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    基于Nrf2/ARE信號通路研究姜葉三七揮發(fā)油對氧化低密度脂蛋白誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

    2022-04-07 10:32:36劉新燕王羽尚峰孫建翔王敏慧徐勤
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年4期
    關鍵詞:存活率空白對照內(nèi)皮細胞

    劉新燕 王羽 尚峰 孫建翔 王敏慧 徐勤

    中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。姜科植物大多為多年生草本,具有芳香性,包含很多著名的藥材和香料植物[1]。姜葉三七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib]又名土田七,為姜科植物姜葉三七的干燥塊根,具有活血化瘀、消腫止痛、止血散瘀的功效[2]。姜葉三七揮發(fā)油(Essential oil fromStahlianthusinvolucratusrhizomes, EOSIR)是從姜葉三七干燥塊根中提取制備的一種油狀液滴,主要成分包括單萜類、倍半萜類、酯類和芳香烴類化合物等。本課題組前期研究表明,EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有很好的療效。但目前對于姜葉三七及其主要有效成分揮發(fā)油在治療心血管方面的藥理作用研究在國內(nèi)外未見報道。因此,本實驗將繼續(xù)深入探討其在治療動脈粥樣硬化方面的藥效及其作用機制。

    近年來,核因子E2相關因子2(nuclear factory erythroid-2 related, Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)信號通路一直是研究的焦點,是機體最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激和防御信號通路[3-6]。當機體處于生理狀態(tài)時,細胞內(nèi)的Nrf2被Keap1蛋白結合在細胞質中,使Nrf2處于一種非游離狀態(tài)并且不斷降解的非活性低水平狀態(tài)。當受到親電試劑的刺激或處于氧化應激條件下,細胞內(nèi)的Nrf2解除偶聯(lián)[7],游離出Nrf2在細胞質中積累并轉移進入細胞核與ARE相互結合,激活細胞保護基因,發(fā)揮保護細胞的作用[8-9]。

    本實驗在EOSIR對血管內(nèi)皮功能調控作用的基礎上,提出EOSIR可通過Nrf2/ARE信號通路保護血管內(nèi)皮損傷作用及其機制的假說,應用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導血管內(nèi)皮細胞建立氧化損傷模型,運用流式細胞術及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot, WB)等現(xiàn)代分子生物學技術,探討姜葉三七揮發(fā)油對損傷的血管內(nèi)皮保護作用及其機制,旨在為姜葉三七資源的合理利用和開發(fā)提供一定科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株

    人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自上海奧陸生物科技有限公司。

    1.2 實驗藥物

    氧化低密度脂蛋白(大連美侖生物技術有限公司,批號:MB12474);阿司匹林標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100113-201706);姜葉三七(南寧神能堂保健品科技有限公司,批號:110516),經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定。

    1.3 實驗試劑

    人乳酸脫氫酶試劑盒,批號:A02022;總超氧化物歧化酶測定試劑盒,批號:A00132;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒,批號:A00312;谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測定試劑盒,批號:A00512;一氧化氮(nitric oxide,NO)測定試劑盒,批號:01212;過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒,批號:A00711;以上均購自南京建成生物工程研究所。Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡檢測試劑盒(美國BD公司,批號:556547);活性氧測定試劑盒(碧云天生物技術研究所,批號:S0033S);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1,南京固與生物有限公司,批號:GY22202);Hoecgst33342細胞凋亡染色試劑(碧云天生物技術公司;批號:C1026);Nrf2(批號:12721)NQO1(批號:62262S)HO-1(批號:43966)BAX(批號:5023)BCL-2(批號:3498)兔抗人單克隆抗體,二抗羊抗鼠IgG(批號:7076)羊抗兔IgG(批號:7074);以上均購自Cell signaling公司。

    1.4 實驗儀器

    氣相色譜—質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司,型號:Agilent 6890NGC -5975MS);倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司,型號:IXTIFL);流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司,型號:FACSAria III);Multiskan FC型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientifc);7500Fast Real-Time PCR system(美國ABI公司);GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

    1.5 EOSIR的提取與成分測定

    1.5.1 EOSIR的提取 取姜葉三七干燥塊莖切碎,采用水蒸氣蒸餾法提取,收集得橘黃色揮發(fā)油,出油率為3.78%。

    1.5.2 GC-MS聯(lián)用技術測定EOSIR成分 氣相色譜條件:VF-WAXMS(30 m×250 μm,1.0 μm)。采用程序升溫,初始溫度為50℃,以該溫度保持3分鐘,然后以4℃/min升溫至150℃,保持5分鐘,再以4℃/min升至235℃,保持10分鐘。載氣為高純度氮氣,載氣流量:1.0 mL/min,分流比100∶1。進樣口溫度:200℃。進樣量:0.5 μL。

    質譜條件:EI電離:70 eV;離子源溫度:230℃,四極桿溫度:150℃。傳輸線溫度:230℃;掃描質量范圍m/z:40~550 amu。溶劑延遲:3.0分鐘。圖譜檢索庫為NIST2012年版標準質譜圖庫。

    1.6 ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的建立

    取對數(shù)生長期HUVECs按細胞密度為4×104個/mL接種于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24小時后,加入50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL,繼續(xù)培養(yǎng)24小時或48小時后,采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。根據(jù)細胞存活率選取ox-LDL濃度為200 μg/mL,時間為24小時作為模型組的造模條件。

    1.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的作用

    細胞操作方法同1.6,貼壁培養(yǎng)24小時后分為4組:空白對照組、模型組、EOSIR給藥組、阿司匹林組??瞻讓φ战M不加任何藥物處理,其余每孔加入200 μg/mL的ox-LDL繼續(xù)孵育24小時建立氧化損傷模型;棄掉損傷液,空白對照組和模型組加入完全培養(yǎng)液,其他組加入不同濃度的EOSIR(0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 μg/mL)和阿司匹林(0.05 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24小時,采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。

    1.8 指標檢測

    1.8.1 Hoechst33342染色試驗 取對數(shù)生長期的HUVECs按細胞密度為3×104個/mL接種于24孔板,貼壁培養(yǎng)24小時后,分別用50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,接下來再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,用4%多聚甲醛固定30分鐘,Hoechst 33342染色液室溫避光染色5分鐘,在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.8.2 ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞按2×105個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板,用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,收集細胞培養(yǎng)基和細胞裂解液,采用ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量。實驗重復3次。

    1.8.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,給藥處理后每孔加入500 μL細胞培養(yǎng)液,再加入500 μL 的JC-1染色工作液,充分混勻,在培養(yǎng)箱中孵育20分鐘,1×JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入2 mL細胞培養(yǎng)液,在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.8.4 活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量測定 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,用0.25%胰酶消化細胞,收集到1.5 mL的EP管中;1000 r/min離心5分鐘,將細胞重懸于DCFH-DA中,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘;用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次;用500 μL的PBS重懸細胞,過200目細胞篩,收集于流失管內(nèi),上機檢測。實驗重復3次。

    1.8.5 細胞凋亡的檢測 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后,收集貼壁細胞及漂浮細胞到1.5 mL的EP管中;1000 r/min離心5分鐘,用500 μL的1×Bingding buffer重懸細胞;加入5 μL Annexin-V混勻,再加入5 μL PI混勻;室溫靜置15分鐘,200目濾網(wǎng)過濾細胞,收集于流式管內(nèi),上機檢測。實驗重復3次。

    1.8.6 RT-qPCR檢測目的基因的mRNA表達水平 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后,用Trizol試劑提取總RNA,F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板,根據(jù)SuperReal PreMix Plus試劑盒形成一個20 μL擴增體系,檢測Nrf2、HO1、NQO1、Bcl-2、Bax和GAPDHmRNA的表達。用GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA的相對表達量,并記錄數(shù)據(jù)。實驗重復3次。

    1.8.7 WB法檢測目的基因蛋白表達水平的變化 提取蛋白質樣品后,根據(jù)蛋白質濃度確定樣品體積。用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳,然后恒流轉膜至PVDF膜上;將膜與二抗山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG-HRP在4℃孵育1小時。然后使用發(fā)光液對印跡進行顯影,并使用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行成像。實驗重復3次。

    1.9 數(shù)據(jù)處理

    2 結果

    2.1 EOSIR成分分析

    采用GC-MS技術鑒定EOSIR中揮發(fā)性成分,用面積歸一化法測定百分含量,結果見表1。初步鑒定了54種成分,已鑒定揮發(fā)油成分占總揮發(fā)油含量為98.86%。其中含量最高的是莰烯,占22.38%;其次是α-蒎烯, 占16.11%;居第三位的是D-樟腦,占9.74%;第四位的是3,3,6,6-四甲基-3, 6, 7, 8-四氫化-并茚-1(2H)-酮,占8.41%。

    表1 EOSIR成分分析

    續(xù)表

    2.2 EOSIR對正常的HUVECs的影響

    EOSIR的濃度在小于等于60 μg/mL時,對正常HUVECs細胞的存活率沒有抑制,說明此濃度范圍的EOSIR對細胞沒有毒性。但當濃度大于等于80 μg/mL時,HUVECs細胞的存活率顯著性下降(P<0.01),說明此濃度范圍的EOSIR對細胞有明顯的細胞毒性。見表2。

    表2 不同濃度EOSIR對正常HUVECs細胞存活率的影響

    2.3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

    與空白對照組相比,隨著ox-LDL濃度和時間的增加,HUVECs的存活率明顯下降(P<0.01)。當ox-LDL濃度達到200 μg/mL時,24小時后細胞存活率下降至54.32%(P<0.01),我們選擇細胞的半數(shù)致死量作為造模條件,故以此作為最佳造模條件。見表3。

    表3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

    2.4 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷存活率的影響

    實驗結果提示,ox-LDL能明顯降低HUVECs細胞存活率(P<0.01);但當給藥EOSIR和阿司匹林后,均能顯著提高細胞的OD值和存活率(P<0.05或P<0.01),其中,0.05 μg/mL的EOSIR將ox-LDL處理的HUVECs活力顯著提高(P<0.01),表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的細胞存活率降低。見表4。

    表4 MTT法分析EOSIR與阿司匹林對ox-LDL誘導HUVECs損傷的影響

    根據(jù)實驗結果,接下來的實驗選擇EOSIR低、中、高劑量組分別為0.01、0.05、0.10 μg/mL。

    2.5 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷LDH、MDA、NO、SOD、CAT、GSH-Px含量的影響

    與空白對照組相比,模型組的LDH、MDA含量顯著增加(P<0.05或P<0.01),NO、SOD、CAT和GSH-Px的含量顯著下降(P<0.01)。EOSIR處理的HUVECs中SOD活性顯著增加(P<0.01),MDA含量顯著降低(P<0.01)。其中0.1 μg/mL的EOSIR使CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。0.05 μg/mL的EOSIR使HUVECs中LDH釋放降低(P<0.01),NO含量增加(P<0.01),CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。見表5、表6、表7。

    表5 EOSIR對HUVECs損傷LDH外漏量和MDA含量的影響

    表6 EOSIR對HUVECs損傷NO和SOD含量的影響

    表7 EOSIR對HUVECs損傷CAT和GSH-Px含量的影響

    2.6 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

    空白對照組中的HUVECs顯示出均勻的弱熒光。與空白對照組相比,ox-LDL在HUVECs中誘導了嚴重的功能障礙和細胞凋亡。細胞呈現(xiàn)強烈的藍色熒光,表明廣泛的核損傷和碎裂、細胞質濃縮和細胞體積迅速減少。相比之下,EOSIR和阿司匹林處理后,細胞藍色熒光強度不同程度下降,細胞形態(tài)逐漸恢復正常,核損傷減輕。見圖1。

    圖1 各藥物對ox-LDL損傷的HUVECs保護作用形態(tài)學觀察

    使用Annexin V-FITC/PI標記結合流式細胞術檢測EOSIR對ox-LDL誘導的HUVECs凋亡的影響。正常情況下內(nèi)皮細胞凋亡率約為11.73%,ox-LDL組內(nèi)皮細胞凋亡率較空白對照組為27.93。0.05 μg/mL EOSIR處理后細胞凋亡率顯著下降(P<0.01),表明EOSIR減少了ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡。見表8。

    表8 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡率的影響

    2.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

    與空白對照組相比,200 μg/mL ox-LDL處理24小時使HUVECs內(nèi)ROS顯著增加(P<0.01)。當用0.05 μg/mL的EOSIR處理24小時后,ROS水平顯著降低(P<0.05)。見表9。

    表9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞內(nèi)ROS的影響

    2.8 EOSIR對HUVECs線粒體依賴性細胞凋亡的影響

    空白對照組的MMP維持在正常水平,形成了以紅色熒光為主的JC-1聚合物。Ox-LDL處理HUVECs后,MMP降低并且形成具有增強的綠色熒光和減弱的紅色熒光的JC-1單體。在EOSIR處理的HUVECs中,綠色熒光強度降低,紅色熒光強度增加。此外,ox-LDL顯著降低Bcl-2 mRNA和蛋白質的表達(P<0.01),并增加細胞中Bax mRNA和蛋白質的表達(P<0.01)。這種趨勢在EOSIR治療后被逆轉(P<0.05或P<0.01)。EOSIR通過增加Bcl-2 mRNA和蛋白質以及降低Bax mRNA和蛋白質發(fā)揮抗凋亡作用。見圖2,表10、表11。

    表10 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

    圖2 各藥物對ox-LDL損傷HUVECs線粒體膜電位的影響

    表11 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

    2.9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1和NQO1表達的影響

    與空白對照組相比,ox-LDL導致Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA和蛋白質水平顯著降低(P<0.01)。用不同濃度的EOSIR和阿司匹林處理24小時后,Nrf2、NQO1和HO-1蛋白的表達增強(P<0.05或P<0.01),表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的損傷。見表12、表13。

    表12 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達的影響

    表13 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響

    3 討論

    3.1 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用

    ox-LDL是破壞血管內(nèi)皮細胞抗氧化和分泌活性功能,引起氧化應激、發(fā)生線粒體功能障礙,誘導內(nèi)皮細胞凋亡的主要危險因子,被認為是血管內(nèi)皮細胞損傷的重要危險因素[10-11]。本實驗中采用ox-LDL誘導HUVECs建立氧化損傷模型,然后給藥EOSIR,發(fā)現(xiàn)EOSIR給藥后能抑制ox-LDL誘導的細胞毒性,增加細胞存活率,并且相同濃度下的EOSIR對正常的HUVECs沒有細胞毒性。同時通過Hoechst 33242熒光染色發(fā)現(xiàn)ox-LDL作用HUVECs后出現(xiàn)明顯的細胞損傷形態(tài)學變化,細胞的體積變小,細胞呈濃縮致密的強藍色熒光。經(jīng)過EOSIR處理后細胞數(shù)量明顯增加,細胞藍色熒光強度減弱,細胞體積也恢復正常。表明EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用。

    3.2 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

    CAT和GSH-Px在維持細胞內(nèi)信號對氧化還原調節(jié)以及消除過氧化氫方面起著重要的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),當暴露于ox-LDL時HUVECs細胞脂質過氧化加劇,細胞膜受損,胞漿中的LDH就會迅速釋放到培養(yǎng)基中,同時ROS和MDA的含量顯著增加。相反,NO、SOD、CAT和GSH-Px的活性則顯著下降,這些結果與Geng等[14]的發(fā)現(xiàn)一致。當用EOSIR處理后,HUVECs中MDA的含量降低,NO的分泌增加,SOD、CAT和GSH-Px的含量也增加,并進一步降低了ROS的含量。這表明EOSIR通過清除自由基和增強抗氧化酶的活性來發(fā)揮抗氧化作用。同時,清除循環(huán)中的ROS和提高抗氧酶的活力是防止動脈粥樣硬化的關鍵[15-16]。

    3.3 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

    JC-1染色發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)的HUVECs表現(xiàn)出微弱的綠色熒光,以紅色熒光為主。經(jīng)ox-LDL誘導HUVECs細胞后出現(xiàn)綠色熒光增強、紅色熒光降低的現(xiàn)象,表現(xiàn)出線粒體膜電位的降低,這是線粒體損傷加重的一個重要指標[17-18],與Liu等[19]觀察結果相一致。經(jīng)EOSIR處理后能夠逆轉線粒體膜電位的喪失,表明EOSIR能夠通過恢復線粒體膜電位來減少線粒體功能障礙,防止內(nèi)皮功能障礙。

    另外,課題組發(fā)現(xiàn)ox-LDL能誘導HUVECs細胞凋亡數(shù)目的增加,同時能誘導HUVECs細胞中Bcl-2基因和蛋白表達的減少,以及Bax基因和蛋白表達的增加。當用不同濃度的EOSIR治療后可以逆轉這種變化,表明EOSIR可能通過抑制線粒體功能障礙相關的細胞凋亡信號通路來發(fā)揮保護作用。

    3.4 EOSIR對Nrf2/ARE信號通路的影響

    據(jù)文獻報道,許多植物化學物質可以通過上調Nrf2/ARE的激活來保護心血管的正常功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL作用于HUVECs后,細胞的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白表達顯著降低,用EOSIR處理后可上調游離Nrf2的mRNA和蛋白表達以及其下游靶基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達。表明EOSIR處理上調Nrf2核轉位及其下游靶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮其抗氧化損傷的作用。

    綜合以上實驗結果,EOSIR具有對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的抗氧化和細胞保護作用。EOSIR能夠顯著抑制ox-LDL誘導HUVECs引起的氧化應激,抑制線粒體功能障礙引起的細胞凋亡,同時能夠激活Nrf2以及其下游的抗氧化蛋白酶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用。同時,以阿司匹林標準品作為陽性對照藥[21],能更加可靠地說明EOSIR的療效,以及能清楚地反映EOSIR對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。該結果為EOSIR的藥理作用提供了科學的實驗依據(jù),對豐富中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化方案有現(xiàn)實意義。

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