尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3表達(dá)變化及意義

吳佳理，張磊，肖玉鳳

貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院皮膚科，貴陽(yáng)550081

摘要：目的 探討尋常型銀屑?。≒V）患者皮損組織中微小RNA（miR）-145-5p、混合譜系酶3（MLK3）表達(dá)及意義。方法 選取78 例PV 患者，根據(jù) 病情嚴(yán)重程度分為輕度組（n=31）、中度組（n=28）、重度組（n=19）。采用RT-qPCR 檢測(cè)皮損組織和相鄰非皮損組織中miR-145-5p 和MLK3、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-17 mRNA 表達(dá)。采用免疫組化法檢測(cè)皮損組織和相鄰非皮損組織中MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。比較不同病情嚴(yán)重程度PV 患者皮損組織中miR-145-5p 和MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA 表達(dá)。Pearson法分析PV 患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA 表達(dá)與TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 與非皮損組織比較，皮損 組織中miR-145-5p、IL-10 mRNA 表達(dá)降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)升高（t分別為21.552、18.539、28.414、8.540、26.356、15.010、11.952，P 均＜0.01）。輕度組、中度組、重度組皮損組織中miR-145-5p、IL-10 mRNA表達(dá)依次降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表達(dá)依次升高（P均＜0.01）。與非皮損組織比較，皮損 組織中MLK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，重度 組MLK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于輕度組、中度組，中度 組MLK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于輕度組（P均＜0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，PV患者皮損組織中miR-145-5p表達(dá)與MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.627、-0.433、-0.546、-0.499、-0.502，P均＜0.01），與IL-10 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.652，P＜0.01）；MLK3與TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.620、0.595、0.556、0.597，P均＜0.01），與IL-10 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.733，P＜0.01）。結(jié)論 PV患者皮損組織中miR-145-5p低表達(dá)，MLK3 mRNA高表達(dá)；檢測(cè)二者表達(dá)有助于病情判斷。

關(guān)鍵詞：尋常型銀屑病；炎癥；微小RNA-145-5p；混合譜系酶3

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.009

中圖分類號(hào)：R246.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-266X（2022）10-0039-05

銀屑病是一種免疫相關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚疾病，典型皮損表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，局部或廣泛分布。尋常型銀屑病（PV）指點(diǎn)滴狀和斑塊狀銀屑病，占所有銀屑病的95%以上［1-2］。目前銀屑病的治療目的仍以控制、穩(wěn)定病情，減緩發(fā)展進(jìn)程，減輕瘙癢癥狀和皮損加重為主，尚無(wú)特效治療方法，復(fù)發(fā)率高，其病理生理機(jī)制仍是研究熱點(diǎn)。慢性炎癥參與PV 發(fā)生、發(fā)展［3］。微小RNAs（miRNAs）是一類短鏈非編碼小RNA，能在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)，在銀屑病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-5］。研究報(bào)道，miR-145-5p 與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、膿毒癥、神經(jīng)炎癥等免疫炎癥相關(guān)疾病相關(guān)［6-8］?；旌献V系酶3（MLK3）是絲蘇氨酸蛋白激酶家族一員，亦稱絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶11（MAP3K11），參與調(diào)控多種信號(hào)通路，在多種免疫炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用［9］。miRNA 靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p 與MLK3 存在結(jié)合位點(diǎn)，但關(guān)于二者與PV 病情嚴(yán)重程度和炎癥因子的相關(guān)性尚不明確。為此，我們對(duì)PV患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 表達(dá)及意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2021 年7 月貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院收治的78 例PV 患者，外科手術(shù)方式收集患者表皮皮損組織和相鄰非皮損組織，部分以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸染、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，剩余部分置于-196 ℃液氮中凍存后進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。其中男44 例、女34 例，年齡27～68（38.44±5.28）歲；病程4 個(gè)月～9 年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PV 符合《中國(guó)銀屑病診療指南（2018完整版）》［3］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床資料完整；③患者及家屬均知情研究，并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他皮膚疾?。虎隗w表創(chuàng)傷；③近2周接受過(guò)抗銀屑病治療；③免疫系統(tǒng)損害；④妊娠及哺乳期婦女；⑤合并重要臟器功能損害；⑥合并嚴(yán)重感染；⑦近3 個(gè)月內(nèi)使用光療、生物制劑、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑類、維A酸類藥物史；⑧惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 PV 皮損組織和非皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎癥因子表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取出凍存組織，碾碎后加入TRIzol試劑（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：LGTZ001）提取組織總RNA，NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)測(cè)RNA 濃度和純度，使OD260/OD280為1.8～2.0，Ta-KaRa 試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：RR036A）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用RT-qPCR 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：638315）和MiniAmp PCR 儀（賽默飛世爾科技有限公司）進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL：2×All-in-one qPCR Mix 10 μL、正向引物2 μL、反向引物2 μL、模板cDNA 2μL、ddH2O 4μL。熱循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min 循環(huán)1 次，95 ℃變性10 s、63 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中miR-145-5p 和MLK3、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-17 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。RT-qPCR 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，其中miR-145-5p 以U6 作內(nèi)參，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 以GAPDH 作內(nèi)參。miR-145-5p 正向引物：5′-CAGTCTTGTCCAGTTTTCCCAG-3′，反向引物：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTGTC-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MLK3 正向引物：5′-CATGCCACTCGACTTCAAGC-3′，反向引物：5′-AGACGTTTCTCCTCCGGTCA-3′；TNF-α 正向引物：5′-TGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTT-3′，反向引物：5′-CTCTCAGCTCCACGCCATTG-3′；IFN-γ 正向引物：5′-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3′，反向引物：5′-TCCCATGGGTTGTGTGTTTA-3′；IL-2 正向引物：5′-ATCTGTACCTGTCCTGCGTGTTG-3′，反向引物：5′-TTCTGCTTGAGAGGTGCTGATGT-3′；IL-10 正向引物：5′-CTTCGGTCCAGTTGCCTTCTC-3′，反向引物：5′-AGGTGAGTGGCTGTCTGTGT-3′；IL-17 正向引物：5′-TCTCAGCTCCACGCCATTG-3′，反向引物：5′-CCACGGACACCAGTATCTTCTC-3′；GAPDH 正向引物：5′-AACTTTGGGATTGTGGAAGG-3′，反向引物：5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′。

1.3 銀屑病嚴(yán)重程度分級(jí) PV 患者入院后根據(jù)《中國(guó)銀屑病診療指南（2018完整版）》［3］以體表受累面積（BSA）、銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）、皮膚病生活質(zhì)量指數(shù)（DLQI）進(jìn)行病情嚴(yán)重程度分級(jí)。輕度：BSA＜3%，PASI＜3，DLQI＜6；中度：BSA 3%～＜10%，PASI 3～＜10，DLQI 6～＜10；重度：BSA≥10%，PASI≥10，DLQI≥10。根據(jù)病情嚴(yán)重程度將PV 患者分為輕度組（n=31）、中度組（n=28）、重度組（n=19）。

1.4 PV 皮損組織和非皮損組織中MLK3 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。組織切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水、蘇木素-伊紅染色、脫水，將載玻片置于65 ℃環(huán)境下孵育45 min 后脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液和3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶以檢索抗原，非特異性抗原阻斷后，載玻片與兔抗人MLK3 抗體（杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2817S）在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。次日將載玻片與HRP 標(biāo)記的二抗（賽默飛世爾科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：B40952）在室溫下孵育1 h。DAB顯色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：P0203-1）顯色，蔡司光學(xué)顯微鏡（德國(guó)蔡司，型號(hào)：Carl Zeiss）觀察顯色程度，蘇木精復(fù)染，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算免疫組化評(píng)分。染色強(qiáng)度：棕褐色（3 分）、棕黃色（2分）、淡黃色（1 分）、無(wú)色（0 分）；陽(yáng)性細(xì)胞率（隨機(jī)5個(gè)高倍視野，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例）：≥75%（4分）、50%～＜75%（3 分）、25%～＜50%（2 分）、1%～＜25%（分）。免疫組化評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率，二者乘積≥2表示陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以-x±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行ANOVA趨勢(shì)檢驗(yàn)，組間兩兩比較Bonferroni校正；Pearson分析PV患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA與炎癥因子的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PV 皮損組織和非皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎癥因子表達(dá)比較 PV 皮損組織中miR-145-5p、IL-10 mRNA 表達(dá)低于非皮損組織，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)高于非皮損組織（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 PV皮損組織和非皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA和炎癥因子表達(dá)比較（-x±s）

2.2 不同病情嚴(yán)重程度PV 患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA 和炎癥因子表達(dá)比較 輕度組、中度組、重度組皮損組織中miR-145-5p 表達(dá)依次降低，MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)依次升高（P均＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 不同病情嚴(yán)重程度PV患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA和炎癥因子表達(dá)比較（-x±s）

2.3 PV 皮損組織和非皮損組織及不同病情嚴(yán)重程度PV 患者皮損組織中MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 皮損組織中MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率66.67%（52/78）高于非皮損組織39.74%（31/78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.354，P＜0.01）。輕度組、中度組、重度組MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為54.84%（14/31）、71.43%（20/28）、94.74%（18/19），重度組MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于輕度組、中度組，中度組MLK3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于輕度組（χ2=15.356，P＜0.01）。

2.4 PV 患者皮損組織中miR-145-5p、MLK3 mRNA與炎癥因子的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，PV患者皮損組織中miR-145-5p 表達(dá)與MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.627、-0.433、-0.546、-0.499、-0.502，P均＜0.01），與IL-10 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.652，P＜0.01）；MLK3與TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.620、0.595、0.556、0.597，P均＜0.01），與IL-10 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.733，P＜0.01）。

3 討論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是由免疫應(yīng)答異常、環(huán)境誘因、遺傳背景等因素相互作用導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)或角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖而發(fā)病，不僅會(huì)引起皮膚局部或廣泛鱗屑或斑塊，還可合并關(guān)節(jié)、內(nèi)臟損害、心血管疾病等其他系統(tǒng)異常，常罹患終身，尚無(wú)治愈方法，嚴(yán)重影響患者心理和生理健康［10］。進(jìn)一步探索銀屑病的病理生理機(jī)制對(duì)控制病情和維持長(zhǎng)期療效有重要意義。

目前研究認(rèn)為，銀屑病細(xì)胞炎癥反應(yīng)和過(guò)度增殖是以T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)為主，多種免疫細(xì)胞共同參與的過(guò)程，T 淋巴細(xì)胞在聚集于銀屑病皮損前就處于異常活化狀態(tài)，浸潤(rùn)表皮或真皮層后可促進(jìn)銀屑病進(jìn)一步發(fā)展［11］。既往認(rèn)為，PV 是“Th1 型”炎癥性疾病，細(xì)胞因子以TNF-α、IFN-γ、IL-2 增加為主。近年研究認(rèn)為，Th17 炎癥細(xì)胞IL-17 數(shù)量增加和Treg抗炎細(xì)胞IL-10數(shù)量減少，導(dǎo)致Th17/Treg失衡在PV中發(fā)揮重要作用［12-13］。miRNAs 是一類內(nèi)源性長(zhǎng)18～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，主要通過(guò)結(jié)合靶基因3′-非翻譯區(qū)，降解靶mRNA或阻礙靶蛋白翻譯，從而調(diào)控靶基因表達(dá)。大量研究報(bào)道其在銀屑病中發(fā)揮重要作用，如miR-489-3p 能靶向抑制Toll 樣受體4/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，進(jìn)而抑制銀屑病細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)［14］。miR-145-5p定位于人染色體5q32，王鴻利等［15］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-145-5p表達(dá)能靶向雙特異性磷酸酶6緩解脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。TANG 等［16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-145-5p 表達(dá)能靶向Pvt1 抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織炎癥反應(yīng)。上述研究提示，miR-145-5p在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要抑制作用。本研究結(jié)果顯示，與在非皮損組織中比較，PV 皮損組織中miR-145-5p 表達(dá)降低，且輕度組、中度組、重度組皮損組織中miR-145-5p 表達(dá)依次降低，提示miR-145-5p 低表達(dá)參與PV 發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PV 患者皮損組織中miR-145-5p 表達(dá)與TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與IL-10 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，提示miR-145-5p 低表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)參與PV 的發(fā)生、發(fā)展，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

PV 的慢性炎癥反應(yīng)與NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多條信號(hào)通路激活有關(guān)［17-18］。MLK3定位于人染色體11q13.1，是MAPK 家族的上游調(diào)控信號(hào)分子，在T 細(xì)胞中大量表達(dá)，其高表達(dá)與NFκB 和MAPK 信號(hào)通路激活有關(guān)［19］。WANG 等［20］研究報(bào)道，MLK3 高表達(dá)可通過(guò)NF-κB/含NLR 家族Pyrin 域蛋白3 信號(hào)通路增強(qiáng)心肌炎癥反應(yīng)。ZHANG 等［21］研究報(bào)道，抑制MLK3 表達(dá)能通過(guò)MAPK 信號(hào)通路顯著減少神經(jīng)炎癥。上述研究提示，MLK3 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與在非皮損組織中比較，PV 皮損組織中MLK3 mRNA 表達(dá)和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，且輕度組、中度組、重度組皮損組織中MLK3 mRNA 表達(dá)和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，提示MLK3 mRNA 高表達(dá)參與PV 發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PV 患者皮損組織中MLK3 mRNA 表達(dá)與TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，與IL-10 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示MLK3 mRNA 過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控炎癥參與PV 發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與MLK3 能激活NF-κB、MAPK 信號(hào)通路增強(qiáng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，PV患者皮損組織中miR-145-5p表達(dá)與MLK3 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能通過(guò)相互作用調(diào)節(jié)PV 炎癥反應(yīng)。YAN 等［22］通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-145-5p 能靶向下調(diào)MLK3 抑制銀屑病角質(zhì)化細(xì)胞增殖和NF-κB 信號(hào)通路激活，減輕銀屑病皮膚炎癥，與既往研究相符。

綜上所述，PV患者皮損組織中miR-145-5p低表達(dá)，MLK3 mRNA 高表達(dá)；檢測(cè)二者表達(dá)有助于病情判斷。但本研究為單中心小樣本量研究，可能存在選擇偏倚，同時(shí)miR-145-5p、MLK3 參與PV 的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。