香皂產(chǎn)品除菌效果應(yīng)用研究

楊 潔 姚晨之, 嚴(yán) 方, 王 杰 孟麗君

1.中國日用化學(xué)工業(yè)研究院，山西太原，030001；2.中輕日用化學(xué)檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，山西太原，030001

香皂是日常生活中不可缺少的衛(wèi)生清潔用品。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、人民生活水平的提高以及公共衛(wèi)生理念的不斷完善，消費(fèi)者希望香皂除了基本的去污功效，還能具有除菌功效。生產(chǎn)商為了適應(yīng)市場的需求，紛紛推出各種具有除菌功效的產(chǎn)品[1-3]。

目前，“除菌”對于衛(wèi)生清潔用品僅是個概念宣傳，事實(shí)上，日化行業(yè)對于衛(wèi)生清潔用品尚沒有統(tǒng)一明確的關(guān)于“除菌”的定義和評價標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有涉及產(chǎn)品微生物功效作用方面，有明確定義的是“抗/殺菌”“抑菌”，如行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2738—2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》[4]?？咕蛞志侵覆捎没瘜W(xué)或物理的方法殺滅/抑制或妨礙細(xì)菌生長繁殖及其活性的過程，“除菌”概念最先由業(yè)內(nèi)部分生產(chǎn)企業(yè)提出，根據(jù)字面含義，可以認(rèn)為是指采用物理化學(xué)的方法洗去載體表面上附著的細(xì)菌并妨礙其生長繁殖的過程。產(chǎn)品洗去細(xì)菌的效果可以通過模擬實(shí)際洗滌過程檢驗(yàn)。國外已有與手部衛(wèi)生用品除菌效果相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法，如美國材料測試協(xié)會的標(biāo)準(zhǔn)ASTM E117413[5]和ASTM E289712[6]，前者規(guī)定了通過人體試驗(yàn)法評價除菌洗手液在洗手過程中除菌效果的測試方法，后者為通過體外模擬法評價手部衛(wèi)生用品除菌效果的測試方法。ASTM E117413中人體試驗(yàn)法的實(shí)際操作難度較大，且會對受試者帶來一定的風(fēng)險；ASTM E289712中尚未對體外模擬法的具體試驗(yàn)條件進(jìn)行規(guī)定。此兩項(xiàng)國外標(biāo)準(zhǔn)中推薦的試驗(yàn)菌種為黏質(zhì)沙雷菌和大腸埃希菌，缺少國內(nèi)日化行業(yè)抗抑菌常用的推薦測試菌種金黃色葡萄球菌。本文以市面上常見的香皂產(chǎn)品為例，對香皂產(chǎn)品的除菌測試方法進(jìn)行了探索，研究了試驗(yàn)菌種、洗脫條件對除菌效果的影響，最終建立了一種香皂產(chǎn)品除菌效果的測試評價方法，并使用該方法評價不同香皂產(chǎn)品的除菌效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

菌種（金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸埃希菌ATCC 8099），山西省疾病預(yù)防控制中心；無菌新鮮豬皮，自制；氯化鈣（CaCl2）、六水合氯化鎂（MgCl2·6H2O），無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4），磷酸二氫鉀（KH2PO4），均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；吐溫80，化學(xué)純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂（NA）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-50S11，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司；渦旋振蕩器G560E，上海滬西分析儀器廠有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250A，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的準(zhǔn)備

取第3～6代試驗(yàn)菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物，參照QB/T 2738—2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法》制備菌懸液，用0.03mol/L PBS溶液將試驗(yàn)菌懸液稀釋，通過濁度儀調(diào)節(jié)菌懸液濃度至(1.0～5.0)×108cfu/ml備用。

1.2.2 測試載體的處理

以無菌新鮮豬皮作為測試載體，新鮮豬皮預(yù)先經(jīng)物理方法進(jìn)行無菌處理（可采用鈷-60輻射滅菌）。用無菌剪刀將豬皮裁剪至5 cm×5 cm，平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，每兩塊豬皮為一組，擦干豬皮表面多余水分，在每塊豬皮上接種0.10 ml菌懸液，使用一次性接種環(huán)將菌液涂抹均勻，避免接觸豬皮邊緣部位，于室溫下靜置20 min備用。將人工污染后的豬皮放入含60 ml PBS采樣溶液的密封袋內(nèi)中均勻搓揉皮膚1 min進(jìn)行基線回收。

1.2.3 操作步驟

稱取0.25 g的待測試樣，置于一塊豬皮的中央，再滴加1.00 ml無菌硬水，另取一塊豬皮覆蓋在試樣上，固定底層的豬皮，手持?jǐn)z子以中等力度揉搓上層豬皮15 s至試樣完全溶解；待試樣完全溶解并起泡后再以中等力度將兩塊皮沿上下左右的方向?qū)Υ?0 s；用鑷子夾住豬皮一端，左右移動豬皮，依靠水的自然下流沖洗15s，保持豬皮與水流的夾角約為120°，用無菌紙巾輕拍吸干豬皮上多余水分；清洗后的1 min內(nèi)，將兩塊豬皮分別置于無菌密封袋內(nèi)，加入60 ml的PBS采樣溶液，均勻搓揉皮膚1 min。無菌操作回收密封袋內(nèi)0.5 ml的洗脫液進(jìn)行梯度稀釋。以無菌硬水代替試樣，重復(fù)上述操作作為空白對照組。采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)，澆注TSA平板的方式對洗脫液中的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)

將試驗(yàn)組和空白對照組的平板倒置于（36±1）℃的生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)（48±4）h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。計(jì)算不同試樣的相對除菌率。

式中：Ⅰ.空白對照組回收菌落數(shù)；Ⅱ.試驗(yàn)組回收菌落數(shù)。

1.3 可靠性評價

使用此方法對5種市售香皂的除菌效果進(jìn)行評價，其中試樣A、B、D為具有除菌宣傳的香皂產(chǎn)品，試樣C、E為普通型香皂產(chǎn)品，產(chǎn)品的配方信息見表1。對每個樣品進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)中每個樣品做3組平行。對比3次試驗(yàn)結(jié)果，通過每組數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差等指標(biāo)評價該方法的重復(fù)性和區(qū)分度。

表1 不同香皂產(chǎn)品的配方信息

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One Way ANOVA）檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，對多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較通過等方差假設(shè)選項(xiàng)下的LSD方法進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)菌種的選擇

國內(nèi)日化行業(yè)抗抑菌相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中常見的推薦菌種有金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸埃希菌（ATCC 8099）分別作為革蘭氏陽性代表菌和革蘭氏陰性代表菌。分別以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌，測試了僅使用硬水清洗豬皮的除菌率；表2數(shù)據(jù)說明，對豬皮上金黃色葡萄球菌的水洗除菌率約為50%，表3數(shù)據(jù)說明，對豬皮上大腸埃希菌的水洗除菌率約為65%；僅通過清水沖洗只能除去載體表面的部分細(xì)菌，日常生活中仍需要使用具有除菌功效的洗滌產(chǎn)品，因此，本方法中香皂產(chǎn)品的除菌方法中以金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）作為革蘭氏陽性菌的代表試驗(yàn)菌，以大腸埃希菌（ATCC 8099）作為革蘭氏陰性菌的代表試驗(yàn)菌。

表2 以金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌時無菌硬水的除菌效果

表3 以大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌時無菌硬水的除菌效果

2.2 試驗(yàn)載體的選擇

體外模擬法的關(guān)鍵是需要找到一種可以替代人體皮膚的離體皮膚模型。在不同的動物皮膚中，豬的皮膚厚度與人體皮膚厚度相似，豬皮膚角質(zhì)層含有與人體皮膚角質(zhì)層相似的蛋白質(zhì)成分，以及真皮層血管的數(shù)量、大小、分布都與人體皮膚相似，豬的體表面積大，可同時采集多個樣本[7-8]，國外標(biāo)準(zhǔn)ASTM E289712中也推薦以離體豬皮作為載體進(jìn)行試驗(yàn)。因此本方法中以無菌豬皮作為染菌載體，每兩塊豬皮為一組。試驗(yàn)前需要將豬皮裁剪至5 cm×5 cm，以便于將兩塊豬皮進(jìn)行對搓。

2.3 菌懸液及待測試樣的添加量

每塊豬皮上試驗(yàn)菌懸液及待測試樣的添加量參考標(biāo)準(zhǔn)ASTM E289712的附錄進(jìn)行計(jì)算，具體是根據(jù)在豬皮上的使用體積與臨床研究中在手上的使用體積成比例進(jìn)行估算。試驗(yàn)中所用的豬皮大小為5 cm×5 cm，已知男性的平均手表面積為1070cm2，女性的平均手表面積為890 cm2，男性和女性的近似平均值為980 cm2，ASTM E117413中推薦每位受試者手上使用4.50 ml的試驗(yàn)菌懸液，等價于每對豬皮上添加0.230 ml的試驗(yàn)菌懸液，結(jié)合實(shí)際情況，在每塊5 cm×5 cm豬皮上添加0.10 ml的試驗(yàn)菌懸液時，剛好可以涂抹均勻而不會過量；ASTM E117413中推薦每位受試者手上使用5.00 ml的待測試樣，等價于每對豬皮上添加0.255 ml的待測試樣，結(jié)合實(shí)際情況，本方法中每對豬皮使用0.25 ml的待測試樣。計(jì)算公式如下：Vh＝手上待測試樣（或微生物懸浮液）的體積；Ap＝豬皮的表面積；Ah＝手的表面積。

2.4 洗脫方式

2.4.1 洗脫液成分

各標(biāo)準(zhǔn)中采用的洗脫液成分有所不同，《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版） 2.1.8.8中以0.03 mol/L PBS作為洗脫液回收織物上的殘留活菌；ASTM E117413中以含0.1%AEO9的0.03 mol/L PBS溶液作為通過人體試驗(yàn)法評價除菌洗手液除菌效果方法的洗脫液。本方法中對洗脫液的種類進(jìn)行了研究，由表4數(shù)據(jù)可知，使用不同的洗脫液對染菌載體的洗脫效果有所不同，0.5%吐溫80（PBS配制）的洗脫效果較差，洗脫率約為80%；0.03 mol/L PBS和0.3%卵磷脂+1%吐溫80（PBS配制）的洗脫效果較好，洗脫率均在90%以上；0.3%卵磷脂+1%吐溫80（PBS配制）的配制較PBS復(fù)雜，而這兩種洗脫液對無菌豬皮的洗脫效果差別不大。因此本方法中以PBS作為洗脫液。

表4 洗脫液成分對豬皮洗脫效果的影響

2.4.2 洗脫液體積

為了研究洗脫液體積對洗脫效果的影響，分別使用40 ml、60 ml、80 ml、100 ml的洗脫液將細(xì)菌從人工污染的豬皮上洗脫。從表5中數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)洗脫液體積為60ml時，洗脫下來的細(xì)菌含量最多，對于無菌豬皮上的細(xì)菌洗脫效果最好。當(dāng)洗脫液體積較少時，無法完全浸沒豬皮，洗脫不充分；當(dāng)洗脫液體積較多時，可以完全浸沒豬皮，但細(xì)菌在洗脫液中可能分布不夠均勻，細(xì)菌回收率也較低，因此，本方法中以60ml作為回收人工污染后豬皮上細(xì)菌的洗脫液用量。

表5 洗脫液體積對豬皮洗脫效果的影響

2.4.3 洗脫時間

為了研究洗脫時間對洗脫效果的影響，分別測試了在30s、60s、90s、120s四個洗脫時間下對人工污染的豬皮上細(xì)菌的洗脫效果（表6）。圖1可知，隨著洗脫時間的增加，細(xì)菌回收率也越高，當(dāng)洗脫時間為60s時，洗脫下來的細(xì)菌數(shù)達(dá)到拐點(diǎn)，再隨著洗脫時間增加，回收菌數(shù)的增幅較小。因此本方法中將60s作為回收染菌豬皮上活菌數(shù)的洗脫時間。

圖1 洗脫時間對豬皮洗脫效果的影響

表6 洗脫時間對豬皮洗脫效果的影響

2.5 不同試樣的除菌效果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證使用該方法評價不同香皂產(chǎn)品除菌效果的重復(fù)性及區(qū)分度，隨機(jī)選取5種市售香皂產(chǎn)品，分別以金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和大腸埃希菌（ATCC 8099）作為試驗(yàn)菌，測試不同產(chǎn)品的相對除菌率，并對結(jié)果通過單因素方差分析檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較。

以金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌時，表7為3種除菌香皂和2種普通香皂的三次重復(fù)試驗(yàn)的相對除菌率結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，除菌香皂與普通香皂之間的相對除菌率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且不同產(chǎn)品試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與除菌率的高低有關(guān)，除菌率越高，重復(fù)試驗(yàn)的方差值越小，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性越好。

表7 不同香皂產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌的相對除菌率

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對3種除菌香皂和2種普通香皂兩兩之間的相對除菌率分布差異通過等方差假定選項(xiàng)下的LSD方法進(jìn)行比較（表8），結(jié)果顯示，在3種除菌香皂中，試樣D-試樣A、試樣A-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），試樣D-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，不同產(chǎn)品配方中添加的除菌有效成分不同，會進(jìn)一步影響產(chǎn)品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分，會影響產(chǎn)品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，當(dāng)產(chǎn)品配方中不含有效除菌成分時，其余成分對產(chǎn)品的除菌效果也具有一定的影響，但普通香皂的除菌效果均明顯低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素。

表8 不同香皂產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌的相對除菌率的兩兩比較

以大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌時，表9為3種除菌香皂和2種普通香皂的三次重復(fù)試驗(yàn)的相對除菌率結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，除菌香皂與普通香皂之間的相對除菌率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且不同產(chǎn)品試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與除菌率的高低有關(guān)，除菌率越高，重復(fù)試驗(yàn)的方差值越小，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性越好。此外，與金黃色葡萄球菌作為試樣菌相比，同一試樣對大腸埃希菌的除菌效果均優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的除菌效果。

表9 不同香皂產(chǎn)品對大腸埃希菌的除菌量

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對3種除菌香皂和2種普通香皂兩兩之間的相對除菌率分布差異通過等方差假定選項(xiàng)下的LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較（表10），結(jié)果顯示，在3種除菌香皂中，試樣D-試樣A的兩兩之間相對除菌率平均值差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），試樣D-試樣B、試樣A-試樣B的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，不同產(chǎn)品配方中添加的有效除菌成分不同，會進(jìn)一步影響產(chǎn)品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分，會影響產(chǎn)品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的兩兩之間相對除菌率平均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見，當(dāng)產(chǎn)品配方中不含有效除菌成分時，其余成分對產(chǎn)品的除菌效果也具有一定的影響，但普通香皂的除菌效果均明顯低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素。

表10 不同香皂產(chǎn)品對大腸埃希菌的相對除菌率的兩兩比較

3 結(jié)論

市面上的香皂產(chǎn)品多種多樣，有不少產(chǎn)品都宣傳其具有除菌效果，但是現(xiàn)有的國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中尚未建立除菌性能的測試評價方法[4-5]。本研究中，通過對試驗(yàn)條件進(jìn)行探索，確定了以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌，5 cm×5 cm的無菌豬皮作為載體，每兩塊為一組，試驗(yàn)中，每塊豬皮上添加0.10 ml的試驗(yàn)菌懸液，待測試樣的使用量為0.25 g，清洗過程結(jié)束后，將每塊豬皮置于含60 ml PBS溶液的無菌密封袋內(nèi)均勻揉搓60 s以回收豬皮表明的殘留活菌，建立了一種香皂產(chǎn)品除菌效果的試驗(yàn)方法，用于評價香皂產(chǎn)品的除菌效果。

在此試驗(yàn)條件下，選取5種市售的香皂產(chǎn)品進(jìn)行了三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明該除菌方法具有較好的重復(fù)性及區(qū)分度，同一試樣對大腸埃希菌的除菌效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌，不同試樣相對除菌率的重復(fù)性與除菌效果有關(guān)，除菌效果越好的試樣，除菌率的重復(fù)性越高。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，除菌香皂試樣A、B、D通過該方法測得相對除菌率均高于普通香皂試樣C、E，香皂產(chǎn)品配方中是否添加有效除菌成分是產(chǎn)品除菌效果高低的主要影響因素，而配方中不同的除菌成分以及其余成分也會進(jìn)一步影響產(chǎn)品的除菌效果。因此，此除菌方法可用于評價不同香皂產(chǎn)品的除菌效果，同時也可作為日化產(chǎn)品除菌行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定基礎(chǔ)。