基于鐵死亡的納米聯(lián)合療法在惡性腫瘤治療中的研究進展

王欽 劉軍杰 陸秀鑫 吳雅菲 綜述 張文皓 審校

惡性腫瘤長期嚴重威脅人類的健康與生命，其發(fā)病率逐年上升[1]。近年來，新興的生物醫(yī)學(xué)發(fā)展和技術(shù)創(chuàng)新為惡性腫瘤的治療提供了更多可能。其中，誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡(Ferroptosis)是最具代表性的抗腫瘤策略[2-4]。此外，隨著納米技術(shù)和生物材料技術(shù)的蓬勃發(fā)展，納米制劑介導(dǎo)的新型無創(chuàng)治療策略在腫瘤診斷與治療上表現(xiàn)出巨大的前景。納米制劑可由血液運輸直接遞送并聚集于腫瘤病灶區(qū)域，為精準靶向的非侵入腫瘤治療提供了可能。納米制劑既可以將腫瘤內(nèi)源性物質(zhì)作為底物驅(qū)動催化反應(yīng)，來調(diào)節(jié)其微環(huán)境以達到抗腫瘤的效果；又可以靶向遞送和可控緩釋臨床化療藥物，實現(xiàn)了惡性腫瘤的位點特異性治療。研究表明，納米制劑可特異性誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡[5]。因此，納米制劑介導(dǎo)的鐵死亡抗腫瘤療法的研究呈現(xiàn)出指數(shù)級的增長。本文就納米制劑誘導(dǎo)的鐵死亡作用機制及基于鐵死亡的聯(lián)合抗腫瘤療法的最新研究進展進行綜述，并總結(jié)了鐵死亡療法在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)。

1 納米制劑介導(dǎo)的腫瘤細胞鐵死亡作用機制

1.1 納米制劑促進腫瘤細胞內(nèi)芬頓反應(yīng)

腫瘤細胞鐵死亡過程具有鐵依賴性，鐵死亡期間亞鐵離子(Fe2+)水平會明顯增加[6]。高水平Fe2+會觸發(fā)芬頓反應(yīng)，顯著提高脂質(zhì)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平，進而與細胞內(nèi)不飽和脂肪酸反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物(LPO)，誘發(fā)細胞死亡[7]。為促進芬頓反應(yīng)，研究人員利用高性能納米遞藥系統(tǒng)或鐵基催化劑將外源性Fe2+遞送至腫瘤組織內(nèi)，最大程度地提高細胞內(nèi)ROS水平[8-9]。隨著鐵死亡研究的不斷深入，大量非鐵基納米制劑，如過渡金屬氧化物、金屬有機框架(MOF)、貴金屬以及碳基催化劑等，也被證實具有類芬頓反應(yīng)催化性能，可用于提高細胞內(nèi)ROS水平[10-13]。此外，芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS的能力還受限于腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)中H2O2的濃度[14]。高性能納米制劑能夠在腫瘤病灶區(qū)驅(qū)動級聯(lián)催化產(chǎn)生H2O2[15]，或是新型納米制劑將H2O2直接遞送至腫瘤組織內(nèi)[16]，從而確保高效芬頓反應(yīng)的發(fā)生。

1.2 納米制劑下調(diào)腫瘤細胞中GPX4表達

谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)是多種鐵死亡誘導(dǎo)劑的重要靶點，被認為是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]。GPX4作為細胞內(nèi)硒蛋白抗氧化酶表達受到嚴格調(diào)控，能夠有效清除強還原性ROS，進而抑制鐵死亡[18]。在特定的生物學(xué)背景下，可通過多種GPX4信號通路調(diào)控腫瘤細胞的鐵死亡敏感性[19]。目前，報道最多的是通過谷胱甘肽(Glutathione，GSH)耗竭并下調(diào)GPX4表達，誘發(fā)鐵死亡過程。研究表明，納米催化劑通過氧化還原反應(yīng)將還原型GSH氧化為L-氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione Oxidized，GSSG)，持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致GSH耗竭，使得GPX4中硒代半胱氨酸活性位點的GSH依賴性還原受損，從而導(dǎo)致GPX4通過β切割過程形成無氧還活性的脫氫丙氨酸和GPX4不可逆的功能失活[20]。此外，貴金屬催化劑如Au納米團簇通過形成強的Au-Fe鍵的方式來降低腫瘤組織內(nèi)的GSH水平，導(dǎo)致GPX4活性下降，觸發(fā)鐵死亡[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，細胞鐵死亡與二維納米片的表面空穴密度呈高度正相關(guān)性。這是因為納米片進入細胞溶酶體引發(fā)溶酶體膜損傷與Fe2+泄露，導(dǎo)致GPX4活性降低和LPO升高，從而加快細胞鐵死亡的發(fā)生[10]。

1.3 鐵死亡的其他作用機制

LPO增多是鐵死亡發(fā)生的主要特征。細胞膜脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸能夠經(jīng)過一系列反應(yīng)形成ROS，促進鐵死亡[7]。?；o酶A合成酶長鏈家族成員4和溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3能夠激活多不飽和脂肪酸，并影響多不飽和脂肪酸的跨膜特性，誘發(fā)鐵死亡[7，21]。研究表明，降低?；o酶A合成酶長鏈家族成員4和溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3的表達，可降低LPO在細胞中的積累，抑制鐵死亡[22]。此外，作為另外一種重要的鐵死亡抑制因子，鐵死亡抑制蛋白(FSP1)是非谷胱甘肽依賴的鐵死亡抑制蛋白，對GPX4缺失引起的鐵死亡有保護作用，可通過還原CoQ10來阻止脂質(zhì)氧化，從而抑制實體腫瘤的鐵死亡[23-24]。

2 基于鐵死亡的協(xié)同納米療法

2.1 鐵死亡協(xié)同化學(xué)動力學(xué)療法

化學(xué)動力學(xué)療法(Chemodynamic therapy，CDT)是一類催化內(nèi)源性H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)(或類芬頓反應(yīng))，產(chǎn)生強氧化性羥基自由基(·OH)用于腫瘤特異性治療的新技術(shù)[25]。由于TME中H2O2和鐵離子代謝水平不足，嚴重限制了CDT的治療效果。為此，Liu等[26]構(gòu)建了DMON@Fe0/AT多功能納米平臺，該多功能納米平臺響應(yīng)腫瘤弱酸微環(huán)境，釋放Fe3+和氨基三唑，氨基三唑可抑制過氧化氫酶活性，進而提高腫瘤內(nèi)Fe3+和H2O2濃度。同時，該多功能納米中的DMON組分通過耗竭GSH誘發(fā)腫瘤細胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達下調(diào)，干擾鐵代謝從而促使腫瘤細胞內(nèi)鐵富集。體外實驗及體內(nèi)實驗均證實DMON@Fe0/AT不僅發(fā)揮了高效的抗腫瘤作用，而且具有低毒性，為CDT協(xié)同的鐵死亡模式提供了一種新型的納米治療策略。Yang等[27]通過在超薄MgFe層狀雙氫氧化物納米片上負載PEG包封青蒿素(Art)構(gòu)建了一種新型納米雜化物A@P/uLDHs。A@P/uLDHs不僅能夠原位激活A(yù)rt，并且可自循環(huán)在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生以C為中心的自由基，同時伴隨GSH耗竭，引發(fā)鐵死亡。在體外實驗中，A@P/uLDHs培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細胞顯示出較低的細胞內(nèi)GSH水平，并且明顯抑制腫瘤細胞增殖。在體內(nèi)抗腫瘤方面，使用A@P/uLDHs治療的小鼠的平均相對腫瘤體積比使用Art治療的小鼠小20倍并且生存期顯著延長至54天。體外和體內(nèi)實驗結(jié)果均表明A@P/uLDHs是一種高效的納米劑，可用于鐵死亡增強CDT治療。此類研究策略從功能性鐵離子生物學(xué)代謝的獨特角度出發(fā)，實現(xiàn)了鐵死亡與CDT的有機協(xié)同，顯著增強了抗腫瘤效果。

為了實現(xiàn)藥物對腫瘤的特異性靶向遞送，并延長化療藥物的血液循環(huán)時間，迫切需要構(gòu)建簡單和具有生物相容性成分的一體化納米平臺以促進多模式腫瘤治療。史向陽團隊利用具有優(yōu)異生物安全性和生物相容性的天然植物多酚單寧酸(TA)與Fe3+之間的配位作用原位形成負載阿霉素的TAF納米復(fù)合物，通過氫鍵作用力將纖連蛋白(FN)包覆于復(fù)合物，構(gòu)建了DOX-TAF@FN納米平臺[28]。DOX-TAF@FN在酸性TME中比在正常組織中表現(xiàn)出更好的MR成像性能和顯著的抗腫瘤療效。這是因為TAF在弱酸性TME中解離后，TA將Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+，觸發(fā)腫瘤內(nèi)的芬頓反應(yīng)，生成·OH，并進一步消耗GSH，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡，最終利用FN的修飾促進藥物的靶向遞送，通過CDT聯(lián)合化療實現(xiàn)增強鐵死亡介導(dǎo)的免疫原性細胞死亡(ICD)，為構(gòu)建簡單和具有生物相容性的一體化納米平臺奠定了基礎(chǔ)。

目前，基于鐵死亡協(xié)同CDT抗腫瘤研究已取得較大進展。然而，協(xié)同策略治療的作用機制尚不明晰。同時，實現(xiàn)此類藥物的臨床轉(zhuǎn)化仍需對其長期療效和體內(nèi)降解性等因素進行有效評估。

2.2 鐵死亡協(xié)同光動力療法

鐵死亡聯(lián)合光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)已被廣泛研究應(yīng)用于癌癥治療[29-30]。PDT是一種新型非侵入性臨床腫瘤治療方法，其工作原理是對聚集在腫瘤組織區(qū)域的光敏劑進行照射，當(dāng)光敏劑受光激發(fā)后將電子轉(zhuǎn)移給周圍O2分子，產(chǎn)生毒性單線態(tài)氧(1O2)殺死腫瘤細胞[31]。PDT基于光和ROS精準定位，具有高效、非侵入性、高度時空可控性和低耐藥性等優(yōu)點[32-34]，在抗腫瘤治療方面展現(xiàn)出巨大的前景。然而，由于PDT的光穿透組織的能力有限，且耗氧量高，限制了其對TME缺氧區(qū)域中深部轉(zhuǎn)移灶的治療作用。為此，Chen等[29]設(shè)計了一種多功能的聚納米系統(tǒng)Fe3O4-PLGA-Ce6，該納米系統(tǒng)能夠在弱酸性TME中解離并釋放Fe2+/Fe3+和Ce6。釋放的Fe2+/Fe3+誘發(fā)腫瘤細胞鐵死亡，并與TME中過量的H2O2發(fā)生類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生·OH；釋放的Ce6在激光照射下產(chǎn)生大量1O2，從而實現(xiàn)鐵死亡-PDT協(xié)同抗腫瘤效果。在體內(nèi)實驗中，大量Fe3O4-PLGA-Ce6納米制劑在腫瘤部位積聚，表明Fe3O4-PLGA-Ce6納米制劑具有很好的腫瘤靶向性和滯留性，并且腫瘤抑制率高達92.4%。因此，F(xiàn)e3O4-PLGA-Ce6納米制劑具有鐵死亡和PDT的協(xié)同治療作用，可能是未來臨床轉(zhuǎn)化的一種有前途的納米輔助藥物。

高效納米制劑的可控制備在近十年來得到迅速發(fā)展，但其仍面臨藥物負載能力低、生物毒性與代謝、臨床轉(zhuǎn)化難等多種問題[35-36]。與其他納米顆粒載體不同，外泌體作為遞送載體，含有跨膜蛋白，可增強內(nèi)吞作用，在腫瘤治療中表現(xiàn)出強的生物相容性、低免疫原性和強滲透性和滯留效應(yīng)等優(yōu)點，有望成為臨床應(yīng)用的載體[37]。Du等[38]構(gòu)建的載藥外泌體(Er/RB@ExosCD47)可借助CD47表面功能化而逃避單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬，增加其在腫瘤組織內(nèi)的分布，并釋放Erastin，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡；此外，光敏劑在532 nm激光照射下，可誘導(dǎo)PDT產(chǎn)生ROS。在體內(nèi)實驗中，Er/RB@ExosCD47具有更低的全身毒性，更高的鐵死亡-PDT的聯(lián)合治療效率，能有效地誘導(dǎo)荷瘤小鼠的腫瘤體積在100 mm3左右，顯著延緩了腫瘤的生長，為實現(xiàn)高效靶向的鐵死亡-PDT聯(lián)合治療惡性腫瘤提供了新思路。

2.3 鐵死亡協(xié)同光熱療法

光熱療法(Photothermal therapy，PTT)由于其侵襲性小、毒性低和操作方便等固有優(yōu)勢，是一種有前景的抗腫瘤新策略[39]。PTT與PDT類似，也是一種借助外源光源新型腫瘤治療策略，即光熱劑在特定波長的光照射下，通過升高腫瘤區(qū)域的溫度來實現(xiàn)腫瘤細胞的消殺[40]。盡管PTT可利用熱量達到殺滅腫瘤細胞的效果，但在PTT過程中，會誘導(dǎo)腫瘤細胞大量表達熱休克蛋白(HSP)增強腫瘤細胞的修復(fù)功能，并且提高腫瘤細胞對熱應(yīng)激的耐受程度[41]。有研究表明，在鐵死亡過程中細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS和LPO的上調(diào)可抑制HSP表達[42]，進而阻斷腫瘤細胞對熱應(yīng)激的自我保護作用。此外，根據(jù)阿倫尼烏斯(Arrhenius)方程，當(dāng)環(huán)境溫度從20℃升至50℃時，芬頓反應(yīng)速率增加約四倍[30，43]。因此，鐵死亡-PTT聯(lián)合療法將是一種高效和安全的抗腫瘤治療新策略。Zeng等[44]將克酮酸分子作為鐵螯合劑和光熱轉(zhuǎn)換試劑，利用牛血清白蛋白對其進行包裹，構(gòu)建了一種基于克酮酸的具有高生物相容性的納米顆粒(Cro-Fe@BSA)。在腫瘤環(huán)境中，Cro-Fe@BSA具有可激活的光熱效應(yīng)。在不受激光照射的情況下，Cro-Fe@BSA納米粒子使4T1細胞活力為(55.0±4.5)%，而在激光照射8 min后，細胞活力降為(13.5±2.3)%。同時，在激光照射下，Cro-Fe@BSA納米粒子使腫瘤細胞Fe3+水平有一定程度的提高，這表明Cro-Fe@BSA納米粒子在消耗細胞內(nèi)GSH的同時能產(chǎn)生Fe3+。此外，Cro-Fe@BSA+激光處理4T1細胞的LPO和ROS上調(diào)，HSP70水平明顯下調(diào)，而加入Fer-1后細胞HSP70表達恢復(fù)，這些結(jié)果表明上調(diào)的LPO和ROS可破壞細胞內(nèi)的HSP，從而阻止細胞對PTT的自我保護機制。這是由于類芬頓反應(yīng)的溫度依賴性使光熱效應(yīng)能夠促進自由基的形成，而熱誘導(dǎo)形成的HSP會被鐵死亡過程中產(chǎn)生的ROS破壞，從而解決腫瘤細胞對于熱的自我保護機制，并且Cro-Fe@BSA納米粒子也可以實現(xiàn)可激活的光聲和磁共振成像，為設(shè)計新型高效的納米診療藥物實現(xiàn)多策略抗腫瘤提供了新策略。

2.4 鐵死亡與多種療法的聯(lián)合

由于存在腫瘤異質(zhì)性，鐵死亡誘導(dǎo)策略聯(lián)合其他單一療法仍無法達到預(yù)期的治療效果。目前，已有研究嘗試通過構(gòu)建多功能納米平臺將多種治療方法與鐵死亡相聯(lián)合，實現(xiàn)多模式增強的腫瘤治療效果[28，45-46]。例如Bai等[45]通過基因工程構(gòu)建了表達轉(zhuǎn)鐵蛋白的細胞膜納米囊泡，并將其用于包裹IR820-二氫青蒿素納米藥物(Tf@IR820-DHA)，Tf@IR820-DHA具有良好的腫瘤靶向性和負載Fe(Ⅲ)的能力，能夠有效地將Fe(Ⅲ)和IR820-DHA納米顆粒遞送到病變部位。在體內(nèi)抗腫瘤實驗中，荷瘤的C57BL/6小鼠注射Tf@IR820-DHA納米顆粒+超聲治療后相對于其他治療組表現(xiàn)出更加顯著的抗腫瘤效果，小鼠腫瘤幾乎消失。這是因為該納米顆粒通過激活的三重氧化應(yīng)激放大(DHA誘導(dǎo)的CDT、GSH消耗誘導(dǎo)的鐵死亡、IR820介導(dǎo)的聲動力治療)，能夠?qū)崿F(xiàn)高水平、腫瘤靶向性ICD，顯著增加分泌IFN-γ的T細胞(CD4+T和CD8+T)的比例，從而增強a-PD-L1介導(dǎo)的免疫檢查點阻斷治療。因此，這些多功能治療組合，將多種治療方式整合到一個納米系統(tǒng)中，在肝癌小鼠模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果，與單一療法相比顯示出明顯的優(yōu)勢。此外，Xiong等[46]制備了一種由DOX、TA和光敏劑IR820組裝而成的納米激活劑(DAR)，實現(xiàn)了化療、PDT、鐵死亡及免疫治療相聯(lián)合的治療效果，顯著抑制了荷瘤小鼠的腫瘤生長，DAR治療組小鼠的腫瘤經(jīng)過治療后幾乎不再生長。

基于鐵死亡發(fā)展的多策略協(xié)同抗腫瘤治療效果比單一療法表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。開發(fā)多功能智能化的治療系統(tǒng)對發(fā)展基于鐵死亡的多策略療法具有十分重要的意義。然而，這些新型聯(lián)合多策略療法還存在一些缺陷和潛在風(fēng)險，阻礙其進一步的臨床應(yīng)用。首先，這些納米組合系統(tǒng)的復(fù)雜性難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。其次，無法準確計算出多種療法之間的協(xié)同效應(yīng)。最后，多種藥物或方法聯(lián)合是否會導(dǎo)致藥物毒性和副作用的疊加尚不明確。

3 小結(jié)與展望

新興的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的治療方法相結(jié)合已成為癌癥治療的趨勢。鐵死亡作為癌癥治療的一個新靶點，在腫瘤生物學(xué)和抗腫瘤治療中受到廣泛的關(guān)注。本綜述闡述了該領(lǐng)域的最新趨勢，著重強調(diào)了以鐵死亡誘導(dǎo)劑為基礎(chǔ)的納米制劑的開發(fā)以及基于鐵死亡的納米技術(shù)和其他治療方式相結(jié)合的聯(lián)合應(yīng)用。目前，以鐵死亡為基礎(chǔ)的惡性腫瘤治療取得了諸多成果及研究進展，多種調(diào)控鐵死亡的酶的存在使得靶向治療的應(yīng)用成為可能。然而，基于鐵死亡的惡性腫瘤納米療法仍處于探索階段，在臨床實踐中仍存在諸多問題亟待解決，首先，鐵死亡誘導(dǎo)劑具有潛在毒副作用，如何在保證腫瘤特異性誘導(dǎo)鐵死亡的前提下，同時避免對正常組織的脫靶毒性效應(yīng)仍具有較高挑戰(zhàn)性；其次，對于納米制劑設(shè)計過程中產(chǎn)生的疊加毒性及工業(yè)可行性仍需進一步評估。因此，未來仍需更多研究來深入探索基于鐵死亡納米制劑的研發(fā)，需綜合多方面因素，才能設(shè)計出安全有效的新型納米制劑。