神經(jīng)絲輕鏈蛋白在多發(fā)性硬化中的研究進(jìn)展

王佳琪 侯苗苗 劉曉蕾 李新毅

1）山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院（山西白求恩醫(yī)院 山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 同濟(jì)山西醫(yī)院），山西 太原030032 2）山西醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030000

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由免疫介導(dǎo)的累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性神經(jīng)退行性疾病，患病率逐年增加，與2013年相比，2020年患病人數(shù)增加了30%［1］。MS 主要以進(jìn)行性神經(jīng)元軸索損傷、脫髓鞘改變、臨床表現(xiàn)多樣性以及病灶的時(shí)間空間多發(fā)性為典型特征，其確切病因尚未明確，遺傳、其他自身免疫性疾?。?型糖尿病、甲狀腺疾病、腸道炎癥等）、傳染病（愛潑斯坦-巴爾病毒）、維生素D缺乏、肥胖等均有可能導(dǎo)致該?。?］。大多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)等位基因與免疫途徑基因相關(guān)，為免疫系統(tǒng)對(duì)MS的發(fā)展至關(guān)重要的假設(shè)提供了支持［3］。MS免疫病理的最終環(huán)節(jié)為促炎免疫細(xì)胞和缺陷的調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞之間的不平衡，最終破壞血-腦屏障，造成不可逆的髓鞘細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的原位損傷［3］。臨床病程以復(fù)發(fā)緩解 型 MS（relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS）最為常見，絕大多數(shù)最終會(huì)進(jìn)展為繼發(fā)進(jìn)展型 MS（secondary progressive multiple sclerosis，SPMS），這種反復(fù)的不可逆的腦組織損傷造成的進(jìn)行性殘疾累積給患者及家庭帶來極大的身心負(fù)擔(dān)。然而，目前針對(duì)該病的診斷、分型以及療效監(jiān)測(cè)主要依據(jù)臨床參數(shù)及放射學(xué)參數(shù)，仍缺乏常規(guī)診斷、疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后隨訪的指標(biāo)。神經(jīng)絲輕鏈蛋白（neurofil?ament light chain protein，NFL）是神經(jīng)絲蛋白家族中可溶性最高和最豐富的亞基，是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白中最重要的組成成分，由于其對(duì)軸突損傷的敏感性和在腦脊液和血液中測(cè)量的可靠性，在MS的研究中受到廣泛關(guān)注。

1 神經(jīng)絲輕鏈蛋白

1.1 概述神經(jīng)絲是中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和軸突細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組成部分，根據(jù)神經(jīng)元類型和發(fā)育階段，由5種亞基以不同的組合和濃度共同組裝成神經(jīng)絲異質(zhì)聚合物［6］，可分為神經(jīng)絲輕鏈、中鏈和重鏈［輕鏈（NFL，61.5 kDa，543 個(gè)氨基酸）、中鏈（NFM，102.5 kDa，916 個(gè)氨基酸）和重鏈（NFH，111.9 kDa、1 020個(gè)氨基酸）］神經(jīng)絲以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的α-內(nèi)聯(lián)素和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的外周蛋白［5］。所有亞基包括1個(gè)N末端頭部結(jié)構(gòu)域、1個(gè)高度保守的中央桿結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)長(zhǎng)度可變的尾部結(jié)構(gòu)域。除此分子結(jié)構(gòu)外，它們還經(jīng)歷翻譯后修飾，包括磷酸化、O-連接糖基化、硝化和泛素化［7］。其在大口徑的有髓軸突中高度表達(dá)，負(fù)責(zé)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，具有較高的傳導(dǎo)速度，并且促進(jìn)軸突徑向生長(zhǎng)［4］。與細(xì)胞骨架蛋白（如肌動(dòng)蛋白）相比，神經(jīng)絲在神經(jīng)-軸突隔室中具有特異性和豐富性［8］。其中NFL是神經(jīng)元和軸突中最豐富的中間絲，在軸突細(xì)胞骨架的組裝和維持中起著重要作用［5］。最新的一項(xiàng)對(duì)死亡供者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)17 個(gè)解剖區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)蛋白的濃度研究測(cè)定發(fā)現(xiàn)，顳葉和枕葉腦白質(zhì)中的NFL濃度［27（15～50）至30（17～54）μg/kg］高于大腦皮質(zhì)［12（8.6～17）至14（10～18）μg/kg］或額葉和頂葉腦白物質(zhì)［10（5.4～19）和17（9.9～30）μg/kg］，表明大腦白質(zhì)中存在前后梯度，濃度增加的幅度更大，在海馬、內(nèi)囊、丘腦、中腦、腦橋、頸脊髓等部位也可見高濃度的NFL［9］。神經(jīng)絲的生理降解被認(rèn)為是泛素介導(dǎo)的蛋白酶體和凋亡通路的結(jié)合［10］。在正常機(jī)體的腦脊液和血清中也可發(fā)現(xiàn)低水平NFL，以年齡依賴的方式從軸突中持續(xù)緩慢釋放，其可能與衰老相關(guān)［12］。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞或其軸突膜受損時(shí)，NFL 被釋放到間質(zhì)液（interstitial fluid，IF）、腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和血液中［11］，細(xì)胞外檢測(cè)NFL可用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展、治療反應(yīng)或藥物毒性。一旦進(jìn)入外周血，這些高度免疫原性蛋白就會(huì)誘導(dǎo)特異性體液反應(yīng)產(chǎn)生抗神經(jīng)絲抗體，其水平隨神經(jīng)疾病進(jìn)展而變化，目前其致病性和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的潛在價(jià)值均不清楚，本文不過多贅述。

1.2 定量分析在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的管理中，軸突損傷的識(shí)別和量化一定程度上可以提高診斷的準(zhǔn)確性和預(yù)后評(píng)估。隨著各種免疫分析技術(shù)的更新迭代，NFL定量分析技術(shù)的靈敏度也顯著提高。截止目前共開發(fā)出4 種方法，第一代免疫印跡法，第二代酶聯(lián)免疫吸附法［14］，第三代電化學(xué)發(fā)光法（ECL）［15］，第四代單分子陣列法Simoa（single-molecule array）基于珠粒技術(shù)，比ECL 敏感25 倍，比ELISA 方法敏感126倍［14］，尤其適用于外周超敏蛋白的檢測(cè)，可以檢測(cè)到正常老化期間或輕度損傷后NFL 濃度的微小變化［16-17］。Simoa 測(cè)量的腦脊液和外周血NFL 水平與臨床和影像學(xué)結(jié)果有良好的相關(guān)性［18］，進(jìn)一步支持NFL 作為MS 生物標(biāo)志物的可靠性。其他幾種檢測(cè)平臺(tái)現(xiàn)在也顯示出接近等效的動(dòng)態(tài)范圍和可檢測(cè)水平。西門子正在開發(fā)一種使用Quanterix NFL抗體的bNFL免疫分析方法，旨在獲得與Simoa bNFL水平的良好相關(guān)性，以提供一個(gè)常規(guī)NFL 測(cè)試平臺(tái)，加快NFL 測(cè)試的全球可用性［19］。LEE 等［20］通過研究驗(yàn)證ADVIA 34 Centaur?XP 免疫分析系統(tǒng)上新型血清神經(jīng)絲光（sNFL）分析的性能。這些檢測(cè)方法及平臺(tái)技術(shù)的差異凸顯了檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化的必要性，以及多位點(diǎn)驗(yàn)證在重復(fù)性和創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)化方案方面的作用。

2 NFL與MS診斷

由于臨床癥狀的短暫性和多樣性、個(gè)體間病程的變異性以及與個(gè)體變異相關(guān)的主觀性，使MS的診斷面臨極大挑戰(zhàn)。MS 的傳統(tǒng)診斷和進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)主要基于臨床表現(xiàn)與磁共振圖像（MRI）、腦脊液分析和視覺誘發(fā)電位，一定程度上增加了誤診風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)新興的MS診斷生物標(biāo)志物，包括近期出現(xiàn)的各種中央靜脈標(biāo)志物、順磁邊緣損傷和流體生物標(biāo)志物，盡管神經(jīng)影像在MS識(shí)別中有獨(dú)特的成像結(jié)果，但在疾病早期階段難以量化，流體生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證更有可能顯著提高診斷的可靠性。BJORNEVIK等［21］通過嵌套病例對(duì)照研究，評(píng)估血清NFL 水平與MS發(fā)病之間的相關(guān)性，結(jié)果表明在臨床癥狀發(fā)生前個(gè)體中血清NFL 水平的增加與未來發(fā)展MS 的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，MS 可能存在前驅(qū)期，逐漸發(fā)生軸突損傷。臨床發(fā)病時(shí)間也與sNFL水平相關(guān)，最早可追溯到在臨床MS 開始6 a 前［21］，因此早發(fā)現(xiàn)可以早期開展治療避免加重殘疾。一項(xiàng)薈萃分析比較MS 患者和對(duì)照組腦脊液NFL 的研究［22］發(fā)現(xiàn)MS 人群中NFL濃度與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，在另外研究中MS 患者的NFL 水平有很大差異［23］。這些差異可能與測(cè)量方法及人群基線信息差異相關(guān)。由于NFL可以在各種生理和病理?xiàng)l件下釋放，在MS相關(guān)組織損傷中并不是特異性的，使其在診斷與鑒別診斷方面特異性不高。大量縱向研究表明，在MS、創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中以及神經(jīng)退行性慢性疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotropyic lateral sclerosis，ALS）、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等患者也存在高NFL 水平［24-25］。最佳臨界值對(duì)于將NFL 用作替代生物標(biāo)志物并允許及時(shí)醫(yī)療干預(yù)至關(guān)重要，但目前尚未建立標(biāo)準(zhǔn)化臨界值和最佳采樣頻率［26］，另外年齡、性別、體重指數(shù)、共病和樣本量等混雜因素需要額外研究，以避免誤導(dǎo)NFL 數(shù)據(jù)［27-28］。因此，獨(dú)立的腦脊液NFL和血清NFL似乎都不適用于MS的診斷，仍需要進(jìn)一步探索。

3 NFL在MS進(jìn)展惡化與復(fù)發(fā)中的作用

視神經(jīng)炎（optic neuritis，ON）、臨床孤立綜合征（clinically isolated syndromes，CIS）或放射孤立綜合征（clinically isolated syndrome，CIS）患者均有發(fā)生MS的風(fēng)險(xiǎn)，早期預(yù)測(cè)這些疾病惡化形成MS以及MS惡化發(fā)展為RRMA、SPMS，早期積極展開防控十分必要。研究發(fā)現(xiàn)NFL 水平在預(yù)測(cè)上述疾病轉(zhuǎn)化為MS中具有明顯相關(guān)性［29-33］。一項(xiàng)研究回顧性分析MS患者診斷時(shí)腦脊液中NFL 濃度以及5 a 和14 a 的疾病嚴(yán)重程度，根據(jù)雙變量和多變量邏輯回歸分析估計(jì)，高水平的NFL與MS 嚴(yán)重性風(fēng)險(xiǎn)增加3 倍相關(guān)，尤其是在最近復(fù)發(fā)的RRMS 患者中。此外，在14 a 的隨訪中，約60%的腦脊液NFL 水平高（>386 μg/L）的患者從RRMS 發(fā)展為SPMS，而30%的患者為中等或低水平（<386 μg/L）［33］，表明在疾病早期腦脊液NFL水平可能預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展，可能提示轉(zhuǎn)化為進(jìn)展性疾病。研究發(fā)現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)或有放射活動(dòng)的MS 患者血清NFL水平高于緩解期或無新MRI病變的患者［34］。盡管NFL 水平似乎是未來疾病活動(dòng)的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)，但其單獨(dú)測(cè)量疾病活動(dòng)和評(píng)估預(yù)后的能力仍需進(jìn)一步明確。

4 NFL與影像學(xué)在MS應(yīng)用中的相關(guān)性

2019 年國(guó)際進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥聯(lián)盟（Interna?tional Progressive Multiple Sclerosis Alliance）專家組通過對(duì)復(fù)發(fā)性和進(jìn)行性MS 的數(shù)據(jù)分析，認(rèn)為血清NFL 濃度與影像學(xué)和失能測(cè)量相關(guān)，可以預(yù)測(cè)疾病的未來病程，并可以預(yù)測(cè)治療的反應(yīng)［35］。鐵緣/順磁損傷（iron rim/paramagnetic lesions，IRPL）研究提出白質(zhì)損傷周圍的環(huán)形順磁鐵邊界是有前景的高度特異性MS 影像生物標(biāo)志物，反映了MS 患者急性進(jìn)展期和慢性期以及復(fù)發(fā)和進(jìn)展性疾病患者的慢性炎癥脫髓鞘［36-37］，并可能與無急性炎癥臨床或影像學(xué)征象患者的神經(jīng)軸索損傷和殘疾有關(guān)。研究表明大多數(shù)IRPL 患者（72%）的血清NFL 水平高于第80 百分位（病理閾值），提示與血清NFL 相關(guān)［45］。血清NFL 的增加表明，即使是在慢性活動(dòng)性/潛伏性病變邊緣，也可以在血清中檢測(cè)到少量的持續(xù)軸突損傷，其程度遠(yuǎn)小于活動(dòng)性病變。影像學(xué)研究顯示了與NFL水平更一致的相關(guān)性，一些研究報(bào)告了患病后和患病前NFL 的預(yù)測(cè)值［34，41］。因此，NFL 和MRI 指數(shù)聯(lián)合在MS中有巨大的前景。

5 NFL與MS的預(yù)后

軸突退變?cè)诩膊∵^程中積累，是MS 患者持續(xù)神經(jīng)功能障礙的主要原因。軸突退變的評(píng)估主要基于MRI 發(fā)現(xiàn)，特別是腦容量測(cè)量，缺乏可重復(fù)性［38-39］。測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白（如NFL）似乎是評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷程度的一種綜合方法。MANOUCHEHRINIA 等［40］評(píng)估血漿NFL 水平與MS疾病進(jìn)展之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)年齡分層的血漿NFL水平高于第99、95 和80 百分位，與擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（expanded disability status scale，EDSS）的嚴(yán)重程度相關(guān)，認(rèn)為高血漿NFL 可作為臨床預(yù)后生物標(biāo)志物，預(yù)測(cè)MS早期發(fā)生永久殘疾的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)有研究認(rèn)為sNFL水平的降低與12和24個(gè)月后EDSS評(píng)分、神經(jīng)心理結(jié)局和腦容量變化的改善相關(guān)［34］。短期內(nèi)NFL水平預(yù)測(cè)未來復(fù)發(fā)、新的T2或釓增強(qiáng)病變、最終腦和脊髓萎縮的風(fēng)險(xiǎn)，以及其對(duì)短期EDSS評(píng)分惡化的預(yù)測(cè)價(jià)值被接受。但NFL相對(duì)MRI來說是否是一個(gè)更好預(yù)測(cè)神經(jīng)退行性變的指標(biāo)尚不能確定，因目前沒有研究將NFL的性能與臨床和MRI參數(shù)進(jìn)行比較。

6 NFL與MS療效監(jiān)測(cè)

由于MS會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，大多數(shù)患者需要疾病修飾治療（disease-modifying therapy，DMT）。制定最佳治療方案需要在對(duì)治療效果和風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行平衡，這種平衡可能隨著疾病活動(dòng)、治療作用、風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境（包括COVID）以及生命的不同階段而改變。MRI 是唯一公認(rèn)亞臨床疾病活動(dòng)的主要指標(biāo)，但對(duì)患者短時(shí)間內(nèi)的變化不敏感。有研究回顧常規(guī)和新興MRI以及實(shí)驗(yàn)室測(cè)量監(jiān)測(cè)DMT的療效和風(fēng)險(xiǎn)發(fā)現(xiàn)，與臨床測(cè)量相比，MRI和血清NFL水平與那他珠單抗治療（與安慰劑相比）密切相關(guān)［44］。臨床試驗(yàn)和人群隊(duì)列顯示有效的MS 治療后NFL 水平降低。一項(xiàng)來自瑞典MS 隊(duì)列的研究發(fā)現(xiàn)治療前和治療時(shí)樣本之間的血漿NFL 水平有顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同藥物在DMT 中血漿NFL 濃度的降低不同，阿侖珠單抗（ALM）的降低最大，特立氟米特（TFL）的降低最小［42］。一項(xiàng)針對(duì)CIS/RRMS 的德國(guó)隊(duì)列研究表明，接受更高療效DMT 治療的患者更有可能具有更高的基線sNFL 和更大的sNFL 降低，在那些需要升級(jí)策略的患者中，sNFL水平下降到sNFL上升水平以下［43-46］。這些證據(jù)表明NFL 是MS 療效具有潛在的監(jiān)測(cè)價(jià)值，特別是對(duì)于高效藥物，可能由于這些藥物更好地預(yù)防了腦損傷，強(qiáng)調(diào)NFL 作為神經(jīng)元和軸突損傷標(biāo)志物的作用。就證據(jù)而言，追蹤NFL 水平對(duì)DMT的響應(yīng)具有潛在的監(jiān)測(cè)價(jià)值。

7 展望

迄今為止，關(guān)于MS的液相生物學(xué)標(biāo)志物研究越來越多，NFL 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）軸突損傷的生物對(duì)應(yīng)物，研究顯示出其對(duì)疾病活動(dòng)和短期損傷負(fù)荷的臨床和亞臨床變化的敏感性，表明NFL 水平在MS 中的潛在適用性，因此NFL 是否可以作為一項(xiàng)MS 的常規(guī)檢查進(jìn)入臨床診療，仍需要在未來不同人群的大規(guī)模縱向隊(duì)列研究來明確，以及更加標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方式及檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)和臨界值，為MS的臨床定制化醫(yī)療實(shí)踐提供幫助。