HPLC法測定化妝品中鹽酸美滿霉素等七種組分的條件優(yōu)化研究

王 穎 張 曲 韋靖婧 代仕梅 陳長安

（資陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川 資陽 641399）

化妝品常見添加的抗生素主要有氯霉素類、甲硝唑、四環(huán)素類、喹諾酮類咪唑類等。這些成分最常出現(xiàn)在祛痘抗粉刺類、祛螨類化妝品中。祛痘抗粉刺類化妝品是近年來檢測出非法添加抗生素最多的化妝品品種。這與痘痘（痤瘡）發(fā)病原理有關(guān)。痤瘡的發(fā)生主要與皮脂分泌過多、毛囊皮脂腺導(dǎo)管堵塞、細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)等因素密切相關(guān)，而局部外用抗生素本身就是治療痘痘的有效方式之一。但是人體長期接觸含抗生素的化妝品，易引起接觸性皮炎、抗生素過敏等癥狀，易產(chǎn)生耐藥性。藥物殘留還可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)等。化妝品的檢測規(guī)范，都將抗生素列為禁用物質(zhì)，即不得作為化妝品原料使用。

1 現(xiàn)行的檢測規(guī)范檢測條件試驗(yàn)情況

現(xiàn)行的檢測規(guī)范給出了鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素6 種抗生素和甲硝唑7種組分的測試方法。但方法中混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的配制中，未給出甲醇及0.1mol/L鹽酸溶液的具體用量，實(shí)際操作過程中只能一步一步嘗試，無法讓試驗(yàn)人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作；按照其給出的方法進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽酸美滿霉素色譜峰出現(xiàn)了雙峰且鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5（色譜圖見圖1），用現(xiàn)行檢測規(guī)范給出的檢測方法進(jìn)行檢測，無法對鹽酸美滿霉素等七種成分進(jìn)行準(zhǔn)確的分離和定量，所以需要對該檢測方法的條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 現(xiàn)行檢測規(guī)范給出的檢測方法色譜圖

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

樣品為膏霜類祛痘抗粉刺產(chǎn)品，10批（S1-S10）購于本市內(nèi)的各大型化妝品連鎖門店，化妝品的外觀標(biāo)識均符合相關(guān)規(guī)定；近年來網(wǎng)絡(luò)電商平臺發(fā)展迅速，尤其是直播電商購物風(fēng)頭正勁，但是直播電商購物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)商家或者是主播虛假夸大宣傳、商品質(zhì)量差、以次充好、假冒偽劣等情況，所以本試驗(yàn)特選取10批樣品（S11~S12）購于網(wǎng)絡(luò)（包括直播帶貨平臺）中，所購10批樣品中存在一批未標(biāo)注生產(chǎn)許可證號，兩批標(biāo)注有禁止用語（醫(yī)療術(shù)語）的情況。

鹽酸、磷酸、草酸優(yōu)級純：成都市科龍化工試劑廠；乙腈和甲醇為色譜純：美國賽默飛世爾科技公司；水為超純水；鹽酸美滿霉素、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氯霉素對照品來源于MANHAGE，甲硝唑?qū)φ掌穪碓从谥袊称匪幤窓z定研究院。

Agilent1260高效液相色譜儀（配DAD檢測器）：安捷倫公司；十萬分之一電子天平：梅特勒；pH計(jì)：梅特勒；超純水機(jī)；超聲波清洗器等。

2.2 方法

色譜柱：日本島津 Shim-pack VP-ODS 4.6mm×250 mm，反相柱5μm，柱溫：30℃，流速：0.8mL/min，進(jìn)樣量：10μL，檢測波長；268nm，流動(dòng)相：0.003mol/L草酸溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）∶乙腈 ∶甲醇（70 ∶10∶20）。

稱取7種抗生素對照品適量，用甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液溶解，配制質(zhì)量濃度為250 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再逐級稀釋成濃度約為2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和50mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取上述溶液10μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以峰面積A對進(jìn)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸（為質(zhì)量濃度，為峰面積），線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1，由表1可知7種抗生素的回歸方程線性較好，相關(guān)系數(shù)均在0.997以上。

表1 7種抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確稱取樣品 2.5 g（ 2份）于25mL具塞比色管中，加入甲醇 ∶鹽酸（0.01mol/L）（7 ∶3）溶液20mL，振搖均勻，超聲提取30min，冷卻至室溫后定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 優(yōu)化后質(zhì)量濃度

優(yōu)化條件后質(zhì)量濃度為5mg/L 7種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，見圖2。

圖2 優(yōu)化條件后質(zhì)量濃度為5mg/L 7種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一不含待測組分的樣品6份，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.50ml，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄6份樣品中鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的峰面積，七種抗生素6份樣品中峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.57%、0.55%、0.97%、0.86%、1.05%、0.78%、0.88%，表明其重現(xiàn)性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重現(xiàn)性試驗(yàn)的一份供試品溶液，室溫放置，分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h按上述色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的峰面積，七種抗生素在0h、2h、4h、8h、12h、24h的色譜峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.85%、0.65%、1.08%、0.93%、1.12%、1.67%、1.30%，表明其穩(wěn)定性良好。

3.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率表示，稱取不含待測組分的同一樣品9份，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.50mL，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00mL，3份精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.50mL，按照供試品溶液的制備方法制成3組不同濃度的樣品做三水平三平行的添加回收試驗(yàn)。記錄測定的峰面積，計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明7種抗生素的平均回收率為101.24%~109.29%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.36%~1.74%（=3），平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表2。

表 2 7 種抗生素的平均回收率和精密度（n=3）

3.5 方法檢出限與定量限

以信噪比（/）為3時(shí)對應(yīng)的濃度為檢出限，鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的檢出限分別為2.81mg/kg、3.68mg/kg、4.29mg/kg、2.65mg/kg、2.93mg/kg、3.82mg/kg和1.89mg/kg；以信噪比（/）為10時(shí)對應(yīng)的濃度為檢出限，鹽酸美滿霉素、甲硝唑、二水土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、鹽酸多西環(huán)素和氯霉素7種抗生素的定量限分別為9.37mg/kg、12.27mg/kg、14.30mg/kg、8.83mg/kg、9.77mg/kg、12.73mg/kg和6.30mg/kg。

3.6 樣品含量測定

20個(gè)樣品，每個(gè)樣品各平行稱取2份，每份約2.5g精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取制成的供試品溶液10μL注入液相色譜儀中，記錄7種組分的峰面積，利用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，各樣品的含量分別為S1：未檢出；S2：未檢出；S3：未檢出；S4：未檢出；S5：未檢出；S6：未檢出；S7：未檢出；S8：未檢出；S9：未檢出；S10：未檢出；S11：未檢出；S12：未檢出；S13：檢出甲硝唑，含量為546.46mg/kg；S14：未檢出；S15：未檢出；S16：未檢出；S17：未檢出；S18：未檢出；S19：未檢出；S20：未檢出。

4 分析方法的確定

4.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制溶劑及樣品制備用溶劑的選擇

由于0.01mol/L的鹽酸溶液的pH值為2.0，最接近流動(dòng)相的pH值所以選擇0.01mol/L的鹽酸溶液作為考察的對象，并選擇了甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（5∶5）三個(gè)比例進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)在配制混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液溶劑為甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)品均完全溶解，而溶劑為甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（6∶4）、甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（5∶5）時(shí)混合標(biāo)準(zhǔn)品有部分未溶解，因此，選擇甲醇∶鹽酸（0.01mol/L）（7∶3）溶液作為混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制溶劑。將其作為樣品制備用溶劑，發(fā)現(xiàn)其也能很好地提取出7種待測組分，為了簡化溶液的配制所以同時(shí)選擇其作為樣品制備用溶劑。

4.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

為了解決檢測時(shí)鹽酸美滿霉素色譜峰出現(xiàn)了雙峰且鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5的問題，筆者將從流動(dòng)相pH值、草酸溶液濃度、流動(dòng)相中各成分比例以及是否采取梯度洗脫等方面對流動(dòng)相條件進(jìn)行優(yōu)化。①在試驗(yàn)前的資料查詢中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的pH值會(huì)對七種組分的分離效果產(chǎn)生影響，pH值大于4時(shí)有些組分會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，pH值在2.0~3.0時(shí)7種組分可以較好的分離，但是流動(dòng)相pH值在2.0左右時(shí)對色譜柱的損傷較大，所以流動(dòng)相的pH值的考察選擇在2.5~3.0。②為了解決鹽酸美滿霉素出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象，筆者對草酸溶液的濃度進(jìn)行了考察。③為了解決鹽酸多西環(huán)素與氯霉素的色譜峰的分離度不能達(dá)到1.5的情況，筆者對流動(dòng)相的比例和流速進(jìn)行了考察。最后發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為0.003 mol/L草酸溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）∶乙腈∶甲醇（70∶10∶20），流速為0.8 mL/min時(shí)色譜峰的峰形以及分離度都較好；④參考文獻(xiàn)中多采用了梯度洗脫的方式，但是梯度洗脫液相色譜儀至少需要配置二元泵且梯度洗脫在試驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)基線漂移的情況，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不采用梯度洗脫的方式也能分離檢測7種待測組分，所以還是選擇固定流動(dòng)相比例來檢測。

4.3 20批樣品中添加7種抗生素的情況分析

20批樣品中購于正規(guī)化妝品連鎖店的10批樣品均未檢出其中組分，購于網(wǎng)絡(luò)（包括直播帶貨）的10批樣品有一批樣品檢出了甲硝唑，含量為546.46 mg/kg且該批樣品來源于直播帶貨平臺，存在未標(biāo)注生產(chǎn)許可證號且標(biāo)注有禁止用語（醫(yī)療術(shù)語）的情況?，F(xiàn)在不僅有淘寶、京東等電商平臺，抖音、快手、拼多多等直播帶貨平臺也日漸火爆，但是直播帶貨平臺商品的質(zhì)量較差，在日后的產(chǎn)品監(jiān)督檢測中應(yīng)加大其產(chǎn)品的監(jiān)督強(qiáng)度及頻次。

5 結(jié)論

該試驗(yàn)方法對鹽酸美滿霉素等七種組分現(xiàn)行檢測規(guī)范的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，從樣品的前處理提取液濃度和比例、流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相比例和流速、是否采取梯度洗脫等方面進(jìn)行了試驗(yàn)條件的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化后的試驗(yàn)方法前處理簡潔、靈敏度好、回收率高，能快速地對鹽酸美滿霉素等七種組分進(jìn)行準(zhǔn)確地分離和定量，可對膏霜類祛痘抗粉刺化妝品中的7種抗生素的含量進(jìn)行測定。