血清miR-103、sCD40L對(duì)急性缺血性腦卒中治療效果及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值

韓旭東，梁志剛，閻志慧，張惠龍

1 煙臺(tái)海港醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 煙臺(tái) 264012；2 煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3 煙臺(tái)山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

急性缺血性腦卒中（AIS）是最常見(jiàn)的卒中類型，發(fā)病急，病情進(jìn)展快［1］。目前AIS治療以改善腦循環(huán)、抗氧化、清除氧自由基、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等為主，療效評(píng)估主要依賴于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分［2］，存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差的弊端，而準(zhǔn)確判斷AIS治療效果對(duì)進(jìn)一步治療和預(yù)后評(píng)估均有重要意義。動(dòng)脈粥樣硬化是推動(dòng)大中型動(dòng)脈病變的主要原因，與AIS發(fā)病、神經(jīng)功能惡化密切相關(guān)［3］。微小核糖核酸-103（miR-103）可通過(guò)靶向長(zhǎng)鏈非編碼RNA-WDR59促使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，還可靶向Kruppel樣因子4促進(jìn)促炎因子和趨化因子表達(dá)，參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程［4-5］。可溶性CD40 配體（sCD40L）主要來(lái)源于活化的血小板，與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成事件有關(guān)［6］。2019年2月—2021年1月，我們探討了血清miR-103、sCD40L在AIS患者療效判斷和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年2 月—2021 年1 月煙臺(tái)海港醫(yī)院收治的142 例AIS 患者（AIS 組），其中男92 例、女50 例，年齡（62.75±3.71）歲、體質(zhì)量指數(shù)（23.95±2.18）kg/m2，有吸煙史77例、飲酒史83例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》診斷流程和標(biāo)準(zhǔn)［7］；②起病至入院時(shí)間＜24 h；③入院后接受抗血小板、擴(kuò)血管、營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)等AIS常規(guī)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、脫髓鞘疾病、運(yùn)動(dòng)障礙性疾病等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；②合并嚴(yán)重心血管疾病，惡性腫瘤，肝腎功能障礙者；③凝血功能障礙，不能耐受抗血小板治療者；④隨訪失聯(lián)者。另選擇70 例同期于我院體檢的查體健康者為對(duì)照組，均排除心腦血管疾病，其中男41例、女29 例，年齡（62.19 ± 3.02）歲、體質(zhì)量指數(shù)（23.51±2.07）kg/m2，有吸煙史35例、飲酒史38例。兩組臨床基線資料均衡可比（P均＞0.05）。受試者均知情同意并簽署同意書(shū)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021141）。

1.2 臨床治療及效果評(píng)價(jià) 患者均接受靜脈溶栓、機(jī)械取栓或抗血小板治療，并給予依達(dá)拉奉（30 mg+5.00%葡萄糖注射液100 mL 靜脈滴注，2 次/天）清除氧自由基，甲鈷胺（每次0.5 mg，3 次/天，口服）營(yíng)養(yǎng)腦神經(jīng)。根據(jù)患者合并基礎(chǔ)疾病情況給予降糖（皮下胰島素注射）、降壓（卡托普利）或調(diào)脂（阿托伐他汀鈣）治療等，連續(xù)治療2周。2周后參考文獻(xiàn)［8］方法進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：NIHSS 評(píng)分減少91.00%～100.00%，殘疾程度0 級(jí)為痊愈；NIHSS 評(píng)分減少46.00%～90.00%，殘疾程度1～3 級(jí)為顯效；NIHSS評(píng)分減少18.00%～45.00%，臨床癥狀有所好轉(zhuǎn)為有效；NIHSS 評(píng)分減少＜18.00%或增加＞18.00%，甚至死亡為無(wú)效。有效=痊愈+顯效+有效，根據(jù)治療效果將患者分為有效組（106例）和無(wú)效組（36例）。

1.3 血清miR-103、sCD40L 檢測(cè) 所有AIS 患者分別于治療前、治療3 d、治療7 d、治療14 d，對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集血標(biāo)本，取血液凝固后上層血清離心（3 000 r/min，半徑15 cm，時(shí)間10 min）處理后冷凍保存待檢。取血清樣本加入TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，NanoDrop-1000 紫外分光光度計(jì)（NanoDrop公司）檢測(cè)RNA純度和濃度。取20μg總RNA，采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Epicentre 公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR 法檢測(cè)血清miR-103表達(dá)：CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司），引物設(shè)計(jì)由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成。miR-103 正向引物：5'-TGATGCTGGTGCTAGAAGT-3'，反向引物：：5'-TCTCCACAGAACAGGCAAG-3'；U6 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s、65 ℃退火20 s、75 ℃延伸15 s共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，共做3 次平行試驗(yàn)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-103相對(duì)表達(dá)量。取血清樣本，采用Multiskan SkyHigh 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清sCD40L水，試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)納生物有限公司（批號(hào)201930）。

1.4 預(yù)后觀察 患者出院后定期電話隨訪，囑不適隨診，指導(dǎo)患者按時(shí)按量服用抗血小板、降壓和降糖藥物。出院3 個(gè)月后采用改良RANKIN 量表（mRS評(píng)分）［9］評(píng)價(jià)患者殘疾程度，分為0～5 共6 個(gè)等級(jí)，0、1分為無(wú)明顯殘疾；2分為輕度殘疾；3分為中度殘疾；4分為重度殘疾；5分為嚴(yán)重殘疾。0、1分患者歸為神經(jīng)預(yù)后良好組（99 例），2～5 分歸為神經(jīng)預(yù)后不良組（43例）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以-x±s表示，比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。Logistic 逐步回歸分析AIS 患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-103、sCD40 評(píng)估AIS 患者治療效果及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIS組和對(duì)照組血清miR-103、sCD40L比較 AIS組與對(duì)照組血清miR-103 水平分別為3.29 ± 0.61、1.42 ± 0.38，血清sCD40L 水平分別為（362.77 ±62.18）、（83.26 ± 13.47）pg/mL，AIS 組血清miR-103、sCD40L水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.2 不同療效組治療期間血清miR-103、sCD40L比較 兩組治療前后血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間分別為23.251、32.0541，P組間＜0.05），有效組治療后血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平先升高后下降（F時(shí)間分別為31.091、27.025，P時(shí)間＜0.05），無(wú)效組治療后血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間分別為2.091、2.025，P時(shí)間均＞0.05）。兩組間存在交互效應(yīng)（F交互分別為29.668、25.032，P交互＜0.05），兩組治療前、治療3 d 血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），有效組治療7 d、治療14 d 血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平低于無(wú)效組（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組治療期間血清miR-103表達(dá)、sCD40L水平比較（-x ± s）

2.3 影響AIS 患者預(yù)后的因素分析 預(yù)后不良組年齡、大梗死比例、心房顫動(dòng)、NIHSS評(píng)分、發(fā)病至入院時(shí)間、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、治療14 d 血清miR-103、治療14 d 血清sCD40L 高于預(yù)后良好組（P均＜0.05），兩組性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高血脂癥、左心房血栓形成、梗死部位、心率、收縮壓、舒張壓、TG、HDL-C、LDL-C 治療3、7 d 的miR-103、sCD40L 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），其他指標(biāo)比較見(jiàn)表2。以AIS 患者預(yù)后為因變量（賦值：預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1），以年齡、病變大?。ㄙx值：腔隙性梗死=1，小梗死=2，大梗死=3）、心房顫動(dòng)（賦值：否=0，是=1）、發(fā)病至入院時(shí)間、LDL-C、HbA1c，收縮壓、舒張壓、NIHSS 評(píng)分、TC、FPG、治療14 d 血清miR-103、治療14 d 血清sCD40L 為自變量，逐步法排除無(wú)關(guān)變量，Logistic 逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，NIHSS評(píng)分、治療14 d 血清miR-103、治療14 d血清sCD40L 是AIS 患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 影響AIS患者預(yù)后的單因素分析

表3 影響AIS患者預(yù)后的Logistic回歸分析

2.4 miR-103、sCD40L 判斷AIS 治療療效及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的價(jià)值 治療7、14 d 的miR-103、sCD40L判斷AIS 治療療效的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.15、336.32 pg/mL、2.03、316.35 pg/mL，曲線下面積（AUC）分別為0.756、0.724、0.592、0.572。治療7 d miR-103 聯(lián)合sCD40L 判斷AIS 治療療效的AUC為0.875，高于治療7 d miR-103、sCD40L單獨(dú)（Z分別為2.513、3.146，P均＜0.05）。治療14 d miR-103、sCD40L 預(yù)測(cè)AIS 患者預(yù)后的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.95、312.16 pg/mL，AUC分別為0.763、0.732，治療14 d miR-103 聯(lián)合sCD40L 預(yù)測(cè)AIS 患者預(yù)后的AUC為0.854，高于治療14 d miR-103、sCD40L 單獨(dú)判斷（Z分別為2.201、2.543，P均＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 miR-103、sCD40L判斷AIS治療療效及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的效能

3 討論

AIS 是腦組織血液供應(yīng)異常導(dǎo)致的腦缺血性疾病，可引起神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)缺損癥狀，最終遺留殘疾甚至引起患者死亡。高齡、肥胖、高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙等是AIS 發(fā)病的高危因素［10］。動(dòng)脈粥樣硬化是AIS 發(fā)病、進(jìn)展以及復(fù)發(fā)的主要原因，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落可引起腦血管堵塞以及相應(yīng)腦組織缺血缺氧，神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死，影響神經(jīng)功能障礙［11］。

miRNAs 是短、單鏈、非編碼RNA，通過(guò)與信使RNA 相互作用影響蛋白質(zhì)合成調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，某些miRNAs 通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化易感基因及其轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)水平，引起內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞失調(diào)，促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成［12］。miR-103是miR-15/107家族成員?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，miR-103 通過(guò)靶向長(zhǎng)鏈非編碼RNA WDR59 表達(dá)，增加增殖內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的有絲分裂畸變的易感性，促進(jìn)內(nèi)皮適應(yīng)不良，血管炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療有效組miR-103 表達(dá)于治療7 d 后下降，但無(wú)效組并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明miR-103 表達(dá)與AIS療效存在密切關(guān)系。ROC 曲線分析結(jié)果示治療7 d血清miR-103表達(dá)判斷AIS臨床療效的價(jià)值最高，分析原因?yàn)橹委? d后多數(shù)治療有效患者病情基本趨于穩(wěn)定，此時(shí)檢測(cè)血清miR-103 表達(dá)可更好地鑒別不同療效患者。Logistic 逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-103 表達(dá)增高是AIS 患者神經(jīng)預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。唐蕾等［5］認(rèn)為，miR-103 表達(dá)上調(diào)與AIS 患者神經(jīng)功能惡化有關(guān)。分析原因?yàn)閙iR-103 可促使海馬神經(jīng)元中核因子-κB 活化，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡［14］，miR-103 還可靶向抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，抑制新生血管形成，導(dǎo)致腦梗死體積增加［15］，促使神經(jīng)功能惡化。

sCD40L 是CD40 的可溶性配體，來(lái)源于活化血小板，具有促炎和促凝作用，在頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化中增加，被認(rèn)為是心血管疾病的潛在生物學(xué)指標(biāo)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，血清sCD40L 水平與AIS治療效果有關(guān)，治療7天血清sCD40L水平在AIS治療效果評(píng)估中具有較高價(jià)值，治療14 天sCD40L水平增高是AIS 患者神經(jīng)預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示sCD40L 可作為AIS 療效判斷和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。推測(cè)sCD40L 參與AIS 患者不良預(yù)后的機(jī)制：CD40/CD40L通過(guò)激活炎癥和凝血反應(yīng)導(dǎo)致血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化，血小板表面CD40L和sCD40L表達(dá)可促使膠原蛋白釋放，膠原蛋白誘導(dǎo)p38 MAP激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和熱休克蛋白27磷酸化、基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)，活性氧產(chǎn)生，促使動(dòng)脈粥樣硬化形成［17］。其次，sCD40L 還通過(guò)糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 配體依賴性機(jī)制刺激血小板活化，導(dǎo)致和加強(qiáng)血小板—白細(xì)胞黏附，募集白細(xì)胞到血栓部位，加劇局部炎癥反應(yīng)，促使動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成［18］，最終引起AIS 神經(jīng)功能惡化和不良結(jié)局的發(fā)生。本研究miR-103、sCD40L在治療3 d時(shí)增高可能原因?yàn)樯刑幱诓∏檫M(jìn)展階段，隨著溶栓、抗血小板治療后腦缺血癥狀得以控制，miR-103表達(dá)逐漸降低

綜上所述，AIS 治療無(wú)效、預(yù)后不良患者血清miR-103 表達(dá)、sCD40L 水平均增高，miR-103、sCD40L 增高是AIS 患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。治療7 d miR-103、sCD40L 可用于判斷AIS 治療效果，治療14 d miR-103、sCD40L 可作為AIS 患者預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)，miR-103 聯(lián)合sCD40L 可提高療效判斷和預(yù)后評(píng)估的效能。本研究局限之處在于樣本量偏少，可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。