四株植物根際促生菌對農(nóng)田土壤N2O排放的影響

申衛(wèi)收 楊思琪 張歡歡 李慶 王銘科 潘鈺璟 徐德紅 高南

0 引言

氧化亞氮(N2O)是一種重要的溫室氣體，它在大氣中滯留時間較長，不但會產(chǎn)生溫室效應(yīng)，還會破壞臭氧層[1-3].雖然N2O在大氣中以痕量濃度存在，但是其在100年尺度上的增溫潛勢約為CO2的265倍[4].在過去的100年中，N2O對溫室效應(yīng)的貢獻已經(jīng)超過5%，全球的N2O排放速率約為11 Tg·a-1[4].農(nóng)田土壤是全球人為活動產(chǎn)生N2O 的最主要排放源，其排放占全球N2O排放總量的 25%～39%[5-7].我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中N2O的排放問題不容忽視.

目前，減排農(nóng)田土壤N2O的方法主要有施肥管理(含施肥時間與方式、施肥量、施肥類型等)、使用硝化抑制劑、科學(xué)耕作、添加生物質(zhì)炭、接種具有N2O減排效應(yīng)的微生物等[15-16].其中，接種具有N2O減排效應(yīng)微生物的N2O減排技術(shù)剛剛興起.植物根際促生菌，又稱PGPR，能有效提高作物的抗逆性，抑制病原菌、降低染病率、改善作物的營養(yǎng)狀況，從而提高作物的產(chǎn)量[17].具有N2O減排效應(yīng)的植物根際促生菌在減排農(nóng)田土壤N2O的同時，還可以增加作物產(chǎn)量，對減少化學(xué)氮肥用量及氮的環(huán)境負(fù)效應(yīng)具有重要實際意義[18].例如:Itakura等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在純培養(yǎng)體系和大豆蛭石盆栽試驗體系中，接種含有nosZ的大豆根瘤菌(Bradyrhizobium)可以有效減少土壤N2O的排放;Gao等[16]通過溫室盆栽試驗和土壤微宇宙培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，接種具有N2O還原功能的固氮螺菌屬(Azospirillumsp.)和草螺菌屬(Herbaspirillumsp.)的微生物到牧草地土壤，不僅可以減少土壤N2O的排放，同時還能促進紅花苜蓿和梯牧草的生長.

本研究以四株植物根際促生菌為研究對象，采用溫室盆栽試驗、土壤微宇宙試驗及田間原位試驗等方法，探究接種植物根際促生菌對農(nóng)田土壤N2O排放的影響，為農(nóng)田土壤溫室氣體減排和農(nóng)業(yè)碳中和提供實際指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試用的植物根際促生菌菌株分離自廣東省惠州市和江蘇省無錫市宜興市淹水水稻土，這些菌株對多種農(nóng)作物具有促生效應(yīng)，保藏在中國普通微生物菌種保藏中心(表1).開展盆栽試驗和土壤微宇宙試驗時，將菌株接種到改良的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(牛肉浸粉3.0 g/L、多聚蛋白胨5.0 g·L-1、硝酸鈉0.3 mmol·L-1和琥珀酸鈉 4.4 mmol·L-1，溶劑為蒸餾水，簡稱NBNS培養(yǎng)基)中，置于28 ℃搖床中在180 r·min-1振蕩培養(yǎng)約24 h，用無菌的NBNS液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600 nm約為1.0備用.進行田間原位試驗時，按照上述菌劑制備方法提前準(zhǔn)備菌劑，施肥當(dāng)天在每個試驗小區(qū)中將菌液和水充分稀釋后均勻施入田間.

1.2 溫室盆栽試驗

溫室盆栽試驗供試土壤采自江蘇省無錫市宜興市蔬菜地耕作層，土壤類型為黏質(zhì)砂壤土，前茬作物為青菜.宜興市地處江蘇省西南端、太湖東岸，位于長三角中心地帶，氣候為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，四季分明、雨熱同季.蔬菜地主要種植菠菜、青菜、番茄、黃瓜等.土壤采集后，自然風(fēng)干，過2 mm篩，室溫保存待用.供試土壤的理化性質(zhì)如表2所示.

培養(yǎng)缽裝土量(風(fēng)干土)為750 g/盆，有機肥施用量為0.4 g·kg-1，化肥(N、P2O5和K2O的質(zhì)量比為15∶15∶15)施用量為0.12 g·kg-1.番茄種子用無菌水浸泡10 min，接著用2%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，然后用無菌水連續(xù)沖洗8～10次，再用無菌水浸泡30 min，然后再次用無菌水沖洗2～3次，最后用無菌濾紙吸去番茄種子表面水分.將種子播撒到土壤表面，隨后將30 mL OD600 nm約為1.0的細菌懸浮液(107～108CFU·mL-1)接種于盆栽土壤中，未接種的對照澆灌等量的細菌液體培養(yǎng)基.每個處理重復(fù)4次.水肥管理按照常規(guī)管理進行.試驗處理和所用植物根際促生菌的信息如表1所示.

1.3 土壤微宇宙試驗

土壤微宇宙試驗供試土壤采自江蘇省南京市六合區(qū)水稻田耕作層土壤，土壤類型為馬肝土或水耕人為土(Stagnic Anthrosols)，種植制度為稻麥輪作，前茬作物為水稻.江蘇省南京市六合區(qū)位于滁河支流皂河上游.該地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，氣候溫和、四季分明，土壤類型以馬肝土、崗黃土、黃白土為主.土壤采集后，自然風(fēng)干，過2 mm篩，室溫保存待用.供試土壤的理化性質(zhì)見表2.

表2 供試土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of the tested soils

土壤微宇宙試驗不栽培任何植物，其他步驟同1.2.試驗所用植物根際促生菌的信息如表1所示.

表1 供試用植物根際促生菌菌株Table 1 Candidate strains of plant rhizosphere growth-promoting bacteria tested in this study

1.4 田間原位試驗

試驗地位于江蘇省南京市六合區(qū)(32°34′27″N，118°41′23″E)，為土壤微宇宙試驗的土壤樣品采集地點.土壤類型為馬肝土，耕作制度為稻麥輪作，前茬作物為水稻，土壤理化性質(zhì)如表2所示.

田間原位試驗為無作物的小區(qū)試驗，于2020年12月—2021年1月進行.田間原位試驗處理的分布為隨機區(qū)組設(shè)計，共3個處理，每個處理3個小區(qū)，每個小區(qū)4 m2，共9個小區(qū).處理1(CK)：施用復(fù)合肥(N-P2O5-K2O 15-15-15)3 kg/畝+NBNS液體培養(yǎng)基；處理2(NRCB010)：施用復(fù)合肥(N-P2O5-K2O 15-15-15)3 kg/畝+NRCB010菌液；處理3(NRCB026)：施用復(fù)合肥(N-P2O5-K2O 15-15-15)3 kg/畝+NRCB026菌液.菌液制備見1.1，每個小區(qū)菌液用量350 mL，用水稀釋至2 000 mL后，均勻地噴施在土壤表面.

1.5 樣品采集與分析

采用“靜態(tài)箱-氣相色譜法”進行氣體樣品采集與分析測定工作.采集溫室盆栽試驗和土壤微宇宙試驗的氣體樣品時，將培養(yǎng)缽放置在氣樣采集容器內(nèi)，于0、15和30 min 時各采集1次氣體樣品；在每次取樣時測量氣體采集容器內(nèi)部的溫度.在溫室盆栽試驗播種后的2、4、5、6、7、9、11、13、16、19、23 d采集氣樣，測定N2O通量；在土壤微宇宙試驗接種后的2、5、7、9、12、15、18 d采集氣樣，測定N2O通量.田間原位試驗的采氣箱由不透光的PVC材質(zhì)制成，箱體尺寸為50 cm×50 cm×60 cm.箱體頂部安裝溫度計用于測定箱體內(nèi)部的空氣溫度，側(cè)面設(shè)置采樣口，并做密閉處理.底座尺寸為60 cm×60 cm×30 cm，采樣前將底座下部埋入土中，保持水平，底座上部有凹槽.采樣時，將采樣箱放置在底座上，在底座與采氣箱的交接處加水實現(xiàn)液封，使水沒過交接處的縫隙，以保證采氣環(huán)境整體的密閉性.在采氣箱放置完成后的第0、15、30 min進行氣體樣品采集，并記錄對應(yīng)采氣時的箱體溫度.

采集的氣體樣品使用帶有電子捕獲檢測器的氣相色譜儀(Agilent 7890B)進行測量.氣相色譜儀的相關(guān)參數(shù)：前檢測器為火焰離子化檢測器(FID)，可測定CH4含量，工作溫度250 ℃，高純H2流量為60 mL·min-1，高純空氣流量為400 mL·min-1；后檢測器為微池電子捕獲檢測器(ECD)，可測定N2O含量，工作溫度為300 ℃，含5%甲烷的氬氣流量為2 mL·min-1.測量完成后，通過計算3個時間點N2O濃度的斜率，得到溫室盆栽試驗和土壤微宇宙試驗的N2O通量；進一步計算N2O累積排放量.利用以下公式[20]計算田間原位試驗的土壤N2O排放通量：

溫室盆栽試驗在播種12 d和24 d測量番茄的株高和莖粗，采集番茄地上部樣品，稱量植株鮮重和干重.

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和Origin 2021軟件進行處理和繪圖，采用IBM SPSS Statistics軟件對不同試驗處理進行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗，不同處理間統(tǒng)計差異顯著性(P<0.05)用不同的小寫字母表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 植物根際促生菌對番茄幼苗生長的影響

在溫室盆栽條件下，接種四株植物根際促生菌相對于未接種對照均不同程度地促進了番茄的生長(圖1).例如，在處理12 d時，與不接種植物根際促生菌的對照相比，接種菌株Lv5A、NRCB002、NRCB010和NRCB026對番茄幼苗的株高、莖粗、葉長和地上部干重均無顯著影響.然而，在處理24 d時，與不接種植物根際促生菌的對照相比，接種Lv5A顯著增加番茄幼苗的莖粗，莖粗增加了250%；顯著減少番茄幼苗的葉長.接種NRCB002顯著增加番茄幼苗的莖粗，增加了132%；顯著增加了番茄幼苗地上部干重，增加了105%.接種NRCB010顯著增加了番茄幼苗地上部干重，增加了31%.NRCB026對番茄幼苗的株高、莖粗、葉長和地上部干重均無顯著影響.

圖1 植物根際促生菌對番茄幼苗生長的影響Fig.1 Effects of plant rhizosphere-promoting bacteria on the growth of tomato seedling

2.2 溫室盆栽條件下，植物根際促生菌對土壤N2O排放特征的影響

在溫室盆栽條件下，接種四株植物根際促生菌相對于未接種對照土壤N2O排放特征各不相同(圖2).在溫室盆栽試驗中，一共監(jiān)測到2次主要的土壤N2O排放峰.第1次土壤N2O排放峰出現(xiàn)在施肥后2 d時，未接種對照處理的土壤N2O排放達到最大峰值為0.83 μg (N)·kg(土)-1·h-1，之后所有處理的N2O排放量呈現(xiàn)一定的下降趨勢；在施肥9 d后，土壤N2O排放量逐漸上升，至第11 d達到第2次峰值.與未接種對照處理相比，在達到第2次峰值時，NRCB010和NRCB026處理的土壤N2O排放量明顯降低，其中NRCB026處理的N2O排放量峰值最低，為0.11 μg(N)·kg(土)-1·h-1；而Lv5A和NRCB002處理的土壤N2O 排放量增多，其中NRCB002處理的土壤N2O排放量峰值最高，為0.69 μg(N)·kg(土)-1·h-1.試驗處理13 d后，所有處理的N2O排放通量趨于平穩(wěn).

圖2 植物根際促生菌對溫室盆栽試驗土壤N2O排放通量的影響Fig.2 Effects of plant rhizosphere-promoting bacteria on soil N2O flux in greenhouse pots

溫室盆栽試驗的番茄土壤N2O累積排放量如表3所示.各處理的土壤N2O累積排放量從高到低依次為CK>NRCB002>Lv5A>NRCB026>NRCB010.其中，Lv5A、NRCB010和NRCB026處理的土壤N2O累積排放量比未接種對照減少了30%以上.選取土壤N2O減排效應(yīng)較為明顯的菌株NRCB010和NRCB026用于土壤微宇宙試驗和田間原位試驗.

2.3 土壤微宇宙條件下，植物根際促生菌對土壤N2O排放特征的影響

在土壤微宇宙條件下，接種NRCB010和NRCB026均減少了土壤N2O排放通量(圖3).土壤N2O排放峰出現(xiàn)在施肥后9 d時，未接種對照處理的土壤N2O排放達到最大峰值為21.66 μg(N)·kg(土)-1·h-1，NRCB010和NRCB026處理的土壤N2O排放峰值呈現(xiàn)下降趨勢，其中NRCB026處理的土壤N2O排放峰值下降尤為明顯.N2O峰值出現(xiàn)后，所有處理的土壤N2O排放通量趨于平穩(wěn)，接近背景濃度.

圖3 植物根際促生菌對微宇宙試驗土壤N2O排放通量的影響Fig.3 Effects of plant rhizosphere-promoting bacteria on soil N2O flux in soil microcosms

在土壤微宇宙條件下，接種NRCB010和NRCB026均減少了土壤N2O累積排放量(表3).各個處理的土壤N2O累積排放量從高到低依次為 CK>NRCB010>NRCB026.NRCB026和NRCB010處理的土壤N2O累積排放量比未接種對照分別減少了21%和48%.

表3 植物根際促生菌對土壤N2O累積排放量的影響Table 3 Effects of plant rhizosphere-promoting bacteria on cumulative N2O emissions from soils in greenhouse pots,soil microcosms,and field plots

2.4 田間原位條件下，植物根際促生菌對土壤N2O排放特征的影響

在田間原位條件下，NRCB026和NRCB010處理的土壤N2O排放通量下降，以NRCB026更為明顯(圖4).在觀測期內(nèi)，所有處理的土壤N2O排放通量均比較平穩(wěn)，未觀測到明顯的土壤N2O脈沖峰.NRCB026處理在施肥后第20 d的N2O排放通量下降為負(fù)值.

圖4 植物根際促生菌對田間小區(qū)試驗土壤N2O排放通量的影響Fig.4 Effects of plant rhizosphere-promoting bacteria on soil N2O flux in field plots

NRCB026和NRCB010處理的土壤N2O累積排放量也明顯降低(表3).各個處理的土壤N2O累積排放量從高到低依次為CK>NRCB010>NRCB026.NRCB026和NRCB010處理的土壤N2O累積排放量比未接種對照分別減少了44%和73%.與未接種對照相比，NRCB026處理的土壤N2O累積減排量達到顯著水平(P<0.05).

3 討論

農(nóng)田土壤是溫室氣體N2O的重要排放源，目前關(guān)于農(nóng)田N2O的減排措施多數(shù)是通過改進肥料的用量、類型以及農(nóng)業(yè)管理措施等實現(xiàn)[21-29].最新的研究表明，在土壤、肥料或者植物根際接種具有N2O減排效應(yīng)的微生物可以減少N2O的排放[30-32].例如，在大豆根部接種根瘤菌可以通過N2O還原酶(N2OR)將N2O還原為N2，從而減少大豆田土壤的N2O排放[19].通過接種具有N2O還原功能的固氮細菌到牧草地土壤，在減少土壤N2O排放的同時還能促進紅花苜蓿和梯牧草的生長[16].本研究采用溫室盆栽試驗、土壤微宇宙試驗及田間原位試驗等方法，發(fā)現(xiàn)接種植物根際促生菌NRCB010和NRCB026能有效減少農(nóng)田土壤N2O的排放(圖2、3、4，表3).

農(nóng)田土壤N2O排放受N2O產(chǎn)生過程和還原過程綜合作用的影響，由多樣的微生物群落通過硝化、反硝化和異化硝酸鹽還原為銨等多種途徑共同決定.利用微生物減少N2O排放主要分為直接途徑和間接途徑.直接途徑是指接種具有編碼N2OR的nosZ基因的N2O還原微生物，進而直接增加N2O還原微生物的豐度，從而促進N2O還原成N2，減少土壤N2O的排放.在本研究中，菌株NRCB010和Lv5A均含有nosZ基因，它們均有較好的農(nóng)田土壤N2O減排的效果(圖2，表3)，其中NRCB010的減排效果略優(yōu)于Lv5A.間接途徑是指使用的植物根際促生菌并沒有nosZ基因，即菌株不具備直接還原N2O的能力，但卻能間接通過改變N2O還原微生物的群落豐度和組成，實現(xiàn)N2O減排的效果[33].在本研究中，NRCB002和NRCB026均不含有nosZ基因，NRCB026具有較好的農(nóng)田土壤N2O減排的效果，而未檢測到NRCB002減少農(nóng)田土壤N2O排放的效應(yīng)(圖2、3、4，表3).這些結(jié)果意味著不同菌種對農(nóng)田土壤N2O減排潛力明顯不同，也為篩選高效菌株、發(fā)展具有促生和減排效應(yīng)的生物肥料指明了方向.

農(nóng)田土壤N2O排放還受土壤類型、作物和溫度等因素影響.在本研究中，以江蘇宜興的蔬菜土為供試土壤的番茄溫室盆栽試驗中，減排效果最好的菌株為NRCB010(表3)，而在土壤微宇宙和田間原位試驗中的供試土壤為江蘇六合的水稻田土壤，減排效果最好的菌株為NRCB026.這些結(jié)果說明應(yīng)用植物根際促生菌減少農(nóng)田土壤N2O排放同樣可能受到供試土壤類型及作物的影響.在土壤微宇宙和田間原位試驗中的供試土壤同為江蘇六合的水稻土，但是在土壤微宇宙試驗時培養(yǎng)溫度恒定，而在田間原位試驗中的溫度為自然溫度，NRCB026和NRCB010對同種土壤的N2O累積排放量的削減程度也不同(表3).這些結(jié)果也說明應(yīng)用植物根際促生菌減少農(nóng)田土壤N2O排放同樣可能受到溫度條件的影響.在實際田間應(yīng)用時，應(yīng)充分考慮土壤類型、作物種類和環(huán)境條件等因素，選用的具有促生和減排效應(yīng)的微生物須與土壤-作物-環(huán)境相適宜，最大程度地發(fā)揮促生減排效應(yīng)、提升菌劑或生物肥料的農(nóng)學(xué)和生態(tài)環(huán)境效益.

4 結(jié)論

采用溫室盆栽試驗、土壤微宇宙試驗及田間原位試驗等方法，探究植物根際促生菌對農(nóng)田土壤N2O 排放的影響.在溫室盆栽條件下，接種四株植物根際促生菌的土壤N2O累積排放量從高到低依次為枯草芽孢桿菌枯草亞種NRCB002、白色芽孢桿菌Lv5A、暹羅芽孢桿菌NRCB026、施氏假單胞菌NRCB010，與未接種對照相比分別減少了2.3%、33.1%、34.2%和40.0%.在微宇宙條件下，接種NRCB010和NRCB026相對于未接種對照土壤N2O累積排放量分別減少了21%和48%.在田間原位條件下，接種NRCB010和NRCB026相對于未接種對照土壤N2O累積排放量分別減少了44%和73%.總之，NRCB010和NRCB026能有效減少農(nóng)田土壤N2O的排放，研究結(jié)果將為減少農(nóng)田土壤N2O排放提供重要科學(xué)依據(jù)，也將為發(fā)展具有促生和減排效應(yīng)的生物肥料提供實際指導(dǎo).NRCB010和NRCB026減少農(nóng)田土壤N2O排放的機制還需要進一步研究.