的雙歧桿菌后NF-κB的活性降低；而從HE 染色的炎癥細(xì)胞浸潤程度也可以得出同樣的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了雙歧桿菌的作用。

綜上所述，化療可以導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境改變，誘導(dǎo)腸道炎性發(fā)生，導(dǎo)致治療的失敗。而在腫瘤化療過程中加入大劑量的雙歧桿菌制劑可以減少腸道炎癥和血流感染的風(fēng)險(xiǎn)，提高治療成功率。