揮發(fā)性有機(jī)化合物檢測在食管-胃腸惡性腫瘤篩查中的研究進(jìn)展

張 兵，王宏志，儲焰南，陸 燕，葛殿龍，劉 玥

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高，世界范圍內(nèi)預(yù)期壽命增加，癌癥逐漸發(fā)展成為威脅人類壽命的重要疾病之一，并將成為未來家庭的主要經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)之一[1]。在所有腫瘤患者中，消化道腫瘤占所有癌癥發(fā)生率的50%[2]。消化道腫瘤中，早期食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌患者通常無明顯癥狀，因此普通體檢很難及時發(fā)現(xiàn)，而等到患者出現(xiàn)相關(guān)癥狀時，多處于疾病晚期，喪失手術(shù)機(jī)會，預(yù)后不佳。根據(jù)全球癌癥狀況最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2020)顯示[3]：食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌分別占癌癥相關(guān)死亡的第六、第四和第二位。在2020年，全球新增食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌的病例分別為60.4萬、100萬和190萬，因這些疾病死亡的病例分別為54.4萬、76.9萬和93.5萬。目前食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌的早期篩查主要依賴胃腸鏡檢查，但由于胃腸鏡檢查的體驗(yàn)感差，并且具有一定的創(chuàng)傷性和風(fēng)險(xiǎn)性，因此臨床普及率遠(yuǎn)低于醫(yī)學(xué)影像檢查。

人類呼出氣體中存在250余種揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds，VOCs)，它們的濃度大多在皮摩爾(10～12 mol/L)到納摩爾(10～9 mol/L)水平[4]。Broza指出某些病理情況下，尤其對惡性腫瘤患者，其體內(nèi)生成的VOCs會發(fā)生改變[5]。這主要是因?yàn)槟[瘤相關(guān)的炎癥導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，葡萄糖代謝改變，癌細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)可導(dǎo)致癌癥患者發(fā)生不同的VOCs信號改變[6-7]，利用靈敏度極高的儀器對消化道腫瘤患者呼出的VOCs進(jìn)行檢測，有可能識別出癌癥患者特有的“呼氣特征”。本文綜述了近年來利用揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)鑒定食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展，以檢驗(yàn)VOCs分析的診斷性能，這可能在臨床實(shí)踐中有應(yīng)用價(jià)值。

1 揮發(fā)性有機(jī)化合物概述

世界衛(wèi)生組織對VOCs的定義為：室溫下飽和蒸氣壓超過133.32Pa，沸點(diǎn)在50～260℃，常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機(jī)物。是除CO、CO2、H2CO3、金屬碳化物、金屬碳酸鹽、碳酸銨外，任何參與大氣光化學(xué)反應(yīng)的含碳化合物[8]。既往的研究認(rèn)為，VOCs廣泛存在于室外大氣及室內(nèi)空氣中[9]。人體呼氣中也含有多種VOCs，根據(jù)來源可將其分為外源性和內(nèi)源性化合物。外源性VOCs來源于環(huán)境因素，如食物和飲料的消費(fèi)、吸煙或其他環(huán)境暴露。內(nèi)源性VOCs是人體或微生物代謝的副產(chǎn)品或最終產(chǎn)物。因此，對腫瘤患者體內(nèi)VOCs的檢測，重點(diǎn)研究對象是內(nèi)源性VOCs，重點(diǎn)排除對象是外源性VOCs。人體VOCs可以在汗液、血液、病理組織、尿液和糞便中檢測到[10-12]，但呼氣VOCs是目前研究內(nèi)容較多的部分。

與傳統(tǒng)的血液、尿液及其他生物樣品比較，呼氣VOCs檢測具有下述優(yōu)點(diǎn)：①樣品采集為無損傷、非侵入式，不給受檢者帶來任何痛苦體驗(yàn)，感染傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)較小；②呼氣取樣方便，可重復(fù)多次采樣及進(jìn)行大規(guī)模的高通量篩查；③呼氣中的VOCs基質(zhì)成分相對簡單，分析便捷；④可提供揮發(fā)性代謝物信息，是血樣及尿樣代謝物的重要補(bǔ)充。正是由于上述優(yōu)點(diǎn)，呼氣VOCs檢測廣泛應(yīng)用于各種疾病的臨床研究。如Koureas[13]篩選出22種VOCs，可識別肺癌患者，靈敏度為100%，特異度為81.3%。Esfahani等[14]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者呼氣中丙酮濃度顯著高于健康人群，并根據(jù)5位健康人呼氣中丙酮濃度較高，判斷出其有患病風(fēng)險(xiǎn)。VOCs是人體代謝過程中的一項(xiàng)產(chǎn)物，其在呼出氣體中的存在形式，很大程度上取決于患者當(dāng)時的代謝狀態(tài)。呼氣成分的改變不僅可以由癌癥引起，還可以由其他潛在的內(nèi)源性和外源性影響因素引起，如禁食狀態(tài)、微生物群、吸煙、飲酒、藥物、各種并發(fā)疾病以及暴露于不同環(huán)境的空氣污染等，當(dāng)設(shè)計(jì)呼氣分析的診斷研究方案時，所有這些問題都應(yīng)被考慮進(jìn)去[15]。

2 揮發(fā)性有機(jī)化合物檢測方法

目前最常用的VOCs檢測技術(shù)有氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(PTR-MS)和選擇離子流動管質(zhì)譜(SIFT-MS)等。

氣相色譜質(zhì)譜分析(GC-MS)是綜合了氣相色譜法對有機(jī)化合物有效分離、分辨能力與質(zhì)譜法準(zhǔn)確鑒定化合物的聯(lián)合技術(shù)，可在計(jì)算機(jī)操控下，直接用氣相色譜分離復(fù)雜混合物樣品，使化合物逐個進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源，以電子轟擊，或化學(xué)離子化等方法，使每個樣品中所有的化合物均離子化。GC/MS結(jié)合樣品采集和富集技術(shù)，特別是固相微萃取技術(shù)(SPME)，進(jìn)一步加強(qiáng)了混合樣品中VOCs的分離和鑒定[16]。目前利用GC-MS技術(shù)可分析出人體的VOCs主要包括：烴類、醇類、醛酮類、芳香族類、羧酸類、胺類、硫醚、鹵代化合物等[17]。

PTR-MS為基于初級離子與待測化合物發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的直接質(zhì)譜分析技術(shù)[18]。水蒸氣在離子化區(qū)域經(jīng)空心陰極放電或放射源產(chǎn)生初級離子H3O+，引入的連續(xù)樣品氣流在漂移管中與H3O+混合，發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生樣品特征離子，從而被下游的質(zhì)量檢測器檢測到。PTR-MS具有快速篩查癌癥的潛力。它還具有極高的靈敏度，也可頻繁快速檢測[19]。但由于PTR-MS僅可提供待測物的特征質(zhì)荷比m/z信息，無法選擇不同的初級離子來分辨具有相同分子量的化合物，故PTR-MS適用于人體呼出氣目標(biāo)分析，對于不明確的物質(zhì)或非目標(biāo)物分析，還需結(jié)合其他分析手段進(jìn)行定性。

離子流動管質(zhì)譜(SIFT-MS)選擇的前驅(qū)離子在微波放電源中形成，通過質(zhì)量過濾器根據(jù)其質(zhì)荷比m/z選擇前驅(qū)離子，注入流動的氦載氣中，它們在流動管中形成熱群對流[15]。離子群/載氣的流速決定了反應(yīng)時間。通過對下游光譜儀/檢測系統(tǒng)前驅(qū)體離子和特征產(chǎn)物離子計(jì)數(shù)率的測量，實(shí)現(xiàn)了痕量和揮發(fā)性化合物的十億分之一體積(ppbv)或百萬分之一體積(ppmv)的絕對濃度測量[20]。

3 揮發(fā)性有機(jī)化合物在食管癌篩查中的應(yīng)用

食管癌是一種包含腺癌、鱗癌和小細(xì)胞癌的三種亞型且致死率高的癌種。全球范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率呈上升趨勢，這與其相關(guān)致病因素增加有關(guān)。大多數(shù)食管癌患者早期無明顯臨床癥狀，導(dǎo)致診斷時已處于疾病晚期，5年生存率不足15%。目前臨床早期診斷食管癌多依賴于胃鏡病理學(xué)活檢。但胃鏡檢查為有創(chuàng)性，且舒適性差，這成為許多患者放棄體檢的主要原因。在與食管癌相關(guān)的血清腫瘤標(biāo)志物方面，有學(xué)者利用meta分析回顧了抗p53、癌胚抗原、鱗狀細(xì)胞癌抗原、細(xì)胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)、血管內(nèi)皮生長因子-c和mi‐croRNA(miRNA)6種血清生化標(biāo)志物，盡管每項(xiàng)標(biāo)志物都與食管癌陽性優(yōu)勢比相關(guān)，但每種檢測的靈敏度及特異度均較低[21]。因此，需要尋找舒適性更好、更便捷的診斷方法，以便能夠篩查出處于早期階段的食管癌患者。

呼氣分析是早期發(fā)現(xiàn)癌癥的一種比較有吸引力方法，與傳統(tǒng)內(nèi)鏡檢查相比，呼氣分析完全是無創(chuàng)的、相對便宜的，并且在樣本收集后能夠快速提供檢測結(jié)果。目前已有文獻(xiàn)指出，該方法已經(jīng)在肺癌臨床檢測中得到應(yīng)用[22]。在食管癌檢測方面，英國帝國理工學(xué)院、國立衛(wèi)生研究院的Sheraz Markar[23]開展了一項(xiàng)多中心盲法驗(yàn)證性研究，共納入Ⅰ～Ⅲ期食管癌患者163例，對照組患者172例，對兩組分別進(jìn)行呼氣檢測，并通過矢量分析法得到5種揮發(fā)性有機(jī)物（丁酸、戊酸、己酸、正丁醛、癸醛），除戊酸外的其他4種揮發(fā)性有機(jī)物都與食管癌患者的人口學(xué)因素顯著相關(guān)，檢測靈敏度和特異度分別為84%和88%，操作者特征曲線面積(AUC)為0.90±0.02。而庫馬爾等[24]在《食管癌和胃腺癌中揮發(fā)性有機(jī)化合物生物標(biāo)志物的質(zhì)譜分析》中檢測得出食管癌組患者呼出氣體中的苯酚含量較非癌對照組高(P<0.001)。

Zou等[25]應(yīng)用中科院合肥研究院醫(yī)用質(zhì)譜團(tuán)隊(duì)自制的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜儀(PTR-MS)，檢測了29例食管癌患者和57例健康人的呼氣VOCs。應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)和逐步判別分析來識別呼氣質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的離子，同時還對受試者的呼氣結(jié)果進(jìn)行了工作特征曲線(ROC)分析。結(jié)果顯示，呼氣質(zhì)譜中的7種離子，即m/z 136、m/z 34、m/z 63、m/z 27、m/z 95、m/z 107和m/z 45，被認(rèn)為可能是食管癌患者的特征性離子，因?yàn)槠鋮^(qū)分食管癌患者和健康人的真陽性率為86.2%，真陰性率為89.5%。與健康人相比，食管癌患者呼氣質(zhì)譜顯示5種離子的中值強(qiáng)度降低，其余2種離子強(qiáng)度升高。ROC分析得出的曲線下面積(AUC)為0.943。說明PTR-MS檢測到的呼氣中VOCs的離子特性在用于區(qū)分食管癌患者和健康人組中有較大意義。隨著VOCs檢測技術(shù)靈敏度的提高，呼氣分析作為一種完全非侵入性的癌癥檢測新方法，初步顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。但是，也要正視到目前大多數(shù)的臨床研究都是概念性研究，并且這些研究多是在小群體中進(jìn)行的，還使用了不同的檢測分析技術(shù)，總體標(biāo)準(zhǔn)化程度不高，這些因素共同制約了VOCs檢測技術(shù)的臨床實(shí)用性能。

4 揮發(fā)性有機(jī)化合物在胃癌篩查中的應(yīng)用

胃癌是僅次于結(jié)直腸癌的常見消化道惡性腫瘤，其診斷晚、病死率高，已經(jīng)成為威脅人類生命健康的一大重要癌種。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌占癌癥死亡相關(guān)原因的第四位[3]。胃癌的臨床診斷多依賴于內(nèi)鏡篩查，但這項(xiàng)檢查手段對患者具有侵入性，經(jīng)濟(jì)成本也較高，在臨床推廣中遇到很大困難。傳統(tǒng)胃癌腫瘤標(biāo)志物檢測方法，如糞便隱血、癌胚抗原、CA-19-9、CA125等，由于診斷特異度差、靈敏度低，其診斷效果較胃鏡檢查尚有差距[26]。VOCs作為一種新的、非侵入性的生物學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢測方法，在早期胃癌無創(chuàng)篩查中有較好的應(yīng)用前景[27]。常用的揮發(fā)性內(nèi)源性化合物，其作為潛在的生物標(biāo)志物包括：碳?xì)浠衔?乙烷、戊烷和異戊二烯)、含氧化合物(丙酮、乙醛、甲醇、乙醇和2丙醇)[19]、含硫化合物(二甲基硫化物、甲基硫醇、乙基硫醇、以及二硫化碳)和含氮化合物(氨、二甲胺和三甲胺)[28-29]。烷烴、酮類和醛類是通過脂肪酸的氧化在人體內(nèi)形成的。丙酮是在碳水化合物代謝和脂質(zhì)過氧化過程中形成的[30]。在炎癥和氧化應(yīng)激時，它們的濃度會增加，這通常伴隨著癌癥的發(fā)生。

Bel'skaya等[31]探討了含氧唾液VOCs在胃癌及結(jié)直腸癌中的潛在診斷能力，以毛細(xì)管氣相色譜法對11例胃癌、19例結(jié)腸癌、16例健康志愿者的唾液標(biāo)本進(jìn)行了分析，檢測了樣本的脂質(zhì)過氧化物水平及過氧化氫酶活性。結(jié)果表明，唾液VOCs(乙醛、丙酮、丙醇-2及乙醇)可區(qū)分癌癥與健康者，靈敏度及特異度分別為95.7%、90.9%。甲醇水平可用于明確腫瘤部位，檢測胃癌及結(jié)直腸癌的靈敏度分別為80.0%、92.3%，特異度均為100%。說明唾液VOCs可用于診斷胃癌及結(jié)直腸癌。

Ligor等[32]檢測了呼氣及胃組織樣本中的VOCs以診斷癌癥。該研究從3例胃癌患者中收集了患者的呼氣及癌組織樣本，在呼氣及組織樣本中鑒定出丙酮、二硫化碳、2-丙醇、乙醇、乙酸乙酯，這些化合物為內(nèi)源性VOCs。計(jì)算二硫化碳、2-丙醇及正丁烷的丙酮比(AR)，發(fā)現(xiàn)正常組織的二硫化碳的AR高于癌組織。該研究方法的精密度RSD低于11%，線性范圍為2.8～136 ppb，檢測范圍為0.6～2.1 ppb。說明VOCs可用于區(qū)分正常組織與癌組織，在胃癌的診斷中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

Kumar[33]等采用SIFT-MS技術(shù)聯(lián)合內(nèi)鏡病理檢查，對10例胃癌患者的胃內(nèi)容物樣本進(jìn)行VOCs檢測，每個樣本重復(fù)檢測三次，并與健康者的胃內(nèi)容物樣本VOCs檢測結(jié)果進(jìn)行比對分析，最終得出7種(丙酮、甲醛、乙醛、己酸、硫化氫、氰化氫和甲基苯酚)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的VOCs。由此認(rèn)為胃內(nèi)容物可能是一種對胃癌診斷有一定指導(dǎo)意義的生物樣品，同時也能提高對上消化道疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。通過對胃內(nèi)容物VOCs檢測分析，我們推測可以鑒別出與胃癌相關(guān)的揮發(fā)性有機(jī)物，這可能有助于臨床開發(fā)出新的診斷方法。

5 揮發(fā)性有機(jī)化合物在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)為世界范圍內(nèi)第三大常見腫瘤，居腫瘤相關(guān)死亡原因的第二位[3]。多數(shù)患者就診時已處于疾病晚期，總體生存期明顯低于其他癌種。結(jié)直腸腫瘤通常由結(jié)腸息肉病變發(fā)展而來，其中涉及到遺傳學(xué)、組織學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，因此腸鏡檢查是目前臨床上篩查結(jié)直腸癌應(yīng)用最廣泛且最有效的方法，可顯著降低CRC的發(fā)病率和病死率[34]。同樣，結(jié)直腸鏡檢查過程中也存在一些并發(fā)癥和危險(xiǎn)因素：如進(jìn)鏡時可能引起肛門疼痛、腸黏膜損傷、腸道出血、穿孔，以及因內(nèi)鏡消毒不合格引起交叉感染等風(fēng)險(xiǎn)，目前臨床推廣存在困難。

揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）檢測在結(jié)直腸癌篩查中有一定應(yīng)用前景，Amann等[35]指出與腸道疾病有密切關(guān)聯(lián)的糞便VOCs檢測總量為381種，約為呼吸中揮發(fā)性物質(zhì)的一半。但由于從受檢者中獲得糞便樣本相對困難和腸道清洗等對腸道內(nèi)微生物種群的影響，目前大規(guī)模的糞便VOCs檢測分析研究較少。目前利用唾液VOCs來輔助診斷結(jié)直腸癌的研究較多。原因在于唾液在收集、儲存、輸送、采樣和處理方面有許多優(yōu)勢。血液在毛細(xì)血管中的溶解性物質(zhì)，可以快速通過唾液腺薄膜，從而形成唾液內(nèi)物質(zhì)含量與血液內(nèi)物質(zhì)含量相近或相似，因此在反映身體生理狀態(tài)方面，唾液檢測被認(rèn)為在功能上接近于血液檢測。此外，唾液的組成與血液和尿液中化學(xué)物質(zhì)的含量密切相關(guān)，如甲醇，2-丙醇和乙醇。乙醇和乙醛由人體內(nèi)源性形成[36]。乙醛的形成與酶酒精脫氫酶(ADH)和細(xì)胞色素p450的活動有關(guān)。無論這種機(jī)制如何，唾液和粘膜中的乙醛水平升高在致癌中起著重要作用。唾液中發(fā)現(xiàn)了一些消化道腫瘤的揮發(fā)性生物標(biāo)志物。例如有文獻(xiàn)[37]介紹了通過色度-晶體5000色譜儀上的毛細(xì)管氣相色譜法檢測胃癌(n=11)、結(jié)腸直腸癌(n=18)和健康對照組(n=16)唾液中的VOCs，研究結(jié)果顯示，唾液中的乙醛、甲醇和乙醇在胃癌患者中含量較高，而結(jié)腸直腸癌患者唾液中丙酮含量較高。與健康對照組相比，結(jié)腸直腸癌患者唾液中1-丙醇和2-丙醇含量減少。最終這些物質(zhì)用于檢測胃癌和結(jié)腸直腸癌的靈敏度分別為80.0%和92.3%。

在呼氣檢測方面，氣體VOCs也顯示出了一些，如Altomare等[38]最近使用GC-MS對37例結(jié)直腸癌患者和41例健康對照組呼出的氣體中VOCs進(jìn)行了對比分析，共得出58種VOCs被認(rèn)為與結(jié)直腸癌有一點(diǎn)關(guān)聯(lián)，對結(jié)直腸癌識別能力>90%的VOCs包括癸醛、1,2-戊二烯、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷和1,3-二甲苯。在血液檢測方面，Wang[39]等對16例結(jié)直腸癌(CRC)患者的血液VOCs檢測研究顯示，與健康對照組相比，其血液代謝生物標(biāo)志物發(fā)生了變化。CRC患者的苯基甲基氨基甲酸酯、乙基己醇和6-t-丁基-2,2,9,9-四甲基-3-5-癸二烯-7-炔水平較低，而1,1,4,4-四甲基-2,5-環(huán)己烷-二甲基水平較高。血液VOCs分析在CRC患者中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

6 總結(jié)

我國揮發(fā)性有機(jī)化合物檢測在臨床中應(yīng)用尚處于起步階段，與傳統(tǒng)的侵襲性診斷操作和血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物相比，揮發(fā)性有機(jī)化合物檢測具有無創(chuàng)，診斷靈敏度高、特異度好等優(yōu)勢，VOCs在疾病早期篩查中具有無與倫比的優(yōu)勢?，F(xiàn)有的設(shè)備已具備分析VOCs的能力，通過使用VOCs分析來檢測疾病和評估接觸揮發(fā)性有機(jī)化合物/氣體的情況，仍有許多挑戰(zhàn)需要克服，包括標(biāo)準(zhǔn)化、取樣方法和確定標(biāo)記等。相信在不久的將來，隨著色譜、質(zhì)譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用，VOCs在食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌早期篩查中必將發(fā)揮重要的作用。