• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于Nrf2/ARE信號通路研究姜葉三七揮發(fā)油對氧化低密度脂蛋白誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

    2022-04-07 10:32:36劉新燕王羽尚峰孫建翔王敏慧徐勤
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年4期
    關鍵詞:存活率空白對照內(nèi)皮細胞

    劉新燕 王羽 尚峰 孫建翔 王敏慧 徐勤

    中醫(yī)藥在防治心血管疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。姜科植物大多為多年生草本,具有芳香性,包含很多著名的藥材和香料植物[1]。姜葉三七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib]又名土田七,為姜科植物姜葉三七的干燥塊根,具有活血化瘀、消腫止痛、止血散瘀的功效[2]。姜葉三七揮發(fā)油(Essential oil fromStahlianthusinvolucratusrhizomes, EOSIR)是從姜葉三七干燥塊根中提取制備的一種油狀液滴,主要成分包括單萜類、倍半萜類、酯類和芳香烴類化合物等。本課題組前期研究表明,EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有很好的療效。但目前對于姜葉三七及其主要有效成分揮發(fā)油在治療心血管方面的藥理作用研究在國內(nèi)外未見報道。因此,本實驗將繼續(xù)深入探討其在治療動脈粥樣硬化方面的藥效及其作用機制。

    近年來,核因子E2相關因子2(nuclear factory erythroid-2 related, Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)信號通路一直是研究的焦點,是機體最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激和防御信號通路[3-6]。當機體處于生理狀態(tài)時,細胞內(nèi)的Nrf2被Keap1蛋白結合在細胞質中,使Nrf2處于一種非游離狀態(tài)并且不斷降解的非活性低水平狀態(tài)。當受到親電試劑的刺激或處于氧化應激條件下,細胞內(nèi)的Nrf2解除偶聯(lián)[7],游離出Nrf2在細胞質中積累并轉移進入細胞核與ARE相互結合,激活細胞保護基因,發(fā)揮保護細胞的作用[8-9]。

    本實驗在EOSIR對血管內(nèi)皮功能調控作用的基礎上,提出EOSIR可通過Nrf2/ARE信號通路保護血管內(nèi)皮損傷作用及其機制的假說,應用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)誘導血管內(nèi)皮細胞建立氧化損傷模型,運用流式細胞術及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot, WB)等現(xiàn)代分子生物學技術,探討姜葉三七揮發(fā)油對損傷的血管內(nèi)皮保護作用及其機制,旨在為姜葉三七資源的合理利用和開發(fā)提供一定科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株

    人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自上海奧陸生物科技有限公司。

    1.2 實驗藥物

    氧化低密度脂蛋白(大連美侖生物技術有限公司,批號:MB12474);阿司匹林標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100113-201706);姜葉三七(南寧神能堂保健品科技有限公司,批號:110516),經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定。

    1.3 實驗試劑

    人乳酸脫氫酶試劑盒,批號:A02022;總超氧化物歧化酶測定試劑盒,批號:A00132;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒,批號:A00312;谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測定試劑盒,批號:A00512;一氧化氮(nitric oxide,NO)測定試劑盒,批號:01212;過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒,批號:A00711;以上均購自南京建成生物工程研究所。Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡檢測試劑盒(美國BD公司,批號:556547);活性氧測定試劑盒(碧云天生物技術研究所,批號:S0033S);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1,南京固與生物有限公司,批號:GY22202);Hoecgst33342細胞凋亡染色試劑(碧云天生物技術公司;批號:C1026);Nrf2(批號:12721)NQO1(批號:62262S)HO-1(批號:43966)BAX(批號:5023)BCL-2(批號:3498)兔抗人單克隆抗體,二抗羊抗鼠IgG(批號:7076)羊抗兔IgG(批號:7074);以上均購自Cell signaling公司。

    1.4 實驗儀器

    氣相色譜—質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司,型號:Agilent 6890NGC -5975MS);倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司,型號:IXTIFL);流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司,型號:FACSAria III);Multiskan FC型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientifc);7500Fast Real-Time PCR system(美國ABI公司);GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

    1.5 EOSIR的提取與成分測定

    1.5.1 EOSIR的提取 取姜葉三七干燥塊莖切碎,采用水蒸氣蒸餾法提取,收集得橘黃色揮發(fā)油,出油率為3.78%。

    1.5.2 GC-MS聯(lián)用技術測定EOSIR成分 氣相色譜條件:VF-WAXMS(30 m×250 μm,1.0 μm)。采用程序升溫,初始溫度為50℃,以該溫度保持3分鐘,然后以4℃/min升溫至150℃,保持5分鐘,再以4℃/min升至235℃,保持10分鐘。載氣為高純度氮氣,載氣流量:1.0 mL/min,分流比100∶1。進樣口溫度:200℃。進樣量:0.5 μL。

    質譜條件:EI電離:70 eV;離子源溫度:230℃,四極桿溫度:150℃。傳輸線溫度:230℃;掃描質量范圍m/z:40~550 amu。溶劑延遲:3.0分鐘。圖譜檢索庫為NIST2012年版標準質譜圖庫。

    1.6 ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的建立

    取對數(shù)生長期HUVECs按細胞密度為4×104個/mL接種于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24小時后,加入50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL,繼續(xù)培養(yǎng)24小時或48小時后,采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。根據(jù)細胞存活率選取ox-LDL濃度為200 μg/mL,時間為24小時作為模型組的造模條件。

    1.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷模型的作用

    細胞操作方法同1.6,貼壁培養(yǎng)24小時后分為4組:空白對照組、模型組、EOSIR給藥組、阿司匹林組??瞻讓φ战M不加任何藥物處理,其余每孔加入200 μg/mL的ox-LDL繼續(xù)孵育24小時建立氧化損傷模型;棄掉損傷液,空白對照組和模型組加入完全培養(yǎng)液,其他組加入不同濃度的EOSIR(0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 μg/mL)和阿司匹林(0.05 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24小時,采用MTT法檢測細胞存活率。實驗重復3次。

    1.8 指標檢測

    1.8.1 Hoechst33342染色試驗 取對數(shù)生長期的HUVECs按細胞密度為3×104個/mL接種于24孔板,貼壁培養(yǎng)24小時后,分別用50、100、200、300 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,接下來再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,用4%多聚甲醛固定30分鐘,Hoechst 33342染色液室溫避光染色5分鐘,在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.8.2 ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞按2×105個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板,用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,收集細胞培養(yǎng)基和細胞裂解液,采用ELISA法檢測MDA、LDH、SOD、CAT、GSH-Px的含量。實驗重復3次。

    1.8.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位的變化 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,給藥處理后每孔加入500 μL細胞培養(yǎng)液,再加入500 μL 的JC-1染色工作液,充分混勻,在培養(yǎng)箱中孵育20分鐘,1×JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入2 mL細胞培養(yǎng)液,在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.8.4 活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量測定 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時,用0.25%胰酶消化細胞,收集到1.5 mL的EP管中;1000 r/min離心5分鐘,將細胞重懸于DCFH-DA中,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘;用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次;用500 μL的PBS重懸細胞,過200目細胞篩,收集于流失管內(nèi),上機檢測。實驗重復3次。

    1.8.5 細胞凋亡的檢測 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后,收集貼壁細胞及漂浮細胞到1.5 mL的EP管中;1000 r/min離心5分鐘,用500 μL的1×Bingding buffer重懸細胞;加入5 μL Annexin-V混勻,再加入5 μL PI混勻;室溫靜置15分鐘,200目濾網(wǎng)過濾細胞,收集于流式管內(nèi),上機檢測。實驗重復3次。

    1.8.6 RT-qPCR檢測目的基因的mRNA表達水平 HUVECs用200 μg/mL的ox-LDL損傷24小時,再用0.01、0.05、0.10 μg/mL的EOSIR處理24小時后,用Trizol試劑提取總RNA,F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板,根據(jù)SuperReal PreMix Plus試劑盒形成一個20 μL擴增體系,檢測Nrf2、HO1、NQO1、Bcl-2、Bax和GAPDHmRNA的表達。用GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA的相對表達量,并記錄數(shù)據(jù)。實驗重復3次。

    1.8.7 WB法檢測目的基因蛋白表達水平的變化 提取蛋白質樣品后,根據(jù)蛋白質濃度確定樣品體積。用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳,然后恒流轉膜至PVDF膜上;將膜與二抗山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG-HRP在4℃孵育1小時。然后使用發(fā)光液對印跡進行顯影,并使用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行成像。實驗重復3次。

    1.9 數(shù)據(jù)處理

    2 結果

    2.1 EOSIR成分分析

    采用GC-MS技術鑒定EOSIR中揮發(fā)性成分,用面積歸一化法測定百分含量,結果見表1。初步鑒定了54種成分,已鑒定揮發(fā)油成分占總揮發(fā)油含量為98.86%。其中含量最高的是莰烯,占22.38%;其次是α-蒎烯, 占16.11%;居第三位的是D-樟腦,占9.74%;第四位的是3,3,6,6-四甲基-3, 6, 7, 8-四氫化-并茚-1(2H)-酮,占8.41%。

    表1 EOSIR成分分析

    續(xù)表

    2.2 EOSIR對正常的HUVECs的影響

    EOSIR的濃度在小于等于60 μg/mL時,對正常HUVECs細胞的存活率沒有抑制,說明此濃度范圍的EOSIR對細胞沒有毒性。但當濃度大于等于80 μg/mL時,HUVECs細胞的存活率顯著性下降(P<0.01),說明此濃度范圍的EOSIR對細胞有明顯的細胞毒性。見表2。

    表2 不同濃度EOSIR對正常HUVECs細胞存活率的影響

    2.3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

    與空白對照組相比,隨著ox-LDL濃度和時間的增加,HUVECs的存活率明顯下降(P<0.01)。當ox-LDL濃度達到200 μg/mL時,24小時后細胞存活率下降至54.32%(P<0.01),我們選擇細胞的半數(shù)致死量作為造模條件,故以此作為最佳造模條件。見表3。

    表3 ox-LDL誘導HUVECs損傷的量效—時效關系

    2.4 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷存活率的影響

    實驗結果提示,ox-LDL能明顯降低HUVECs細胞存活率(P<0.01);但當給藥EOSIR和阿司匹林后,均能顯著提高細胞的OD值和存活率(P<0.05或P<0.01),其中,0.05 μg/mL的EOSIR將ox-LDL處理的HUVECs活力顯著提高(P<0.01),表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的細胞存活率降低。見表4。

    表4 MTT法分析EOSIR與阿司匹林對ox-LDL誘導HUVECs損傷的影響

    根據(jù)實驗結果,接下來的實驗選擇EOSIR低、中、高劑量組分別為0.01、0.05、0.10 μg/mL。

    2.5 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷LDH、MDA、NO、SOD、CAT、GSH-Px含量的影響

    與空白對照組相比,模型組的LDH、MDA含量顯著增加(P<0.05或P<0.01),NO、SOD、CAT和GSH-Px的含量顯著下降(P<0.01)。EOSIR處理的HUVECs中SOD活性顯著增加(P<0.01),MDA含量顯著降低(P<0.01)。其中0.1 μg/mL的EOSIR使CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。0.05 μg/mL的EOSIR使HUVECs中LDH釋放降低(P<0.01),NO含量增加(P<0.01),CAT和GSH-Px活性增加最明顯(P<0.01)。見表5、表6、表7。

    表5 EOSIR對HUVECs損傷LDH外漏量和MDA含量的影響

    表6 EOSIR對HUVECs損傷NO和SOD含量的影響

    表7 EOSIR對HUVECs損傷CAT和GSH-Px含量的影響

    2.6 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

    空白對照組中的HUVECs顯示出均勻的弱熒光。與空白對照組相比,ox-LDL在HUVECs中誘導了嚴重的功能障礙和細胞凋亡。細胞呈現(xiàn)強烈的藍色熒光,表明廣泛的核損傷和碎裂、細胞質濃縮和細胞體積迅速減少。相比之下,EOSIR和阿司匹林處理后,細胞藍色熒光強度不同程度下降,細胞形態(tài)逐漸恢復正常,核損傷減輕。見圖1。

    圖1 各藥物對ox-LDL損傷的HUVECs保護作用形態(tài)學觀察

    使用Annexin V-FITC/PI標記結合流式細胞術檢測EOSIR對ox-LDL誘導的HUVECs凋亡的影響。正常情況下內(nèi)皮細胞凋亡率約為11.73%,ox-LDL組內(nèi)皮細胞凋亡率較空白對照組為27.93。0.05 μg/mL EOSIR處理后細胞凋亡率顯著下降(P<0.01),表明EOSIR減少了ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡。見表8。

    表8 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡率的影響

    2.7 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

    與空白對照組相比,200 μg/mL ox-LDL處理24小時使HUVECs內(nèi)ROS顯著增加(P<0.01)。當用0.05 μg/mL的EOSIR處理24小時后,ROS水平顯著降低(P<0.05)。見表9。

    表9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞內(nèi)ROS的影響

    2.8 EOSIR對HUVECs線粒體依賴性細胞凋亡的影響

    空白對照組的MMP維持在正常水平,形成了以紅色熒光為主的JC-1聚合物。Ox-LDL處理HUVECs后,MMP降低并且形成具有增強的綠色熒光和減弱的紅色熒光的JC-1單體。在EOSIR處理的HUVECs中,綠色熒光強度降低,紅色熒光強度增加。此外,ox-LDL顯著降低Bcl-2 mRNA和蛋白質的表達(P<0.01),并增加細胞中Bax mRNA和蛋白質的表達(P<0.01)。這種趨勢在EOSIR治療后被逆轉(P<0.05或P<0.01)。EOSIR通過增加Bcl-2 mRNA和蛋白質以及降低Bax mRNA和蛋白質發(fā)揮抗凋亡作用。見圖2,表10、表11。

    表10 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

    圖2 各藥物對ox-LDL損傷HUVECs線粒體膜電位的影響

    表11 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

    2.9 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1和NQO1表達的影響

    與空白對照組相比,ox-LDL導致Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA和蛋白質水平顯著降低(P<0.01)。用不同濃度的EOSIR和阿司匹林處理24小時后,Nrf2、NQO1和HO-1蛋白的表達增強(P<0.05或P<0.01),表明EOSIR能抑制ox-LDL誘導的損傷。見表12、表13。

    表12 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA表達的影響

    表13 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs的Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響

    3 討論

    3.1 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用

    ox-LDL是破壞血管內(nèi)皮細胞抗氧化和分泌活性功能,引起氧化應激、發(fā)生線粒體功能障礙,誘導內(nèi)皮細胞凋亡的主要危險因子,被認為是血管內(nèi)皮細胞損傷的重要危險因素[10-11]。本實驗中采用ox-LDL誘導HUVECs建立氧化損傷模型,然后給藥EOSIR,發(fā)現(xiàn)EOSIR給藥后能抑制ox-LDL誘導的細胞毒性,增加細胞存活率,并且相同濃度下的EOSIR對正常的HUVECs沒有細胞毒性。同時通過Hoechst 33242熒光染色發(fā)現(xiàn)ox-LDL作用HUVECs后出現(xiàn)明顯的細胞損傷形態(tài)學變化,細胞的體積變小,細胞呈濃縮致密的強藍色熒光。經(jīng)過EOSIR處理后細胞數(shù)量明顯增加,細胞藍色熒光強度減弱,細胞體積也恢復正常。表明EOSIR對損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用。

    3.2 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs氧化應激的影響

    CAT和GSH-Px在維持細胞內(nèi)信號對氧化還原調節(jié)以及消除過氧化氫方面起著重要的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),當暴露于ox-LDL時HUVECs細胞脂質過氧化加劇,細胞膜受損,胞漿中的LDH就會迅速釋放到培養(yǎng)基中,同時ROS和MDA的含量顯著增加。相反,NO、SOD、CAT和GSH-Px的活性則顯著下降,這些結果與Geng等[14]的發(fā)現(xiàn)一致。當用EOSIR處理后,HUVECs中MDA的含量降低,NO的分泌增加,SOD、CAT和GSH-Px的含量也增加,并進一步降低了ROS的含量。這表明EOSIR通過清除自由基和增強抗氧化酶的活性來發(fā)揮抗氧化作用。同時,清除循環(huán)中的ROS和提高抗氧酶的活力是防止動脈粥樣硬化的關鍵[15-16]。

    3.3 EOSIR對ox-LDL誘導HUVECs細胞凋亡的影響

    JC-1染色發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)的HUVECs表現(xiàn)出微弱的綠色熒光,以紅色熒光為主。經(jīng)ox-LDL誘導HUVECs細胞后出現(xiàn)綠色熒光增強、紅色熒光降低的現(xiàn)象,表現(xiàn)出線粒體膜電位的降低,這是線粒體損傷加重的一個重要指標[17-18],與Liu等[19]觀察結果相一致。經(jīng)EOSIR處理后能夠逆轉線粒體膜電位的喪失,表明EOSIR能夠通過恢復線粒體膜電位來減少線粒體功能障礙,防止內(nèi)皮功能障礙。

    另外,課題組發(fā)現(xiàn)ox-LDL能誘導HUVECs細胞凋亡數(shù)目的增加,同時能誘導HUVECs細胞中Bcl-2基因和蛋白表達的減少,以及Bax基因和蛋白表達的增加。當用不同濃度的EOSIR治療后可以逆轉這種變化,表明EOSIR可能通過抑制線粒體功能障礙相關的細胞凋亡信號通路來發(fā)揮保護作用。

    3.4 EOSIR對Nrf2/ARE信號通路的影響

    據(jù)文獻報道,許多植物化學物質可以通過上調Nrf2/ARE的激活來保護心血管的正常功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL作用于HUVECs后,細胞的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白表達顯著降低,用EOSIR處理后可上調游離Nrf2的mRNA和蛋白表達以及其下游靶基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達。表明EOSIR處理上調Nrf2核轉位及其下游靶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮其抗氧化損傷的作用。

    綜合以上實驗結果,EOSIR具有對ox-LDL誘導HUVECs細胞損傷的抗氧化和細胞保護作用。EOSIR能夠顯著抑制ox-LDL誘導HUVECs引起的氧化應激,抑制線粒體功能障礙引起的細胞凋亡,同時能夠激活Nrf2以及其下游的抗氧化蛋白酶HO-1、NQO1的表達來發(fā)揮對ox-LDL誘導HUVECs損傷的保護作用。同時,以阿司匹林標準品作為陽性對照藥[21],能更加可靠地說明EOSIR的療效,以及能清楚地反映EOSIR對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。該結果為EOSIR的藥理作用提供了科學的實驗依據(jù),對豐富中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化方案有現(xiàn)實意義。

    猜你喜歡
    存活率空白對照內(nèi)皮細胞
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學中的應用
    損耗率高達30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
    淺議角膜內(nèi)皮細胞檢查
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預計年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    雌激素治療保護去卵巢對血管內(nèi)皮細胞損傷的初步機制
    細胞微泡miRNA對內(nèi)皮細胞的調控
    8 種外源激素對當歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    日韩欧美国产一区二区入口| 黄色女人牲交| 色哟哟·www| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品456在线播放app | av天堂在线播放| 天堂动漫精品| 观看美女的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 又黄又爽又免费观看的视频| 99久久精品国产国产毛片| 观看免费一级毛片| 国产久久久一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 麻豆国产av国片精品| 午夜精品在线福利| 91久久精品国产一区二区成人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国内精品宾馆在线| 俺也久久电影网| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品一区www在线观看 | 亚洲成人免费电影在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 中国美女看黄片| 日韩欧美精品免费久久| 免费观看的影片在线观看| 性色avwww在线观看| 最近在线观看免费完整版| 夜夜夜夜夜久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜影院日韩av| 色哟哟·www| 久久午夜福利片| 中国美女看黄片| 好男人在线观看高清免费视频| 能在线免费观看的黄片| 亚洲成a人片在线一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜久久久久精精品| 日韩一区二区视频免费看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 麻豆成人av在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 日韩一区二区视频免费看| 尾随美女入室| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 日本黄大片高清| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲乱码一区二区免费版| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热只有精品国产| 亚洲国产欧美人成| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费av毛片视频| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产清高在天天线| www日本黄色视频网| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本成人三级电影网站| 婷婷亚洲欧美| netflix在线观看网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 级片在线观看| 日本在线视频免费播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 麻豆成人午夜福利视频| 成人午夜高清在线视频| 色综合站精品国产| 久久中文看片网| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 免费看光身美女| 少妇的逼水好多| 国产欧美日韩精品一区二区| av在线老鸭窝| 亚洲人成网站在线播| 国产单亲对白刺激| 国产淫片久久久久久久久| 国产精品久久久久久av不卡| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线观看一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 悠悠久久av| 在线天堂最新版资源| 国产毛片a区久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 干丝袜人妻中文字幕| bbb黄色大片| 99热这里只有精品一区| av黄色大香蕉| 99久国产av精品| 国产高清三级在线| 亚洲,欧美,日韩| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清视频在线观看网站| 精品乱码久久久久久99久播| 精品久久国产蜜桃| 久久精品综合一区二区三区| 国产成人影院久久av| 最近在线观看免费完整版| 51国产日韩欧美| xxxwww97欧美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 免费看光身美女| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 在线观看舔阴道视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕免费在线视频6| 国产精华一区二区三区| 色播亚洲综合网| 一级毛片久久久久久久久女| 天堂√8在线中文| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日日啪夜夜撸| 身体一侧抽搐| 免费av不卡在线播放| 亚洲最大成人中文| 日韩欧美在线乱码| 国产精品人妻久久久久久| 色综合婷婷激情| 黄色欧美视频在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 久久久色成人| 久久久久九九精品影院| 色播亚洲综合网| 国产精品久久视频播放| 久久久色成人| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产色爽女视频免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲最大成人av| 午夜免费激情av| 亚洲第一电影网av| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 永久网站在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费av不卡在线播放| 波野结衣二区三区在线| 色综合色国产| h日本视频在线播放| 1000部很黄的大片| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av美国av| 欧美日韩乱码在线| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 性色avwww在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本在线视频免费播放| 亚洲无线观看免费| 日韩欧美 国产精品| 在线观看一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精华一区二区三区| 国产精品伦人一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成年女人看的毛片在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品,欧美在线| 中文字幕熟女人妻在线| videossex国产| 99热这里只有是精品在线观看| 天堂网av新在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 五月伊人婷婷丁香| 国产男人的电影天堂91| 日本爱情动作片www.在线观看 | 最近最新免费中文字幕在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜视频国产福利| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲人与动物交配视频| 在线播放国产精品三级| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线播放国产精品三级| 久久久久久久久中文| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲在线自拍视频| 悠悠久久av| 五月玫瑰六月丁香| 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文字幕免费在线视频6| 精品久久久噜噜| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 又爽又黄无遮挡网站| .国产精品久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美性猛交黑人性爽| 69av精品久久久久久| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩欧美精品v在线| 亚洲av美国av| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩欧美在线二视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费看av在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 一区福利在线观看| 久久6这里有精品| 中出人妻视频一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久久久性生活片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产毛片a区久久久久| 日韩欧美精品v在线| 久久精品综合一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美三级亚洲精品| 精品一区二区免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 日韩在线高清观看一区二区三区 | www日本黄色视频网| 国产精品精品国产色婷婷| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲在线观看片| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜福利视频1000在线观看| 老司机福利观看| 老女人水多毛片| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| avwww免费| 一区二区三区四区激情视频 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产高清激情床上av| 人妻少妇偷人精品九色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产亚洲91精品色在线| 51国产日韩欧美| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日本-黄色视频高清免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇的逼水好多| 两个人的视频大全免费| 久久久久久伊人网av| 欧美在线一区亚洲| 国内精品久久久久久久电影| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲av成人av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产色爽女视频免费观看| 欧美区成人在线视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| a在线观看视频网站| 99热这里只有是精品50| 亚洲电影在线观看av| 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久久久久久丰满 | 22中文网久久字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品99久久久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲图色成人| 在线a可以看的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 色av中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩高清综合在线| 欧美高清性xxxxhd video| 黄色日韩在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成年人黄色毛片网站| 99热精品在线国产| 免费看a级黄色片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美3d第一页| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧美清纯卡通| av黄色大香蕉| 免费在线观看影片大全网站| 综合色av麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲欧美激情综合另类| 精品不卡国产一区二区三区| 嫩草影院新地址| 久久久久久久久久久丰满 | 日本与韩国留学比较| 我要搜黄色片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 舔av片在线| 成熟少妇高潮喷水视频| ponron亚洲| 国产黄色小视频在线观看| 老司机福利观看| 亚洲 国产 在线| 韩国av一区二区三区四区| 麻豆久久精品国产亚洲av| eeuss影院久久| 国产精华一区二区三区| netflix在线观看网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 男人的好看免费观看在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 身体一侧抽搐| 乱人视频在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜激情欧美在线| 搞女人的毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 99在线视频只有这里精品首页| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久久久久精品电影| 日本欧美国产在线视频| 欧美日本视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 精华霜和精华液先用哪个| 国产成人影院久久av| 看片在线看免费视频| 午夜福利欧美成人| 色播亚洲综合网| 天堂网av新在线| 亚洲自拍偷在线| 亚洲最大成人手机在线| 91在线观看av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 天堂网av新在线| avwww免费| 简卡轻食公司| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 美女 人体艺术 gogo| av天堂中文字幕网| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 全区人妻精品视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久久久久久丰满 | 免费电影在线观看免费观看| 国产日本99.免费观看| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品嫩草影院av在线观看 | av在线蜜桃| 深夜精品福利| 欧美3d第一页| 在线天堂最新版资源| 嫩草影院精品99| 99久久成人亚洲精品观看| 久久精品人妻少妇| 嫩草影院新地址| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精品久久久久久,| 俺也久久电影网| 国产亚洲精品av在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久久久久久黄片| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品国产高清国产av| 国产高清激情床上av| 99精品久久久久人妻精品| 黄色日韩在线| 久久久久久久午夜电影| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 简卡轻食公司| 成人特级黄色片久久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 在线播放无遮挡| 国产亚洲91精品色在线| 久久精品国产亚洲av天美| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆成人av在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产男靠女视频免费网站| 99久久精品国产国产毛片| 18+在线观看网站| 亚洲国产精品合色在线| 男女边吃奶边做爰视频| 观看免费一级毛片| 搡老岳熟女国产| 午夜激情欧美在线| 亚洲专区国产一区二区| 极品教师在线免费播放| 成人一区二区视频在线观看| 99久久精品热视频| 日本黄色片子视频| 一区二区三区激情视频| 精品久久久久久久久av| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品人妻少妇| 中国美女看黄片| 特级一级黄色大片| 深夜精品福利| 亚洲不卡免费看| 亚洲自拍偷在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av二区三区四区| 最近视频中文字幕2019在线8| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人影院久久av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 韩国av一区二区三区四区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 嫩草影院入口| 欧美+日韩+精品| 嫩草影院精品99| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美日韩黄片免| 99riav亚洲国产免费| 国产毛片a区久久久久| 国产高清有码在线观看视频| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩强制内射视频| 国产在线男女| 色哟哟·www| 国产在线男女| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 中文字幕高清在线视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久中文看片网| 国产综合懂色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 最近最新中文字幕大全电影3| 丰满的人妻完整版| 欧美国产日韩亚洲一区| 一a级毛片在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产乱人视频| 精品一区二区三区视频在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一本精品99久久精品77| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 91麻豆av在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99热6这里只有精品| 日韩欧美 国产精品| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看免费视频日本深夜| 麻豆国产97在线/欧美| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜影院日韩av| 99精品久久久久人妻精品| av福利片在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品久久久久久久久久久久久| 深夜精品福利| 在线播放国产精品三级| 两个人的视频大全免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品一区二区三区人妻视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 免费人成在线观看视频色| 亚洲18禁久久av| 免费人成在线观看视频色| 美女黄网站色视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 亚洲男人的天堂狠狠| 美女免费视频网站| 老司机福利观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 一本一本综合久久| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 一级黄片播放器| 精品人妻偷拍中文字幕| 一级黄片播放器| 人人妻人人澡欧美一区二区| 麻豆国产av国片精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 悠悠久久av| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 99国产极品粉嫩在线观看| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人久久性| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99热6这里只有精品| 午夜福利在线在线| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 又爽又黄无遮挡网站| 久久99热这里只有精品18| 淫妇啪啪啪对白视频| or卡值多少钱| av专区在线播放| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 午夜视频国产福利| 免费大片18禁| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 成年版毛片免费区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成人欧美大片| 丰满乱子伦码专区| av在线亚洲专区| 一夜夜www| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av免费高清在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 韩国av在线不卡| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲欧美精品综合久久99| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品午夜福利在线看| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲七黄色美女视频| 成人国产综合亚洲| 色播亚洲综合网| 欧美三级亚洲精品| 很黄的视频免费| 久久这里只有精品中国| 美女被艹到高潮喷水动态| or卡值多少钱| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日本爱情动作片www.在线观看 | av福利片在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产亚洲91精品色在线| 真人做人爱边吃奶动态| 露出奶头的视频| 成人国产综合亚洲|