結(jié)直腸癌組織中PLOD2、ZEB1表達(dá)變化及意義

張倩，段婷婷，任玉寶

1 山東國(guó)欣頤養(yǎng)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院消化科，濟(jì)南 271103；2 濟(jì)南市鋼城區(qū)人民醫(yī)院

結(jié)直腸癌（CRC）是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率中分別居于第五位和第三位，病死率均位列第三，其中我國(guó)的CRC發(fā)病率居于全球第一位［1-2］。新的診療手段的應(yīng)用雖在一定程度上降低了病死率，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期CRC 患者預(yù)后仍不理想［3］。賴氨酸羥化酶2（PLOD2）是一種存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能酶，可通過羥基化膠原蛋白中的賴氨酰殘基，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外膠原交聯(lián)的形成［4］。研究表明，PLOD2 可通過影響細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維變化促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制，其中，轉(zhuǎn)錄因子E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）在該過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［6］。ZEB1 是EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子之一，與多種腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性相關(guān)［7］。為此，我們探討了結(jié)直腸癌患者癌組織PLOD2、ZEB1表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取山東國(guó)欣頤養(yǎng)集團(tuán)萊蕪中心醫(yī)院2013 年1 月—2016 年11 月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本82例份及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距對(duì)應(yīng)腫瘤邊緣≥3 cm 腸黏膜組織）。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均行結(jié)直腸根治手術(shù)及腸系膜淋巴結(jié)清掃術(shù)；術(shù)后病理均證實(shí)為結(jié)直腸腺癌；所有病例臨床資料完整；術(shù)前未進(jìn)行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有遺傳性結(jié)腸癌；合并其他惡性腫瘤；合并精神障礙性疾病或自身免疫系統(tǒng)疾病?；颊吣?2 例、女30 例，年齡36～84（60.11 ±11.06）歲。組織分化程度參考2019 版WHO 病理分冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，高分化21 例，中分化48 例，低分化13 例。根據(jù)第8 版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)：浸潤(rùn)深度T1+T2共47 例，T3+T4共35 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23 例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59 例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9 例；Ⅰ～Ⅱ期55 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中PLOD2、ZEB1 表達(dá)檢測(cè) 所有標(biāo)本均用10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，切片（厚度4μm）。然后用二甲苯和分級(jí)乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和再水化。隨后，切片在磷酸鹽（PBS）緩沖鹽水（pH 7.2）中洗滌10 min。隨后室溫下于3%H2O2中封閉10 min，然后加熱至95 °C 30 min以回收抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。在PBS 中洗滌3 次后，將切片在山羊血清中封閉，并與PLOD2、ZEB1 一級(jí)抗體在4°C 過夜。隨后，將載玻片與聚合物增強(qiáng)子（試劑A）、山羊抗鼠抗體（試劑B）一起孵育，并在新制備的3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物中顯色4 min。最后，切片用蘇木精復(fù)染，脫水，風(fēng)干，封片后鏡下觀察。所有染色結(jié)果由2 位高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立判斷。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞無顯色為0 分，細(xì)胞淺黃色為1分，細(xì)胞呈棕黃色為2 分，細(xì)胞呈棕褐色為3分。細(xì)胞染色范圍評(píng)分：隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)約100個(gè)細(xì)胞，無染色為0分，＜25%為1分，≥25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，≥75%為4分。兩者相乘，＜3 分為陰性，≥3 為陽性。PLOD2 染色定于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，ZEB1染色主要定于為細(xì)胞核中。

1.3 預(yù)后隨訪 所有患者自確診起開始隨訪，隨訪時(shí)間為5 年，截止日期為2021 年1 月。隨訪方式為門診復(fù)查或者電話隨訪，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束，期間排除因其他疾病或者意外死亡的病例。詳細(xì)記錄患者的生存情況，計(jì)算5 年總體生存率（OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以［例（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)（連續(xù)校正公式或Fisher 精確檢驗(yàn)），相關(guān)性分析采用Spearman 分析。單因素分析應(yīng)用Kaplan-Meier 和Log-Rank 檢測(cè)。應(yīng)用Cox 回歸進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 癌及癌旁組織中PLOD2、ZEB1 陽性表達(dá)率比較 PLOD2 在癌旁組織中主要表達(dá)于腸黏膜隱窩內(nèi)，陽性率15.85%（13/82），在CRC 組織中陽性率56.10%（46/82），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ZEB1 在癌旁組織和CRC 組織中的陽性表達(dá)率分別為18.29%（15/82）、46.34%（38/82），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 CRC 組織中PLOD2 和ZEB1 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CRC 組織中PLOD2 表達(dá)與組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期均有關(guān)（P均＜0.05）；ZEB1 表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)（P均＜0.05）。見表1。

表1 PLOD2、ZEB1在CRC組織中表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系（例）

2.3 CRC 組織中PLOD2 與ZEB1 的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PLOD2與ZEB1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.280，P=0.011）。

2.4 PLOD2 與ZEB1 表達(dá)與患者預(yù)后的單因素生存分析 隨訪時(shí)間6～60 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間39.5個(gè)月，死亡25 例，總體5 年OS 69.5%（57/82）。PLOD2 陰性和陽性表達(dá)者5 年OS 分別為86.1%（31/36）、56.5%（26/46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ZEB1 陰性和陽性表達(dá)者5 年OS 分別為84.1%（37/44）、52.6%（20/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 影響CRC 患者預(yù)后多因素分析 多因素分析結(jié)果顯示，PLOD2表達(dá)、患者TNM分期是影響患者5年OS的獨(dú)立預(yù)后因子（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響CRC患者預(yù)后的Cox多因素分析

3 討論

CRC 是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來由于飲食習(xí)慣改變，膳食纖維攝入減少，發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)，并且趨于年輕化。由于腫瘤早期癥狀不明顯，肛腸鏡篩查率低等原因，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已進(jìn)展成中晚期。局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC 患者生存率降低的主要原因。研究表明，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，除了與自身黏附和侵襲能力相關(guān)，腫瘤微環(huán)境可能起重要作用［8］。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，而膠原蛋白是ECM 關(guān)鍵支架，被稱作是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的“高速公路”［9］。

PLOD2 基因位于3q23-q24 染色體上，含有19個(gè)外顯子，亦稱LH2、TLH2或BRKS2，是一種同細(xì)胞膜結(jié)合的二聚體酶，主要通過對(duì)前膠原末端肽區(qū)中的賴氨酸殘基進(jìn)行羥基化，使膠原纖維轉(zhuǎn)化為更高水平的羥賴氨酸醛衍生膠原交聯(lián)。研究表明，PLOD2 參與多種病理過程，包括系統(tǒng)性硬化、成骨不全和關(guān)節(jié)攣縮等［10］。在腫瘤ECM 中，未成熟的膠原蛋白被PLOD2 修飾后，發(fā)生沉積，增加了腫瘤細(xì)胞基質(zhì)的硬度，使其不易被降解。因此，PLOD2 異常表達(dá)可引起ECM 重塑，從而導(dǎo)致TME 的改變，繼而參與腫瘤轉(zhuǎn)移［11］。NICASTRI 等［12］發(fā)現(xiàn)，PLOD2是CRC 組織中表達(dá)上調(diào)的糖蛋白。CHERIYAMUNDATH 等［13］發(fā)現(xiàn)，PLOD2 參與促進(jìn)CRC 細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLOD2 在CRC 癌組織中表達(dá)增高，且與腫瘤細(xì)胞分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)。此外，本研究中Kaplan-Meier 單因素分析及Cox 模型多因素分析結(jié)果均顯示，PLOD2表達(dá)與CRC 總體生存期有關(guān)，高表達(dá)PLOD2者生存率降低，PLOD2 是CRC 患者預(yù)后獨(dú)立影響因素，與以往研究相符［4］。PLOD2調(diào)節(jié)CRC進(jìn)展的機(jī)制尚不明確，最新研究發(fā)現(xiàn)，PLOD2 可能通過介導(dǎo)STAT3 信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)己糖激酶（HK2）表達(dá)促進(jìn)CRC 的有氧糖酵解，進(jìn)而調(diào)控CRC轉(zhuǎn)移［14］，同時(shí)PLOD2表達(dá)與腫瘤TNM分期呈正相關(guān)，與我們的研究結(jié)果一致。

EMT 在腫瘤惡性進(jìn)展過程中，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而增加腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。研究表明，CRC 進(jìn)展與EMT 密切相關(guān)［15］。EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 可通過結(jié)合E-cadherin 啟動(dòng)子上的保守E 盒序列，下調(diào)E-cadherin 表達(dá)，導(dǎo)致EMT 激活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲［16］。本研究結(jié)果顯示，CRC 組織中ZEB1 的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期呈正相關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PLOD2 與ZEB1 表達(dá)呈相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，PLOD2 通過參與腫瘤EMT 過程，影響腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力［17］。因此，兩者可能在EMT 過程中存在某種關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)PLOD2 表達(dá)，通過TGF-β/smad 信號(hào)通路和PI3K/AKT 信號(hào)通路，分別誘導(dǎo)宮頸癌和膠質(zhì)瘤EMT 過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［18-19］。而TGFβ/Smad 和PI3K/AKT 信號(hào)通路同樣可以激活ZEB1誘導(dǎo)腫瘤EMT 過程［20］，因此推測(cè)PLOD2 和ZEB1 可能在這兩個(gè)通路中存在某種聯(lián)系。

綜上所述，在CRC 組織中PLOD2、ZEB1 表達(dá)升高，二者表達(dá)與CRC 侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；檢測(cè)二者表達(dá)有助于病情判斷及患者預(yù)后評(píng)估。