痰濕內(nèi)阻慢性失眠大鼠模型建立及半夏秫米湯基于HPA軸、炎癥因子的治療機(jī)制

張艷，楊嫚，劉西建，張喆，李琳，辛丹

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2 山東省委黨校燕山校區(qū)衛(wèi)生所

據(jù)報(bào)道，5%～10%的成年人患有慢性失眠［1］。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快，其患病率呈逐年上升及低齡化趨勢(shì)。慢性失眠不僅嚴(yán)重影響人們的工作和生活，而且與心腦血管疾病、糖尿病、精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2-4］。截至目前，慢性失眠仍缺乏行之有效的治療方法，藥物治療是其主要的治療方法［5］。苯二氮?類、非苯二氮?類、褪黑素受體激動(dòng)劑等是臨床常用藥物，但往往會(huì)產(chǎn)生耐藥、戒斷、心理及軀體依賴、記憶力受損等不良反應(yīng)［6］。始載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的半夏秫米湯，為臨床治療失眠的基礎(chǔ)方，尤宜于痰濕內(nèi)阻慢性失眠。既往研究證實(shí)，該方具有鎮(zhèn)靜催眠作用［7］，但作用機(jī)制并未完全闡明。下丘腦—垂體—腎上腺（HPA）軸失調(diào)是慢性失眠神經(jīng)生物學(xué)因素之一［8］。2018 年10 月—2020 年1 月，我們探討了痰濕內(nèi)阻慢性失眠大鼠模型的建立方法，并基于HPA 軸及炎癥因子變化探討了半夏秫米湯干預(yù)痰濕內(nèi)阻慢性失眠的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量（200 ± 20）g，48 只，購(gòu)自山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（魯）2014007。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h明暗交替，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%。藥物：半夏秫米湯組成：半夏五合（60 g）秫米1 升（120 g）。生半夏購(gòu)于鄭州瑞龍制藥股份有限公司，秫米購(gòu)于山東鶴來(lái)香食品有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室劉紅燕老師鑒定，生半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit. 的干燥塊莖，秫米為禾本科植物高粱Sorghum vulgarePers 的種仁。二藥加6 倍體積冷水浸泡1 h，加熱煮沸后煎煮1 h，減壓低溫40 ℃濃縮，濃縮至濃度為1.5 g/mL生藥水煎液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。試劑及儀器：戊巴比妥鈉購(gòu)于北京普博斯生物科技有限公司；地西泮片購(gòu)于山東信宜制藥有限公司；固態(tài)豬油（自制）。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-10、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、γ 氨基丁酸（GABA）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)酮（CORT）、大鼠促腎上皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）ELISA 試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)：Tanon-5200）購(gòu)于上海天能科技有限公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（型號(hào)：JW-3021HR）購(gòu)于安徽嘉文儀器設(shè)備有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：GNP-908）購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：352 型）；單平臺(tái)水環(huán)境：大鼠箱（型號(hào)：R1，規(guī)格：460 mm×300 mm×160 mm），內(nèi)置1 直徑為80 mm，高90 mm，厚15 mm的平臺(tái)，水面距平臺(tái)約10 mm。

1.2 痰濕內(nèi)阻慢性失眠大鼠模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成6組：空白組、痰濕內(nèi)阻慢性失眠組及半夏秫米湯低、中、高劑量組和地西泮組，每組8 只。除空白組外，其余5 組均給予高脂飼料［9］+豬油3 mL 灌胃/只/天，連續(xù)10 周，并于第8 周采用單平臺(tái)水環(huán)境法，每天自13：00 至次日9：00 剝奪睡眠，連續(xù)21 d，制備痰濕內(nèi)阻慢性失眠大鼠模型。動(dòng)物晝夜節(jié)律消失，對(duì)周?chē)曇?、光刺激敏感，易激惹，興奮性增高，睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；體質(zhì)量增加，呈腹部肥胖狀態(tài)，精神萎靡不振，毛色萎黃黯淡，活動(dòng)度下降，飲食減少，便溏，肛周不潔，舌黯紅，苔白厚膩，符合中醫(yī)“痰濕證”特點(diǎn)，血清甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）較空白組升高，高密度脂蛋白（HDL-C）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則造模成功。造模成功后，各給藥組按照人鼠劑量換算（根據(jù)60 kg 成人臨床劑量，生半夏15 g、秫米30 g，生半夏30 g、秫米60 g，生半夏60 g、秫米120 g，地西泮片5 mg），半夏秫米湯低、中、高劑量組按4.69、9.38、18.75 g/kg灌胃給予半夏秫米湯水煎液，地西泮組按0.75 mg/kg 灌胃給予地西泮水溶液，痰濕內(nèi)阻慢性失眠組及空白組灌胃給予1 mL/100 g 生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。

1.3 動(dòng)物體征及行為學(xué)變化 觀察并記錄動(dòng)物體征，如體質(zhì)量、活動(dòng)、毛色、飲食等變化。

1.4 血脂檢測(cè) 第7 周后，乙醚氣體麻醉，各組大鼠內(nèi)眥取血，常溫離心后取血清，置于-80 ℃冰箱，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TG、TC、LDL-C、HDL-C。

1.5 睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間測(cè)定 第10 周后，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，痰濕內(nèi)阻慢性失眠組大鼠與空白組大鼠按照90 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，記錄睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間。

1.6 血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA 測(cè)定 末次灌胃后禁食24 h，乙醚氣體麻醉，各組大鼠內(nèi)眥取血，常溫離心后取上清，置-80 ℃冰箱，用ELISA 法檢測(cè)血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 測(cè)定 末次灌胃后禁食24 h，取血后，斷頭，冰上迅速剝離大腦，取出下丘腦，置于-80 ℃冰箱，用ELISA 法檢測(cè)下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用-x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用One-way-ANOVA 方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物體征及行為學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)第2 周，與空白組相比，痰濕內(nèi)阻慢性失眠組大鼠大便黏膩，肛周不潔；第5周時(shí)空白組、痰濕內(nèi)阻慢性失眠組大鼠體質(zhì)量分別為（259.26±34.48）、（263.74±29.82）g，第7周時(shí)分別為（257.23±23.15）、（272.90±32.05）g，第5周、第7周痰濕內(nèi)阻慢性失眠組大鼠體質(zhì)量大于空白組，腹部肥胖，精神萎靡不振，毛色萎黃黯淡，活動(dòng)度下降，飲食減少，便溏，舌黯紅，苔白厚膩，符合中醫(yī)“痰濕證”特征。實(shí)驗(yàn)第10周，晝夜節(jié)律消失，對(duì)周?chē)曇?、光刺激敏感，易激惹，興奮性增高，符合失眠特征。

2.2 痰濕內(nèi)阻慢性失眠組與空白組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較 見(jiàn)表1。

表1 痰濕內(nèi)阻慢性失眠組與空白組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，-x±s）

2.3 痰濕內(nèi)阻慢性失眠組與空白組睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間比較 10周后，痰濕內(nèi)阻慢性失眠組與空白組睡眠潛伏期分別為（20.87 ± 3.97）、（11.11 ±3.65）min，睡眠持續(xù)時(shí)間分別為（41.43 ± 10.11）、（65.89±21.61）min。與空白組比較，痰濕內(nèi)阻慢性失眠組睡眠潛伏期延長(zhǎng)，睡眠持續(xù)時(shí)間縮短（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH水平比較（-x±s）

2.5 各組大鼠下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 含量比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠下丘腦IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10含量比較（-x±s）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，痰濕內(nèi)阻是慢性失眠難以治愈的主要原因之一。半夏秫米湯化痰通利、引陽(yáng)入陰安神，有“失眠第一方”之美稱。方中半夏燥濕化痰而安神，秫米能健脾止瀉，化痰安神。

構(gòu)建中醫(yī)證候特點(diǎn)的失眠動(dòng)物模型，是防治失眠的重要環(huán)節(jié)［10］。截至目前，尚未見(jiàn)痰濕內(nèi)阻失眠大鼠模型的報(bào)道。本研究首次采用高脂飼料+單平臺(tái)水環(huán)境法復(fù)制痰濕內(nèi)阻慢性失眠模型，結(jié)果證實(shí)該方法可行。造模后模型大鼠符合中醫(yī)“痰濕證”特點(diǎn)，同時(shí)符合慢性失眠模型標(biāo)準(zhǔn)。

HPA 軸是調(diào)控機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，HPA 軸功能亢進(jìn)是引起慢性失眠的重要因素。HPA 軸的激活和CRH 的分泌增加，使促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）濃度增加，產(chǎn)生覺(jué)醒效應(yīng)［11］。本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠在睡眠剝奪后，處于應(yīng)激狀態(tài)，呈現(xiàn)HPA 軸亢進(jìn)，ACTH、CORT、CRH 分泌增多，給予半夏秫米湯后，ACTH、CORT、CRH 降低，表明半夏秫米湯對(duì)興奮的HPA 軸有抑制作用，從而調(diào)節(jié)睡眠，尤以半夏秫米湯高劑量組效果最好。

炎癥因子不僅調(diào)節(jié)免疫，而且調(diào)節(jié)睡眠，是近幾年失眠研究的熱點(diǎn)之一。一般認(rèn)為，TNF-α和IL-1β是促眠因子［12］。IL-4、IL-10 可抑制睡眠［13］。而且TNF-α 和IL-1 還可以激活HPA 軸［14］。本研究中，模型大鼠在睡眠剝奪后，反饋性地使促眠因子TNF-α、IL-1β 升高，抑制睡眠的IL-4、IL-10 降低，而且TNFα、IL-1β的升高可能還會(huì)激活HPA 軸。給予半夏秫米湯后，TNF-α、IL-1β 降低，IL-4、IL-10 升高，表明半夏秫米湯可能通過(guò)調(diào)控炎癥因子而抑制亢進(jìn)的HPA軸調(diào)節(jié)睡眠，尤以高劑量效果最好。

睡眠受到多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)，如γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）等。GABA 是腦內(nèi)主要的抑制性氨基酸類遞質(zhì)［15］。DA、NE是與覺(jué)醒有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠血清GABA、DA、NE 升高，給予半夏秫米湯后，上述指標(biāo)均降低，表明半夏秫米湯通過(guò)抑制上述神經(jīng)遞質(zhì)含量而干預(yù)睡眠，尤以半夏秫米湯高劑量組效果最好。

綜上所述，高脂飲食+單平臺(tái)水環(huán)境法復(fù)制痰濕內(nèi)阻慢性失眠大鼠模型可行。半夏秫米湯可通過(guò)抑制亢進(jìn)的HPA 軸、調(diào)控IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、GABA、NE、DA 表達(dá)而干預(yù)痰濕內(nèi)阻慢性失眠，以半夏秫米湯高劑量（原方劑量）效果最佳。