蘋果酸—乳酸發(fā)酵對(duì)刺梨酒香氣的影響

郭志君 楊 磊 駱紅霞 周模美 房玉林

(1. 茅臺(tái)學(xué)院，貴州 仁懷 564500；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712100)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)為薔薇科多年生落葉灌木植物，具有防風(fēng)固沙生態(tài)保護(hù)作用，同時(shí)含有較高的抗壞血酸、酚類等生物活性成分[1]，已成為貴州省鄉(xiāng)村振興特色產(chǎn)業(yè)之一，截至2020年，貴州省刺梨鮮果產(chǎn)量超10萬(wàn)t[2]。刺梨加工產(chǎn)品種類豐富，尤其刺梨酒一直是研發(fā)熱點(diǎn)[3]，但由于刺梨果實(shí)含酸量高，發(fā)酵酒口感酸澀粗糙、風(fēng)味欠佳。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在改善刺梨發(fā)酵酒風(fēng)味方面進(jìn)行了相關(guān)研究[4-6]，主要基于不同澄清材料選擇、酵母菌種篩選、發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化、水果復(fù)配等方法平衡口感。

蘋果酸—乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation，MLF)是一種有效的生物降酸方法，在乳酸菌的作用下將高酸感的蘋果酸轉(zhuǎn)化為低酸感的乳酸，增加酒體的圓潤(rùn)度，同時(shí)產(chǎn)生其他香氣風(fēng)味物質(zhì)[7]，被廣泛用于葡萄酒發(fā)酵過程以及酸度較高果汁的降酸處理[8]，MLF對(duì)野生獼猴桃[9]、藍(lán)莓[10]、櫻桃[11]、桑葚[12]等果酒品質(zhì)的影響已有報(bào)道，目前尚未有對(duì)刺梨酒進(jìn)行MLF的相關(guān)報(bào)道。

有機(jī)酸種類含量、揮發(fā)性成分共同影響刺梨酒的口感風(fēng)格和典型性，研究擬選用貴州省畢節(jié)刺梨順序進(jìn)行酒精發(fā)酵(AF)和MLF，以單一酒精發(fā)酵為對(duì)照，采用離子色譜法和頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V質(zhì)譜法(HS-SPME/GC-MS)對(duì)刺梨酒中的有機(jī)酸和揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析，結(jié)合香氣活度值(OAV)和感官分析，探究MLF對(duì)刺梨酒的降酸效果、揮發(fā)性成分和口感的影響，以期達(dá)到降酸和改善刺梨酒風(fēng)味的目的，為刺梨酒開發(fā)應(yīng)用提供一定理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮貴州省畢節(jié)刺梨、蔗糖：市售；

偏重亞硫酸鉀：意大利DAL CIN公司；

澄清果膠酶RCL：德國(guó)AB Enzymes公司；

釀酒酵母ST：法國(guó)Laffort公司；

酒類酒球菌(Oenococcus oeni)Viniflora CH35：丹麥Chr.hansen公司；

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)、4-辛醇：北京索萊寶科技有限公司；

乙醇、碳酸氫鈉、2,6-二氯靛酚、偏磷酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離子色譜儀：Dionex ICS-1500型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

陰離子分離柱(4 mm×250 mm)：IonPACAS11-HC型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

保護(hù)柱(4 mm×50 mm)：IonPAC?AG11-HC型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7980A-5977B型，美國(guó)Agilent公司；

多功能樣品前處理平臺(tái)：MPS XT型，德國(guó)Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨酒發(fā)酵工藝

原料挑選→破碎壓榨→刺梨汁澄清→成分調(diào)整→酒精發(fā)酵→MLF→終止發(fā)酵→酒樣

操作要點(diǎn)：挑選成熟的無(wú)霉變鮮刺梨果進(jìn)行清洗、壓榨取汁，過程中分次加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀，30 min后加入果膠酶室溫放置3 h，6 ℃低溫澄清24 h取清汁并用蔗糖調(diào)整其總糖度為150 g/L，回溫后接種已活化的酵母200 mg/L進(jìn)行酒精發(fā)酵，控溫18～20 ℃，總糖小于4 g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束，1/2酒樣添加偏重亞硫酸鉀120 mg/L，4 ℃保存(對(duì)照酒樣)；其余酒樣添加酒類酒球菌1 g/L繼續(xù)進(jìn)行MLF，控溫18～20 ℃，發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加偏重亞硫酸鉀120 mg/L，4 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 刺梨酒有機(jī)酸含量測(cè)定 草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸采用離子色譜法，參考SN/T 4675.5—2016《出口葡萄酒中有機(jī)酸的測(cè)定 離子色譜法》稍做修改，配制7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L，蘋果酸、酒石酸、草酸的質(zhì)量濃度分別為2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 mg/L，酒樣稀釋后經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾待測(cè)。柱溫箱溫度35 ℃，柱溫30 ℃，KOH淋洗液，多級(jí)梯度淋洗，淋洗液流速0.8 mL/min，抑制電流150 mA，進(jìn)樣量25 μL。保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

抗壞血酸采用2,6-二氯靛酚滴定法，按GB 5009.86—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測(cè)定》執(zhí)行。

1.3.3 刺梨酒中揮發(fā)性成分測(cè)定 參考郭志君等[13]的方法。

1.3.4 香氣活度值(OAV)計(jì)算 采用揮發(fā)性物質(zhì)的含量與其閾值之比。閾值受溶劑及分析方法影響較大，目前并沒有刺梨酒中香氣閾值的文獻(xiàn)報(bào)道，參考與刺梨酒酒精度相近溶液中的閾值[14]，首選低醇(9%～14%)酸性水溶液、其次為葡萄酒和水。一般認(rèn)為，OAV≥1.0的化合物單獨(dú)對(duì)酒的香氣有貢獻(xiàn)，0.1≤OAV<1.0對(duì)香氣有重要修飾作用[15]。

1.3.5 感官評(píng)價(jià) 采用QDA法[16]，由10位專業(yè)感官品評(píng)員(5名男性和5名女性)對(duì)刺梨酒MLF前后的樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，獲得評(píng)價(jià)的主要感官描述詞，并對(duì)樣本進(jìn)行5點(diǎn)標(biāo)度法打分，取平均分值作感官評(píng)定雷達(dá)圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 21.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLF對(duì)刺梨酒有機(jī)酸含量的影響

采用離子色譜法對(duì)刺梨酒中有機(jī)酸進(jìn)行定性定量分析，測(cè)得刺梨酒中主要8種有機(jī)酸，分別為草酸、酒石酸、抗壞血酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，雖然抗壞血酸不含自由羥基屬于己糖內(nèi)酯化合物，但因其分子可游離出H+具有有機(jī)酸的性質(zhì)，因此歸為一類分析。由表1可知，經(jīng)MLF刺梨酒總有機(jī)酸含量降低了1.40 g/L；蘋果酸含量由6.21 g/L降至0.88 g/L，顯著降低85.83%；而乳酸含量由0.55 g/L增至4.49 g/L，顯著升高87.75%，變化趨勢(shì)與葡萄酒中的研究結(jié)果近似[17]。具有生青味、酸澀的蘋果酸經(jīng)MLF脫縮轉(zhuǎn)化為柔和、有乳香味的乳酸，有利于改善刺梨酒酸澀生青的口感。刺梨酒經(jīng)過MLF乙酸含量升高0.11 g/L，部分乙酸為乳酸菌代謝檸檬酸等物質(zhì)產(chǎn)生，一定程度上有利于形成更多的酯類香氣物質(zhì)，豐富刺梨酒的果香，但含量過高則產(chǎn)生酸敗風(fēng)味。MLF對(duì)其他有機(jī)酸含量無(wú)顯著影響，檢測(cè)到刺梨酒中的抗壞血酸含量?jī)H為0.34 g/L，遠(yuǎn)低于果實(shí)中的含量[18]，但高于彭小東等[19]采用HPLC法測(cè)定的刺梨酒中0.077 g/L的抗壞血酸含量，主要因?yàn)榭箟难峄瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、易被氧化，在果酒釀造過程中極易損失，貯藏條件和檢測(cè)方法對(duì)刺梨酒中抗壞血酸的含量有影響。

表1 MLF對(duì)刺梨酒有機(jī)酸含量的影響?Table 1 Effect of MLF on organic acid of Rosa roxburghii Tratt wine g/L

2.2 MLF對(duì)刺梨酒揮發(fā)性成分的影響

2.2.1 MLF對(duì)揮發(fā)性成分種類和含量的影響 采用HS-SPME/GC-MS技術(shù)檢測(cè)MLF后的刺梨酒(AF-MLF)的揮發(fā)性成分種類和含量，共鑒定出114種揮發(fā)性成分，其中包括酯類48種、醇類26種、酸類13種、醛酮類10種、烷烴類10種、其他化合物7種，結(jié)果見表2。

表2 MLF對(duì)刺梨酒揮發(fā)性成分及香氣活度值的影響?Table 2 Effect of MLF on volatile components and odor activity value of Rosa roxburghii Tratt wine

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

酯類物質(zhì)是刺梨酒中種類最多、含量最高的揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的70%以上。酯類多數(shù)具有水果香和花香[24]，并且閾值較低，是刺梨酒整體香氣的重要組成部分。MLF后共檢出48種酯類，總含量為12 011.60 μg/L，比對(duì)照提高10.81%，主要包括辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸葉醇酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、反式-肉桂酸乙酯等。與對(duì)照相比，僅在MLF后的酒樣中檢測(cè)到的酯類有11種，包括乙酸葉醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸異戊酯、乳酸異戊酯等，主要表現(xiàn)出甜香、奶油香、椰子香等；經(jīng)過MLF刺梨酒中的(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸己酯含量明顯降低，這些物質(zhì)具有植物、青果味，而具有香蕉、菠蘿成熟果香的辛酸乙醇含量則升高14.00%。說明MLF可提高刺梨酒中酯類物質(zhì)的種類和含量，總體向果香和奶油香發(fā)展，與葡萄酒中的研究結(jié)果[25]相似。

醇類物質(zhì)占刺梨酒總揮發(fā)性化合物含量的8%左右，多數(shù)醇類由酵母代謝氨基酸產(chǎn)生，香氣類型較為豐富，低濃度常具有清香、較高濃度易產(chǎn)生刺激性氣味。在MLF后的酒樣中檢測(cè)到26種醇類，總含量為1 409.50 μg/L，比對(duì)照增加218.30 μg/L，但總體占比降低0.29%。具有香料紫羅蘭氣味的紫蘇醇、正辛醇等僅在MLF后的酒樣中檢測(cè)到，而具有植物、青草氣味的反式-3-己烯-1-醇僅在對(duì)照酒樣中檢測(cè)到，但MLF的酒樣中也檢測(cè)到375.60 μg/L具有青草味的葉醇，具有玫瑰花香氣的苯乙醇由440.40 μg/L降至13.70 μg/L，說明MLF改變了刺梨酒中揮發(fā)性醇類物質(zhì)的種類，但整體香氣類型變化不明顯，而總體高級(jí)醇占比下降對(duì)提高刺梨酒安全性有一定益處[26]。

刺梨酒中酸類物質(zhì)含量經(jīng)MLF后由1 040.40 μg/L增至2 490.60 μg/L，13種酸類化合物中十一烷酸、亞油酸、油酸和壬酸僅在MLF后的酒樣中檢測(cè)到，雖然這些高級(jí)飽和脂肪酸多數(shù)具有油脂、酸敗氣味，但因閾值較高，對(duì)刺梨酒影響有限。具有奶酪味的辛酸在MLF后由431.20 μg/L增加至1 658.60 μg/L，豐富了刺梨酒的奶酪氣息。

刺梨酒MLF后烷烴類化合物種類由13種減少到10種，但含量提高了171.70 μg/L，特別是具有花香、甜香的苯乙烯和4-甲氧基苯乙烯增加了198.70 μg/L；醛酮類和其他物質(zhì)含量占揮發(fā)性成分的2%左右，刺梨酒MLF前后總含量變化不大，但具有清新植物氣味的庚醛在MLF后未檢測(cè)到，出現(xiàn)具有香料氣味的4-烯丙基苯甲醚、二氫沉香呋喃和2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚。

2.2.2 MLF對(duì)OAV的影響 一般認(rèn)為揮發(fā)性化合物含量大于其氣味閾值，即OAV≥1，化合物產(chǎn)生的香氣才可在氣味中獨(dú)立識(shí)別。由表2可知，MLF后刺梨酒的主要呈香物質(zhì)(OAV≥1)共有13種，其中辛酸乙酯(OAV=928.18)是刺梨酒最主要的香氣物質(zhì)，其他貢獻(xiàn)度大小依次為己酸乙酯(65.20)>乙酸異戊酯(34.48)>9-癸烯酸乙酯(23.25)>乙酸葉醇酯(13.68)>癸醛(7.88)>癸酸乙酯(4.50)>苯乙烯(2.41)>十一烷酸(2.35)>反式-肉桂酸乙酯(2.09)>乙酸苯乙酯(1.67)>癸酸甲酯(1.58)>4-辛酮(1.40)，其中具有青蘋果、黃瓜香氣的乙酸葉醇酯和奶酪香氣的十一烷酸僅在MLF后的酒樣中檢測(cè)到，具有植物、泥土氣味的庚醛(4.14)和反式-3-己烯-1-醇(2.28)則只在對(duì)照酒樣中檢測(cè)到，說明MLF提高了刺梨酒果香花香，特別是奶油乳酪香氣，同時(shí)減少了生青氣息，但依然保留了刺梨酒獨(dú)特的清新果味。對(duì)刺梨酒香氣具有重要修飾作用(0.1≤OAV<1.0)的物質(zhì)檢測(cè)到10種，其中辛酸和葉醇僅在MLF的酒樣中檢測(cè)到，對(duì)刺梨酒香氣的影響與主要呈香物質(zhì)基本一致。

2.3 MLF對(duì)刺梨酒感官評(píng)價(jià)的影響

采用QDA法對(duì)MLF前后的刺梨酒進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，刺梨酒MLF前后的共同主要味感描述為果香、花香、植物香、乳香、酸味、苦澀味。對(duì)照酒樣以果香、花香、植物香、酸味、苦澀味為主；MLF后的刺梨酒以果香、花香、乳香、酸味為主。相較于僅進(jìn)行酒精發(fā)酵的刺梨酒，MLF后刺梨酒花香、植物香減弱、果香乳香增加、酸味減弱、苦澀味稍減弱，口感平衡度提升，風(fēng)味輪廓發(fā)生變化，經(jīng)過MLF的酒樣的整體評(píng)分高于對(duì)照組。

圖1 MLF對(duì)刺梨酒感官評(píng)定雷達(dá)圖Figure 1 Radar chart of sensory evaluation of Rosa roxburghii Tratt wine by malolactic fermentation

3 結(jié)論

研究采用離子色譜法測(cè)定出刺梨酒中有8種有機(jī)酸，蘋果酸—乳酸發(fā)酵使刺梨酒中蘋果酸含量顯著降低85.83%、乳酸含量顯著升高87.75%、乙酸含量增加0.11 g/L，對(duì)草酸、酒石酸、檸檬酸和琥珀酸含量無(wú)顯著影響；采用HS-SPME/GC-MS鑒定出蘋果酸—乳酸發(fā)酵后的刺梨酒中有114種、16 903.10 μg/L揮發(fā)性成分，其中酯類、醇類和酸類共占94.13%，為主要揮發(fā)性成分，蘋果酸—乳酸發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的種類和總含量均高于對(duì)照酒樣，僅在蘋果酸—乳酸發(fā)酵的酒樣中檢測(cè)到的成分主要有乙酸葉醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸異戊酯、乳酸異戊酯、紫蘇醇、正辛醇、十一烷酸、亞油酸、油酸、壬酸、4-烯丙基苯甲醚、二氫沉香呋喃等；經(jīng)香氣活度值法分析辛酸乙酯是蘋果酸—乳酸發(fā)酵后刺梨酒的最主要呈香物質(zhì)，乙酸葉醇酯和十一烷酸賦予刺梨酒奶油乳酪香氣；感官分析表明，蘋果酸—乳酸發(fā)酵增加了刺梨酒的果香和乳香，降低植物氣息、酸味和苦澀感。綜上所述，蘋果酸—乳酸發(fā)酵可通過降低刺梨酒蘋果酸含量、增加乳酸含量和具有果香、乳香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)含量和種類，改善刺梨酒風(fēng)味、有效降低酸味、提高總體質(zhì)量。關(guān)于刺梨酒蘋果酸—乳酸發(fā)酵的菌種選擇、接種方式、貯藏后的變化情況還需進(jìn)一步研究。