碳納米管對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的毒性研究進(jìn)展1

申惠娟，韓太坤，鄧鋰強(qiáng)，賴國(guó)霞，祁玲敏，寧土榮

(廣東石油化工學(xué)院 理學(xué)院，廣東 茂名 525000)

納米材料為至少一維方向上的尺度在1～100 nm范圍內(nèi)的材料，由于其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)，已在機(jī)械力學(xué)、電學(xué)、光學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。由于碳納米管具有比表面積大、抗拉伸能力強(qiáng)、耐高溫及導(dǎo)電性能好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1，2]。與眾多其他納米材料類似，其小尺寸與大的比表面積可以使其發(fā)揮出獨(dú)特的化學(xué)特性，如可以作為催化劑或用于治療功能的靶向藥物運(yùn)載，但治療的同時(shí)，也會(huì)誘導(dǎo)周圍其他組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，甚至損壞細(xì)胞功能[3]。早在2009 年，美國(guó)和歐盟已經(jīng)分別加強(qiáng)了對(duì)碳納米管的應(yīng)用與管理的控制[4]。因此，關(guān)于碳納米管可能帶來(lái)的潛在健康危害也在被廣泛研究。碳納米管的毒性與許多因素有關(guān)，如單壁碳納米管的毒性會(huì)隨其功能化和表面活性劑濃度以及碳納米管的理化性質(zhì)(如結(jié)構(gòu)、直徑、金屬含量)不同而異[5]；多壁碳納米管的生物毒性則與其長(zhǎng)度、形狀和硬度等物性參數(shù)有關(guān)[6]；有研究表明，同樣條件下，不同層數(shù)碳納米管的生物毒性大小順序?yàn)椋簡(jiǎn)伪谔技{米管 > 雙壁碳納米管 > 多壁碳納米管[7]。隨著碳納米管在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，人們?cè)谘芯亢椭苽涮技{米管的過(guò)程中，就會(huì)暴露在碳納米管氛圍中，通過(guò)皮膚或呼吸道等，增加碳納米管進(jìn)入體內(nèi)的機(jī)會(huì)[8]。而隨著碳納米管的相關(guān)下游產(chǎn)品的大量涌入市場(chǎng)，進(jìn)入到生活及各種應(yīng)用領(lǐng)域后，碳納米管將會(huì)擴(kuò)展到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)包括動(dòng)物、植物及水體等。因此，研究碳納米管的生物毒性及其與不同生物種類的相互作用機(jī)理，對(duì)于合理利用和有效監(jiān)管碳納米管的應(yīng)用具有重要的意義。到目前為止，針對(duì)碳納米管材料的毒性研究資料尚不夠充足，缺乏更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與細(xì)節(jié)的支撐[9]，本文總結(jié)了近幾年關(guān)于碳納米管在該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步推動(dòng)相關(guān)工作的進(jìn)程提供重要參考。

1 碳納米管對(duì)人體及動(dòng)物組織的毒性研究

碳納米管由于獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，可以攜帶多種分子透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)。多項(xiàng)研究已經(jīng)表明，碳納米管可以迅速分布到肝、腦、心臟、腎、肺、脾、胃等多個(gè)器官組織，并引起器官組織損傷，造成生殖毒性、遺傳毒性、肝腎功能減退等各種病變[10-14]。

丁世平等[15]研究了聚乙二醇改性多壁碳納米管對(duì)人胚腎細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。在作用24 h后，隨著碳納米管的質(zhì)量濃度從0增加到200 μg/mL，人胚腎細(xì)胞的形貌發(fā)生了明顯改變，壞死細(xì)胞的數(shù)量明顯增加；當(dāng)碳納米管的質(zhì)量濃度高于12.5 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞的存活率隨碳納米管濃度的增加而降低。同樣，碳納米管對(duì)人體肝細(xì)胞形貌及細(xì)胞存活率的影響與人胚腎細(xì)胞類似，而該碳納米管對(duì)兩種細(xì)胞的毒性對(duì)時(shí)間的依賴性體現(xiàn)得并不明顯。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析了細(xì)胞的存活性與碳納米管濃度的關(guān)系，證明碳納米管的毒性質(zhì)量濃度范圍為100～200 μg/mL，并根據(jù)ISO2109932-5毒性標(biāo)準(zhǔn)，表明該碳納米管在該范圍內(nèi)的毒性等級(jí)為II級(jí)，即具有輕微毒性。

趙琢等[13,14]研究了單壁碳納米管和多壁碳納米管對(duì)人體肝細(xì)胞HepG2的致毒性。結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，單壁碳納米管對(duì)人體肝細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用更強(qiáng)；同時(shí)，延長(zhǎng)碳納米管的作用時(shí)間對(duì)該肝細(xì)胞的抑制效果更明顯。在研究單壁碳納米管對(duì)肝的代謝能力及相關(guān)代謝酶的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單壁碳納米管處理后，肝細(xì)胞HepG2中的幾種重要的肝代謝酶包括CYP1A1、GSTP1和COMT的表達(dá)能力明顯降低。分析認(rèn)為，降低的原因有可能來(lái)自實(shí)驗(yàn)中的SWCNT導(dǎo)致體內(nèi)雌激素積累；而另一方面，這幾種代謝酶表達(dá)水平的降低，同時(shí)也削弱了肝細(xì)胞的毒性代謝能力，從而使碳納米管對(duì)肝細(xì)胞的損傷程度加重。同樣的效果也表現(xiàn)在多壁碳納米管對(duì)人體肝細(xì)胞HepG2的毒性研究中。隨著多壁碳納米管濃度與作用時(shí)間的增加，人體肝細(xì)胞HepG2的存活率明顯下降。而且，多壁碳納米管對(duì)肝代謝酶CYP1A1和GSTP1的影響顯示，隨著多壁碳納米管濃度增加，肝代謝酶CYP1A1的蛋白含量與表達(dá)水平逐漸降低；然而，與單壁碳納米管不同的是，多壁碳納米管濃度增加后，另一種肝代謝酶GSTP1的表達(dá)水平和蛋白含量得到了明顯提高。由于肝代謝酶GSTP1是致癌細(xì)胞代謝酶中重要的成員之一，負(fù)責(zé)毒性物質(zhì)的代謝及解毒，因此，該結(jié)果表明，多壁碳納米管存在于人體肝細(xì)胞HepG2中時(shí)，可以誘導(dǎo)肝代謝酶GSTP1的表達(dá)，增強(qiáng)肝細(xì)胞的排毒功能，從而降低多壁碳納米管對(duì)肝臟的毒性作用。

謝雪平等[16]研究了靜脈注射羧基化單壁碳納米管對(duì)大鼠腎臟的毒性作用。分別靜脈注射羧基化單壁碳納米管葡萄糖溶液30～90 d，以30 d為間隔進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，30 d后，大鼠的腎小球、細(xì)胞核和線粒體發(fā)生明顯變化；與未注射的對(duì)比，注射后的大鼠出現(xiàn)腎臟血管壁增厚，管腔擴(kuò)張及纖維組織增生等現(xiàn)象；連續(xù)染毒90 d后注射組的大鼠腎臟驗(yàn)證和纖維化程度最嚴(yán)重，但停止染毒30 d后，癥狀可以緩解。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)期靜脈注射羧基化單壁碳納米管會(huì)損傷大鼠的腎臟，引發(fā)腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)和腎纖維化。

2 碳納米管對(duì)水體動(dòng)物的毒性病理研究

大多數(shù)對(duì)碳納米管的毒性研究對(duì)象主要集中于淡水生物，而對(duì)海洋生物的毒性研究較少。楊占寧等[17]以太平洋牡蠣為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了單壁碳納米管對(duì)海洋生物的毒性。首先對(duì)照鰓和消化腺的氧化損傷程度顯示，在暴露于單壁碳納米管中96 h后，鰓和消化腺的抗氧化酶活性均顯著升高，且隨著碳納米管濃度的升高而增大。繼而研究?jī)煞N組織中MDA含量的變化情況發(fā)現(xiàn)，在暴露96 h后，兩種組織中的MDA含量均出現(xiàn)明顯增加，且消化腺中的MDA含量隨碳納米管濃度的增加而增大，另一方面，鰓則即使在低質(zhì)量濃度下(0.1 mg/L)，其MDA含量仍明顯高于對(duì)照組，表明鰓相對(duì)于消化腺更容易受到損傷。

目前，碳納米管對(duì)水生物的毒性研究大多來(lái)自歐美等國(guó)家，因此研究對(duì)象主要以水蚤和斑馬魚(yú)等為主，而我國(guó)在這方面的研究則以普遍存在的鯽魚(yú)或鯉魚(yú)為研究對(duì)象。如闞海峰等[18]研究了單壁碳納米管和羥基化多壁碳納米管對(duì)錦鯽抗氧化防御系統(tǒng)的影響。分別將錦鯽暴露在不同濃度的單壁碳納米管和羥基化多壁碳納米管環(huán)境中14 d后，發(fā)現(xiàn)兩種不同濃度的碳納米管均對(duì)錦鯽魚(yú)鰓造成了損傷。其中，暴露在低質(zhì)量濃度下(10 μg /L)的魚(yú)鰓會(huì)出現(xiàn)鰓絲膨脹腫大；高質(zhì)量濃度下(1000 μg /L)的魚(yú)鰓則出現(xiàn)鰓動(dòng)脈瘤和鰓細(xì)胞水腫等使魚(yú)鰓完全喪失功能。在對(duì)錦鯽的肝臟染毒14 d后，高濃度下的單壁碳納米管和羥基化多壁碳納米管僅引起肝細(xì)胞炎癥等輕微損傷，低濃度下則未對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。主要原因可能是魚(yú)鰓在呼吸過(guò)程中過(guò)濾大量的水，導(dǎo)致該部位更容易受到碳納米管的毒性侵染。通過(guò)研究?jī)煞N納米管對(duì)錦鯽抗氧化防御系統(tǒng)的影響發(fā)現(xiàn)，在暴露初期(7 d)，抗氧化酶SOD活性均增強(qiáng)，高濃度的單壁碳納米管對(duì)CAT產(chǎn)生抑制作用，而羥基化多壁碳納米管對(duì)CAT產(chǎn)生顯著誘導(dǎo)作用；14 d后，高濃度單壁碳納米管對(duì)SOD 產(chǎn)生抑制作用，而羥基化多壁碳納米管則使SOD酶活性提高，且單壁碳納米管對(duì)CAT產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用；經(jīng)過(guò)28 d后，各濃度下的兩種碳納米管對(duì)SOD酶和CAT酶產(chǎn)生了顯著抑制，導(dǎo)致肝臟受損。可見(jiàn)，碳納米管的暴露會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，增加了錦鯽體內(nèi)活性氧的積累，大量的活性氧會(huì)消耗體內(nèi)的抗氧化酶，從而損傷錦鯽組織。

以兩棲動(dòng)物為測(cè)試對(duì)象研究碳納米管的毒性目前也相對(duì)較少，趙建彬等[19]以兩棲動(dòng)物熱帶爪蛙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究不同濃度多壁碳納米管在爪蛙不同生長(zhǎng)階段的毒性效應(yīng)。首先通過(guò)多壁碳納米管對(duì)爪蛙胚胎進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。研究表明，經(jīng)過(guò)96 h后，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度(25， 50 mg/L)的碳納米管均對(duì)爪蛙胚胎的存活率造成了顯著的影響。在較高質(zhì)量濃度(50 mg/L)下，不同時(shí)期的胚胎死亡率最高位為8.96%，表明多壁碳納米管對(duì)早期的爪蛙胚胎急性毒性較低。高濃度下的多壁碳納米管對(duì)胚胎孵化率、畸形率的影響較低濃度的明顯，而兩種濃度下對(duì)胚胎的心率和體長(zhǎng)的影響與對(duì)照組相差不大。在爪蛙的蝌蚪階段，隨著多壁碳納米管暴露時(shí)間的增加，蝌蚪的死亡率先增高后下降。進(jìn)一步研究多壁碳納米管在蝌蚪體內(nèi)的富集部位發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)72 h暴露后，碳納米管主要集中在蝌蚪的腸、胃和鰓部位，而且濃度較高下的碳納米管更容易集中于鰓。后期將其置于清水中恢復(fù)4 d，低質(zhì)量濃度下(0.5 mg/L)的蝌蚪只有43.3%恢復(fù)健康，而高濃度下的蝌蚪全部死亡，可見(jiàn)多壁碳納米管在體內(nèi)的富集會(huì)導(dǎo)致不可逆的損傷。在爪蛙成年階段，研究顯示多壁碳納米管對(duì)爪蛙的體重增長(zhǎng)具有一定的抑制作用，并且減少體內(nèi)精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)對(duì)遺傳毒性的研究表明，暴露于碳納米管顆粒環(huán)境中的爪蛙受精率明顯降低，且已受精后的胚胎存活率也會(huì)下降，可見(jiàn)碳納米管對(duì)爪蛙存在一定的生殖毒性。

3 碳納米管對(duì)植物的毒性研究

碳納米管的納米尺寸使其極易被植物吸收，碳納米管通過(guò)植物的根系吸附在植物表面，并逐漸與植物的細(xì)胞膜結(jié)合；或者直接穿透植物的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。目前關(guān)于碳納米管對(duì)植物的影響研究中，既有促進(jìn)作用，也有毒性作用，取決于碳納米管與植物細(xì)胞的作用機(jī)制。如賽鬧等[20]研究了多壁碳納米管對(duì)水稻幼苗的生理學(xué)效應(yīng)，研究顯示，不同外管徑的多壁碳納米管處理后的水稻經(jīng)過(guò)10 d后，管徑小于8 nm的多壁碳納米管處理后的水稻，與對(duì)照組相比，根系可溶性蛋白和可溶性根系含糖量有所降低；而管徑大于20 nm的多壁碳納米管，兩者均表現(xiàn)出明顯升高，尤其是管徑大于50 nm的碳納米管處理后的水稻，長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于前兩者，且根系的抗氧化酶活性明顯提高，而外徑小于8 nm 的碳納米管處理后的水稻根莖，在10 d后的相比于其他兩組的氧產(chǎn)生率最高。隨著碳納米管外徑的增加，處理后的水稻幼苗葉綠素含量也逐漸增加。進(jìn)一步研究多壁碳納米管在對(duì)緩解1,2,4-三氯苯(TCB)對(duì)水稻幼苗的生理學(xué)脅迫過(guò)程中的作用發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管與TCB的協(xié)同作用可以緩解水稻幼苗的失綠與萎蔫，而對(duì)其他因素?zé)o法起到顯著的改善作用。由此可見(jiàn)，碳納米管作用于水稻幼苗，可以促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)，并增加水稻幼苗的成活率。

我國(guó)土壤重金屬污染形勢(shì)嚴(yán)峻，其中鎘點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)到7%[21]，導(dǎo)致大面積水稻種植土壤出現(xiàn)“缺磷”現(xiàn)象，并影響稻米的質(zhì)量安全。楊思楠等[22]利用碳納米管較強(qiáng)的吸附能力，分析了單一多壁碳納米管及其與鎘離子復(fù)合處理后的水稻生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)20 d后，與對(duì)照組相比，單一碳納米管處理過(guò)的水稻幼苗根系活力隨碳納米管濃度的升高呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，最大下降率為69.6%。同樣，與鎘離子復(fù)合的碳納米管濃度越高，水稻幼苗活力下降程度越大，且比單一處理組下降率最大高出24.4%，可見(jiàn)復(fù)合處理組對(duì)水稻幼苗的損傷度更高。而且，與鎘離子復(fù)合的碳納米管對(duì)水稻幼苗葉綠素的降低程度也明顯高于單一碳納米管的作用。同時(shí)，與對(duì)照組相比，單一處理組和復(fù)合處理組對(duì)水稻幼苗的過(guò)氧化酶活性及光合作用能力的影響均具有不同程度增加，其中復(fù)合處理組使過(guò)氧化酶活性提高幅度最大，對(duì)光合作用能力的影響也最為明顯，表明與鎘離子復(fù)合的碳納米管對(duì)幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生的負(fù)面影響最高。

與本征多壁碳納米管相比，羧基化多壁碳納米管具有更好的分散性和親水性。但其對(duì)重金屬離子的吸附性更強(qiáng)，會(huì)促進(jìn)重金屬離子滲入到植物細(xì)胞，從而影響植物生長(zhǎng)。劉玲等[23]對(duì)羧基化多壁碳納米管及其與鎘離子復(fù)合后對(duì)水稻幼苗葉片的毒性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，相同質(zhì)量濃度下，羧基化多壁碳納米管與鎘離子復(fù)合物對(duì)水稻幼苗處理后，其葉片的葉綠素含量和抗氧化酶均低于單一處理組，而MDA 和陽(yáng)離子產(chǎn)生率均高于單一對(duì)照組。表明羧基化多壁碳納米管與鎘離子復(fù)合會(huì)加劇對(duì)水稻幼苗的損傷，應(yīng)盡量避免。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

已有的研究表明，碳納米管被廣泛應(yīng)用到生產(chǎn)和生活中的同時(shí)，會(huì)給動(dòng)植物甚至人體帶來(lái)不同程度的毒性隱患，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這方面的研究。從目前的研究進(jìn)展可看出該領(lǐng)域還存在諸多空缺需進(jìn)一步加強(qiáng)。首先，碳納米管的毒性與納米管本身的諸多因素有關(guān)，包括物性參數(shù)及合成過(guò)程等，而大多數(shù)研究對(duì)相關(guān)細(xì)節(jié)的描述不夠全面和具體，對(duì)碳納米管的毒性機(jī)理研究方面的工作還很欠缺，這與作用過(guò)程復(fù)雜且表征困難有關(guān)，需要進(jìn)一步完善各方面的表征測(cè)試，有助于更好地分析其作用機(jī)理；其次，研究對(duì)象只局限于有代表性的動(dòng)物或植物實(shí)驗(yàn)體，應(yīng)該開(kāi)展更廣泛的研究，豐富研究種類和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使碳納米管的毒性效應(yīng)得到更多人的重視；最后，研究?jī)?nèi)容的系統(tǒng)性欠缺。如單壁碳納米管存在于人體肝細(xì)胞時(shí)，會(huì)抑制代謝酶GSTP1的表達(dá)，使排毒功能減弱；而多壁碳納米管則相反，可以起到增強(qiáng)肝細(xì)胞的排毒功能的效果。因此，單一地研究碳納米管的正面作用或者負(fù)面作用，而沒(méi)有將兩者有機(jī)結(jié)合起來(lái)，使碳納米管在很好地發(fā)揮正面作用的同時(shí)，也能有效緩解或適當(dāng)控制其產(chǎn)生的負(fù)面影響，從而促進(jìn)碳納米管更好地應(yīng)用到生產(chǎn)和生活中。總之，關(guān)于碳納米管的毒性研究還需要更多技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐，才能使該研究更加系統(tǒng)化和科學(xué)化。