結(jié)直腸腺瘤性息肉中醫(yī)證型與病理類型和糞便多配體聚糖2基因甲基化的相關(guān)性

張強(qiáng) 王再見 李會霞 李彤 雷雪 曲冬梅

1 對象與方法

1.1 對象

選取2020年01月至2021年06月就診于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院的310例APs患者，其中男性為186例，女性為124例，年齡38～74歲，平均年齡62(52，67)歲；其中管狀腺瘤222例，管狀絨毛狀腺瘤66例，絨毛狀腺瘤22例，低級別上皮內(nèi)瘤變281例，高級別上皮內(nèi)瘤變29例。另選取腸鏡及病理檢查無異常的健康體檢者75例為正常對照組，其中男性47例，女性28例，年齡31～72歲，平均年齡62(49，67)歲。APs組與正常對照組在年齡和性別方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查(編號：ECGZRSL-ZYDSY2021-13)，同意開展相關(guān)研究，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)直腸腺瘤性息肉的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國結(jié)直腸癌多學(xué)會工作組制定的《結(jié)腸鏡檢查及息肉切除術(shù)后隨訪建議(2020年)》[6]、世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的《消化系統(tǒng)腫瘤分類(2019年)》[7]和中華醫(yī)學(xué)會制定的《胃腸道腺瘤和良性上皮性息肉的病理診斷共識(2020年)》[8]。中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國家中醫(yī)藥管理局重點專科專病項目組制訂的《大腸息肉(結(jié)腸息肉)中醫(yī)臨床路徑》和中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布的《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南—西醫(yī)疾病部分》[9]和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[10]中有關(guān)胃腸疾病中醫(yī)證型診斷的相關(guān)內(nèi)容，并結(jié)合高年資醫(yī)生的臨床經(jīng)驗，分為大腸濕熱證、濕瘀阻滯證、脾虛濕蘊(yùn)證和氣滯血瘀證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)年齡≥18歲；(2)腸道準(zhǔn)備良好并完成全結(jié)腸檢查(結(jié)腸鏡到達(dá)回盲瓣)；(3)經(jīng)腸鏡和病理檢查符合上述現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(4)中醫(yī)四診信息記錄完全，符合上述中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)腸道準(zhǔn)備不充分，影響觀察者；(2)水樣便或不能收集大便者；未完成病理學(xué)檢查者；(3)診斷為結(jié)直腸惡性腫瘤、炎癥性腸病、缺血性腸炎或非特異性腸炎者；(4)合并有嚴(yán)重呼吸、心腦血管疾病或內(nèi)分泌等疾病者；(5)臨床資料不完整者。

1.5 病例信息采集及臨床資料檢測

制定臨床調(diào)查問卷，由經(jīng)副高或以上級別醫(yī)生指導(dǎo)培訓(xùn)合格的調(diào)查專員收集受檢者的臨床資料，包括：(1)年齡(<60歲、≥60歲)；(2)性別(男、女)；(3)中醫(yī)四診信息(神態(tài)、面色、寒熱、腹部癥狀、大便情況、舌脈等)；(4)腺瘤數(shù)量(單發(fā)、多發(fā))；(5)腺瘤大小(<10 mm、≥10 mm)；(6)組織學(xué)類型(管狀腺瘤、管狀絨毛狀腺瘤、絨毛狀腺瘤)；(7)上皮內(nèi)瘤變程度(低級別、高級別)；(8)糞便SDC2基因甲基化檢測結(jié)果。中醫(yī)證型由具有5年工作經(jīng)驗的主治中醫(yī)師根據(jù)患者的癥狀、體征和舌脈進(jìn)行診斷，然后由另外一位具有相同工作經(jīng)驗的主治中醫(yī)師進(jìn)行審核，若兩位中醫(yī)師有不同的辨證意見，則請一位具有10年工作經(jīng)驗的副主任及以上的中醫(yī)師進(jìn)行辨證分型，取意見一致者為最終辨證結(jié)果。結(jié)腸鏡檢查由3年以上操作經(jīng)驗的主治醫(yī)師或副主任醫(yī)師使用奧林巴斯GIF HQ290腸鏡(奧林巴斯光學(xué)，日本，京東)進(jìn)行操作，術(shù)前波士頓腸道準(zhǔn)備量表評分≥9分，退鏡時間≥6分鐘。腸鏡下取得標(biāo)本后，用福爾馬林固定，由2位不知患者內(nèi)鏡結(jié)果的病理醫(yī)師以世界衛(wèi)生組織的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]分別進(jìn)行病理診斷。其中多發(fā)腺瘤，直徑記錄最大者，病理記錄惡性程度最高者。在腸鏡檢查前使用人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)(廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司)的采集裝置收集受檢者5～10 g糞便，標(biāo)記后于-80℃冰箱內(nèi)由廣州康立明生物醫(yī)學(xué)檢測實驗室在糞便樣本采集36小時內(nèi)進(jìn)行糞便SDC2基因甲基化檢測。

1.6 糞便SDC2基因甲基化檢測

糞便SDC2基因甲基化檢測包括DNA的提取、亞硫酸鹽的處理和熒光定量PCR等過程。首先用磁珠捕獲的方法提取人糞便樣本中的SDC2基因和β-肌動蛋白(ACTB)基因，然后用亞硫酸鹽將未發(fā)生甲基化的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在同一個反應(yīng)孔中，采用雙重?zé)晒釶CR檢測甲基化的SDC2基因及ACTB基因保守序列，甲基化的SDC2基因通過擴(kuò)增后由羧基熒光素標(biāo)記的熒光探針報告擴(kuò)增信號，ACTB基因擴(kuò)增后由Texas Red標(biāo)記的熒光探針報告擴(kuò)增信號，計算ACTB基因和SDC2基因的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。根據(jù)人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒的設(shè)定，ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值≤38時判斷樣本為陽性；ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值>38時判定為陰性樣本；ACTB基因Ct值>36或者無Ct值時，判定為樣本不合格。

1.7 研究方法

觀察APs不同年齡分層、性別、腺瘤數(shù)量、大小、組織學(xué)類型和上皮內(nèi)瘤變的糞便SDC2基因甲基化特征，比較APs各證型間年齡分層、性別、腺瘤數(shù)量、大小、組織學(xué)類型、上皮內(nèi)瘤變和糞便SDC2基因甲基化的差異，觀察APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征，分析APs中醫(yī)證型與組織學(xué)類型、上皮內(nèi)瘤變和糞便SDC2基因甲基化的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。本研究中，年齡為計量資料，經(jīng)正態(tài)性檢驗不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(M)和第25，75百分位數(shù)(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U檢驗比較APs和正常對照組兩組間年齡差異。APs各證型的年齡分層、性別、腺瘤數(shù)量、腺瘤最大直徑、組織學(xué)類型、上皮內(nèi)瘤變和糞便SDC2基因甲基化等資料為計數(shù)資料，以頻數(shù)和百分比表示，多組間比較采用Pearsonχ2檢驗或似然比χ2檢驗，兩兩比較采用Pearsonχ2檢驗或連續(xù)校正χ2檢驗。采用Spearman相關(guān)系數(shù)法觀察中醫(yī)證型與組織學(xué)類型、上皮內(nèi)瘤變和糞便SDC2基因甲基化的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

樓下的小商販里，還有一位賣菜的小伙子，眉清目秀的，透著精干勁兒。一般賣菜的都是老頭或老太太，小伙子在其中格外顯眼。有人打趣說：“你一個大小伙子，干點啥掙得都少不了，干嘛跑這里賣菜？”小伙子哈哈一笑說：“我在這里待的時間不會太長，我賣菜其實就是做點市場調(diào)查，為以后搞蔬菜大棚做準(zhǔn)備。大伙兒發(fā)現(xiàn)沒有，現(xiàn)在大棚蔬菜很有市場，我打算過一陣回老家，承包幾畝地，種大棚蔬菜。到時候，大爺大娘們到我那里進(jìn)菜哦，肯定給你們實惠價……”大伙兒都覺得他說的這些沒影兒的事很無趣，沒幾個人搭茬，經(jīng)常是他一個人雙眼放光地自說自話。

2 結(jié)果

2.1 APs各證型臨床病理特征

310例APs患者中，大腸濕熱證78例、濕瘀阻滯證76例、脾虛濕蘊(yùn)證81例、氣滯血瘀證75例。如表1，APs各證型在年齡、性別及腺瘤數(shù)量及大小方面，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 APs各證型年齡、性別及腺瘤數(shù)量和最大直徑情況

如表2，APs以管狀腺瘤為主，管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤占比較低。各證型在組織學(xué)類型方面，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中各證型在管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤占比方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但在管狀絨毛狀腺瘤占比方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大腸濕熱組(79.49%)管狀腺瘤占比高于氣滯血瘀組(62.67%)，氣滯血瘀組管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤合計占比為37.33%，高于大腸濕熱組(20.51%)和脾虛濕蘊(yùn)組(22.22%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。濕瘀阻滯組(13.16%)絨毛狀腺瘤占比高于大腸濕熱組(2.56%)和脾虛濕蘊(yùn)組(2.47%)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 APs各證型病理特征

APs以低級別上皮內(nèi)瘤變?yōu)橹?，高級別上皮內(nèi)瘤變占比較低。各證型在上皮內(nèi)瘤變程度方面，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，濕瘀阻滯組(17.11%)高級別上皮內(nèi)瘤變占比高于大腸濕熱組(3.85%)和脾虛濕蘊(yùn)組(6.17%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。

2.2 APs糞便SDC2基因甲基化情況

正常對照組和APs組糞便SDC2基因甲基化陽性率分別為14.67%和56.77%，APs組糞便SDC2基因甲基化陽性率明顯高于正常對照組(P<0.001)。

如表3,不同年齡分層、性別、腺瘤數(shù)量、大小和組織學(xué)類型的糞便SDC2基因甲基化陽性率無明顯差異(P>0.05)。高級別上皮內(nèi)瘤變(79.31%)糞便SDC2基因甲基化陽性率高于低級別瘤變(54.45%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 APs不同臨床病理類型的糞便SDC2基因甲基化情況

2.3 APs各證型糞便SDC2基因甲基化情況

如表4，APs中醫(yī)各證型SDC2甲基化陽性率大小依次為濕瘀阻滯組(65.79%)>氣滯血瘀組(64.00%)>大腸濕熱組(51.28%)>脾虛濕蘊(yùn)組(46.91%)。APs證型間糞便SDC2基因甲基化陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較，濕瘀阻滯組和氣滯血瘀組糞便SDC2基因甲基化陽性率均明顯高于脾虛濕蘊(yùn)組(P<0.05)，但同大腸濕熱組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 APs各證型糞便SDC2基因甲基化情況

2.4 APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征

如表5，APs糞便SDC2基因甲基化陽性患者中，各證型在組織學(xué)類型方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在上皮內(nèi)瘤變方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。濕瘀阻滯組高級別上皮內(nèi)瘤變占比高于大腸濕熱組和脾虛濕蘊(yùn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 APs各證型糞便SDC2基因甲基化陽性患者病理特征(例)

2.5 APs中醫(yī)證型與病理類型和糞便SDC2基因甲基化的相關(guān)性分析

如表6，Spearman相關(guān)性分析顯示，大腸濕熱證與組織學(xué)類型、上皮內(nèi)瘤變和糞便SDC2基因甲基化陽性無相關(guān)性(P>0.05)。濕瘀阻滯證與絨毛狀腺瘤和高級別上皮內(nèi)瘤變呈正相關(guān)(P<0.05，P<0.01)，與低級別上皮內(nèi)瘤變呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。脾虛濕蘊(yùn)證與糞便SDC2基因甲基化陽性呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。氣滯血瘀證與管狀腺瘤呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表6 APs中醫(yī)證型與病理類型和糞便SDC2基因甲基化的相關(guān)性分析

3 討論

APs屬中醫(yī)學(xué)之“腸蕈”“便血”和“泄瀉”等范疇。約70%～80%的結(jié)直腸癌由APs通過“正常黏膜—低級別上皮內(nèi)瘤變—高級別上皮內(nèi)瘤變—癌”途徑演變而來，APs患者的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率明顯高于普通人群[11]。由于腺瘤患者的臨床表現(xiàn)錯綜復(fù)雜且缺乏特異性，部分結(jié)直腸癌患者在確診時已屬晚期。目前，由于缺乏微觀層次的認(rèn)識和辨證方法，使得APs的辨證分型紛繁復(fù)雜且與臨床一致性差，因此，尋找可靠且與證候相關(guān)的生物標(biāo)志物成為APs精準(zhǔn)辨證的研究重點。作為表觀遺傳學(xué)的經(jīng)典調(diào)控機(jī)制，DNA甲基化與中醫(yī)證候的形成均受外界環(huán)境和機(jī)體遺傳的共同影響，因此，甲基化的DNA有望成為輔助APs中醫(yī)診斷的生物標(biāo)志物。本研究將病理類型和基因甲基化特點融入APs的中醫(yī)辨證分型，對中西醫(yī)結(jié)合療法在腺瘤的二級預(yù)防和結(jié)直腸癌的一級預(yù)防領(lǐng)域發(fā)揮“未病先防”和“既病防變”的作用具有重要的現(xiàn)實意義。

3.1 APs患者中醫(yī)證型與病理類型具有相關(guān)性

中醫(yī)認(rèn)為APs為本虛標(biāo)實，虛實夾雜的一種疾患?；颊咭蝻嬍巢还?jié)，情志內(nèi)傷或起居不慎，致使脾胃功能減弱，脾胃虛則氣機(jī)受阻，運(yùn)化無力，津液聚而成痰濕，氣虛無力推動血行，遂成瘀血，病情遷延日久則濕濁留戀，血行不利，痰、濕、瘀積聚腸道。組織學(xué)類型和上皮內(nèi)瘤變程度不同，腺瘤的病位深淺和病性虛實亦有差異。本研究中，各證型的組織學(xué)類型分布存在差異，濕瘀阻滯證和氣滯血瘀證中絨毛狀腺瘤占比較高，原因可能是，同管狀腺瘤相比，絨毛狀腺瘤表面黏膜多為分葉狀且易出血。本研究發(fā)現(xiàn)，濕瘀阻滯組中高級別上皮內(nèi)瘤變占比為17.11%，明顯高于脾虛濕盛證和大腸濕熱證。提示，濕瘀阻滯證更易伴有高級別上皮內(nèi)瘤變。原因可能是，上皮內(nèi)瘤變早期多為脾虛濕盛證或大腸濕熱證，患者正氣虧虛不甚，尚能鼓邪外出，但隨著病情遷延和瘤體增長，臟腑功能衰退，衛(wèi)外抗邪功能減弱，正氣無以鼓邪外出，致邪氣積聚日久，氣滯血凝，滋生痰濁，變生積聚，瘤體生長及癌變?yōu)闈耩瞿Y(jié)和癌毒內(nèi)生的結(jié)果。

3.2 甲基化的SDC2基因是APs的重要生物標(biāo)志物

DNA甲基化是指以S—腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，DNA序列中的胞嘧啶堿基共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)。越來越多的研究表明，腸黏膜細(xì)胞DNA序列中CpG 島的 CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化貫穿于“腺瘤—癌序列”的整個過程[5, 12-13]。SDC2基因是轉(zhuǎn)化生長因子B通路的一個關(guān)鍵基因，參與細(xì)胞增殖與遷移和血管生成等多種生物過程，可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和絲裂原活化蛋白激酶途徑促進(jìn)腺瘤的生長、癌變及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，APs患者糞便SDC2基因甲基化陽性率明顯高于正常對照組，提示結(jié)直腸腺瘤與SDC2甲基化相關(guān)。馬曉陽等[14]在大腸癌患者、大腸腺瘤患者和正常人群糞便中發(fā)現(xiàn)SDC2甲基化的陽性率分別為78.1%、57.1%和2.5%。因此，SDC2可作為結(jié)直腸腫瘤的一種新的表觀遺傳標(biāo)志物。

目前普遍認(rèn)為，上皮內(nèi)瘤變程度的加重是APs向癌癥轉(zhuǎn)化的重要步驟[15-16]。在本研究中，在高級別上皮內(nèi)瘤變的SDC2甲基化陽性率為79.31%，明顯高于低級別上皮內(nèi)瘤變(P<0.01)。既往的研究表明，SDC2甲基化在結(jié)直腸癌中的陽性率為90.90%，在高級別上皮內(nèi)瘤變中的陽性率達(dá)到了80.00%，但在正常人群中陽性率極低[17]。這提示，SDC2甲基化程度在正常腸黏膜由低級別上皮內(nèi)瘤變至高級別上皮內(nèi)瘤變這一過程中呈遞增趨勢。但是，在本研究中，管狀絨毛狀腺瘤和絨毛狀腺瘤糞便SDC2基因甲基化陽性率與管狀腺瘤相比，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。提示腺瘤患者糞便SDC2基因甲基化可能與組織學(xué)類型無關(guān)。原因可能是，糞便SDC2基因甲基化是結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的早期事件，其發(fā)生早于組織學(xué)改變，這與馬曉陽等[14]和王小軍等[17]的研究結(jié)果基本一致。

3.3 APs患者中醫(yī)證型與糞便SDC2基因甲基化具有相關(guān)性

中醫(yī)的“證候”反映了機(jī)體的病變部位和病邪性質(zhì)，不僅受年齡、地域環(huán)境及生活習(xí)慣的影響，近年來蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及基因組學(xué)研究表明，基因可以影響癥候的表達(dá)。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊亂，“腺瘤—癌序列”是一個多基因參與的、多階段、多步驟改變并積累的復(fù)雜過程。基因可通過對蛋白質(zhì)的表達(dá)與調(diào)控對癥候表現(xiàn)產(chǎn)生不同的影響，進(jìn)而影響中醫(yī)辨證分型。因此研究基因微觀分子水平的APs中醫(yī)辨證分型特點，可以使我們了解中醫(yī)證型反映疾病的病程階段、病情輕重、預(yù)后等，為辨證分型提供客觀依據(jù)。

本研究中，糞便SDC2基因甲基化陽性率在脾虛濕蘊(yùn)組、大腸濕熱組、氣滯血瘀組和濕瘀阻滯組中分別為46.91%、51.28%、64.00%和65.79%，呈遞增趨勢，濕瘀阻滯組和氣滯血瘀組糞便SDC2甲基化陽性率明顯高于脾虛濕蘊(yùn)證。提示糞便SDC2基因甲基化與“瘀血”有關(guān)。并且，在APs糞便SDC2基因甲基化陽性患者中，濕瘀阻滯組高級別上皮內(nèi)瘤變占比較高，原因可能是，患者長期飲食不節(jié)，情緒不暢，隨著病程進(jìn)展，患者器官機(jī)能衰退，加之伴有多種慢性疾病，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂，脾虛日久則出現(xiàn)肝脾腎俱虛，脾腎陽氣不足，無力運(yùn)化，濕濁更甚，濕濁與瘀血內(nèi)結(jié)，釀生癌毒。

綜上所述，APs中醫(yī)證型與臨床病理類型和糞便SDC2基因甲基化存在相關(guān)性，可為APs的中醫(yī)微觀辨證提供參考依據(jù)。但本研究為單中心研究，且絨毛狀腺瘤和高級別上皮內(nèi)瘤變數(shù)量偏少，樣本的選擇具有局限性，且中醫(yī)證型易受地理環(huán)境和生活方式等因素影響，因此，下一步可擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究。