R環(huán)的形成及其在疾病中的作用研究進(jìn)展

杜志鵬，楊彥勇，蔡建明，

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué) 海軍醫(yī)學(xué)系艦船輻射醫(yī)學(xué)防護(hù)教研室，上海 200433

DNA復(fù)制是DNA聚合酶采用半保留的方式合成雙鏈DNA（double-stranded DNA, dsDNA）的過程，而基因轉(zhuǎn)錄則是RNA聚合酶利用dsDNA中的一條鏈為模板合成RNA的過程。R環(huán)是當(dāng)RNA鏈侵入dsDNA時(shí)形成的核酸結(jié)構(gòu)。在復(fù)制過程中，DNA會(huì)解開雙螺旋，因5’→3’方向的鏈不能連續(xù)合成新鏈，此時(shí)5’→3’方向的模板鏈上會(huì)出現(xiàn)單鏈DNA（single-stranded DNA, ssDNA），給R環(huán)的形成創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。在細(xì)胞中，R環(huán)還會(huì)阻礙復(fù)制叉的進(jìn)行，影響DNA的正常復(fù)制，進(jìn)而影響基因組的穩(wěn)定性[1]。在DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶解繞DNA并合成5’→3’方向的RNA鏈，這會(huì)在前進(jìn)的RNA聚合酶后面產(chǎn)生負(fù)超螺旋，促進(jìn)R環(huán)的形成。dsDNA R環(huán)的形成和調(diào)控具有復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制，在生物進(jìn)化中產(chǎn)生了多種途徑來減少R環(huán)對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響。本篇綜述圍繞R環(huán)的產(chǎn)生、修復(fù)的影響因素及主要機(jī)制，以及其在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展治療中的作用和應(yīng)用前景進(jìn)行討論。

1 R環(huán)的形成與常用檢測(cè)方法

1.1 R環(huán)的定義 R環(huán)是指在轉(zhuǎn)錄過程中，某些基因轉(zhuǎn)錄mRNA難與模板鏈分離時(shí)，由mRNA取代非模板鏈，形成由互補(bǔ)的DNA模板鏈上的RNA雜合體和非模板鏈上的ssDNA組成的三鏈裸露環(huán)，為非B DNA結(jié)構(gòu)。通常，R環(huán)在伸長(zhǎng)的RNA聚合酶后面形成，偶爾也會(huì)在新生RNA與聚合酶前面的DNA模板雜交，產(chǎn)生前R環(huán)[2]。

1.2 R環(huán)的分類 R環(huán)有兩種類型：生理性和病理性R環(huán)。生理性R環(huán)通常依賴于需要特定因素的程序化過程來保證它們的形成；病理性R環(huán)以非預(yù)定方式意外發(fā)生。

生理性R環(huán)作為特定細(xì)胞過程中的關(guān)鍵中間體自然形成，例如基因表達(dá)調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換重組（immunoglobulin class switch recombination, CSR）、大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制和線粒體DNA復(fù)制等。R環(huán)參與的主要生理學(xué)過程包括：①基因表達(dá)調(diào)控。一些哺乳動(dòng)物基因3’端的R環(huán)可以幫助RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄[3]，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控。②DNA損傷修復(fù)。DNA損傷修復(fù)主要包括同源重組（homologous recombination, HR）以及非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）。R環(huán)會(huì)影響復(fù)制蛋白A（replication protein A, RPA）蛋白的招募，過多或者過少的R環(huán)均會(huì)引起HR修復(fù)的異常[4]。③CSR。在一項(xiàng)理論中，穩(wěn)定的R環(huán)結(jié)構(gòu)為激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）提供了ssDNA底物，以啟動(dòng)CSR過程[5]。AID將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，當(dāng)被堿基切除修復(fù)機(jī)器處理時(shí)會(huì)導(dǎo)致DNA切口。當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)蛋白作用于該DNA缺口時(shí)，會(huì)導(dǎo)致dsDNA斷裂。最后，末端連接DNA修復(fù)導(dǎo)致Ig類轉(zhuǎn)換。見表1。

表1 R環(huán)在不同生物學(xué)過程中起的作用

病理性R環(huán)的形成頻率異于一般R環(huán)的形成頻率，并且可能會(huì)影響基因表達(dá)和基因組的完整性。病理性R環(huán)常見于以下環(huán)節(jié)：①R環(huán)參與復(fù)制叉沖突過程。在基因復(fù)制時(shí)會(huì)形成復(fù)制叉。R環(huán)可能會(huì)在復(fù)制叉沖突期間誘導(dǎo)DNA斷裂造成DNA損傷[6]。②R環(huán)參與DNA錯(cuò)誤切除。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)（transcription-coupled nucleotide excision repair, TC-NER）能去除轉(zhuǎn)錄阻斷、龐大的DNA損傷，TC-NER核酸酶XPG和XPF可以切除阻止轉(zhuǎn)錄的R環(huán)，留下一個(gè)ssDNA缺口，導(dǎo)致DNA斷裂[7]。③R環(huán)參與DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）修復(fù)。持續(xù)存在的R環(huán)會(huì)阻礙DNA修復(fù)因子與DSB的結(jié)合[8]，并導(dǎo)致異常修復(fù)。

研究表明，R環(huán)可能與一些起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物共定位于復(fù)制起點(diǎn)，參與大腸桿菌線粒體的復(fù)制[9]。此外，R環(huán)容易在細(xì)菌DNA中的負(fù)超螺旋或在真核生物中暫時(shí)于RNA聚合酶后面的負(fù)超螺旋處生成。R環(huán)形成時(shí)會(huì)吸收負(fù)超螺旋的能量，從而使DNA纖維恢復(fù)到能量更低的部分或完全松弛狀態(tài)。具有更有利的堿基配對(duì)特性的R環(huán)需要較少的DNA弛豫能量，而在較不利的區(qū)域上形成R環(huán)則需要更強(qiáng)的負(fù)超螺旋，以助其形成和穩(wěn)定[10]。DNA促旋酶具有將負(fù)超螺旋引入DNA的能力，是轉(zhuǎn)錄相關(guān)的超負(fù)超螺旋和R環(huán)形成的主要驅(qū)動(dòng)力[11]。

1.3 R環(huán)的常用檢測(cè)方法

1.3.1 電泳技術(shù)：自1976年R環(huán)被首次描述[12]，研究者們已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)研究真核生物的R環(huán)。在這些技術(shù)中，比較經(jīng)典的就是電泳技術(shù)。R環(huán)結(jié)構(gòu)在瓊脂糖凝膠電泳中遷移的速度較慢，并且在體外轉(zhuǎn)錄后可以用溴化乙錠（EtBr）觀察[5，13]。電泳中的條帶表現(xiàn)出對(duì)RNase A的抗性和對(duì)RNase H1的敏感性，據(jù)此可以利用RNase A提高R環(huán)的濃度。由于EtBr是一種強(qiáng)誘變劑，可致畸和致癌，在后續(xù)的R環(huán)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展成熟后，凝膠電泳檢測(cè)R環(huán)的技術(shù)逐漸被淘汰。

1.3.2 DNA-RNA免疫沉淀技術(shù)

1.3.2.1 DRIP-seq技術(shù)：在1986年，一種強(qiáng)大的全基因組技術(shù)DRIP-seq被報(bào)道用于R環(huán)的檢測(cè)，該技術(shù)使用S9.6抗體沉淀DNA-RNA雜交體，然后進(jìn)行高通量測(cè)序，從而鑒定R環(huán)的結(jié)構(gòu)和序列信息[14]。DRIP-seq在技術(shù)上要求較低，需要的起始原料較少，耗時(shí)較少，卻可提供有關(guān)基因組中R環(huán)分布的有用且可靠的信息，但是它的分辨率有限，并且不提供有關(guān)特異鏈的信息。

1.3.2.2 DRIPc-seq技術(shù)：有研究者在DRIP-seq技術(shù)的基礎(chǔ)上研發(fā)了新的檢測(cè)方法，其中一種是名為DRIPc-seq的技術(shù)，這是一種近堿基對(duì)分辨率和鏈特異性的方法，可在任何細(xì)胞群體中準(zhǔn)確定位R 環(huán)[15]。由于DRIPc-seq信號(hào)絕大多數(shù)是鏈特異性的，因此對(duì)核糖核酸酶H（ribonuclease H, RNase H）預(yù)處理非常敏感，以致于無法在免疫沉淀之前從經(jīng)過RNase H處理的樣品中建立測(cè)序文庫[16]。另外，細(xì)胞中短的R環(huán)序列是不太穩(wěn)定的，而且抗體可能會(huì)以高特異性沉淀結(jié)合更長(zhǎng)的R環(huán)結(jié)構(gòu)域[17]。

1.3.2.3 ssDRIP-seq技術(shù)：ssDRIP-seq技術(shù)是一種基于ssDNA連接的文庫制備技術(shù)，用于R環(huán)的全基因組鑒定。與DRIPc-seq方法相比，它可以區(qū)分特定的DNA鏈，并且ssDRIP-seq需要更少的文庫構(gòu)建步驟。當(dāng)在擬南芥中使用時(shí)，ssDRIP-seq表現(xiàn)出高效率、低偏差和鏈特異性，并且利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了擬南芥中一個(gè)先前未檢測(cè)到的R環(huán)[18]。

1.3.3 其他方法：此外，還有一些方法，例如通過成像和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）方法將R環(huán)可視化[19]。通過檢測(cè)R環(huán)相關(guān)蛋白來研究R環(huán)的方法，如用免疫熒光法檢測(cè)RNA解旋酶DExH-box解旋酶9（DExH-box helicase 9, DHX9）[20]。作為鑒定dsDNA螺旋中擾動(dòng)的方法，亞硫酸氫鹽修飾可用于檢測(cè)R環(huán)[5]。

2 影響R環(huán)形成的因素

細(xì)胞通過3種不同類型的因素保護(hù)基因組免受病理性R環(huán)積累的影響：①阻止R環(huán)形成的因素，在大多數(shù)情況下是RNA結(jié)合和加工因子，以及染色質(zhì)重塑劑；②去除R環(huán)的因素，例如核糖核酸酶和DNA-RNA解旋蛋白；③在修復(fù)或復(fù)制過程中直接或間接幫助去除R環(huán)的DNA修復(fù)因子。

2.1 促進(jìn)R環(huán)形成的因素

2.1.1 促進(jìn)生理性R環(huán)的因子：R環(huán)是調(diào)節(jié)基因組動(dòng)力學(xué)多個(gè)過程所需要的中間體，它參與了基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及其他許多生理過程，因此促進(jìn)生理性R環(huán)的形成對(duì)于細(xì)胞正常的生理活動(dòng)具有十分重要的意義。例如，在基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)中，在CpG島上形成的R環(huán)保護(hù)這些區(qū)域免受DNA甲基化的影響，最終避免了轉(zhuǎn)錄沉默。細(xì)胞中CSR[5]存在也會(huì)促進(jìn)R環(huán)的形成。受刺激的B細(xì)胞中S區(qū)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了R環(huán)的形成，最終促進(jìn)Ig類別轉(zhuǎn)換。在DNA損傷修復(fù)過程中，MRN復(fù)合體（MRE11-RAD50-NBS1）啟動(dòng)的DSB切除可導(dǎo)致斷裂處的瞬時(shí)R環(huán)形成，從而在調(diào)節(jié)HR修復(fù)中發(fā)揮作用[21-22]。低滲脅迫誘導(dǎo)核仁中核糖體基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了R環(huán)的穩(wěn)定形成，從而產(chǎn)生了被RPA包裹的ssDNA片段。這導(dǎo)致募集至核仁的共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)蛋白（aataxiatelangiectasia mutated and Rad 3 related protein, ATR）被激活，最終觸發(fā)DNA損傷修復(fù)[23]。 細(xì)胞中整合的應(yīng)激反應(yīng)（integrated stress response, ISR）會(huì)阻斷組蛋白的合成，促進(jìn)R環(huán)的形成。在ISR環(huán)境中，組蛋白的缺失和R環(huán)的形成共同介導(dǎo)了DNA合成的快速中止，防止?jié)撛诘挠泻NA復(fù)制[1]。細(xì)菌中的應(yīng)激誘導(dǎo)的誘變（stress-induced mutagenesis, SIM）由DSBs/DSEs（double strand breaks or ends）觸發(fā)，涉及使用易錯(cuò)（誘變）聚合酶Pol IV、II和V進(jìn)行復(fù)制。在壓力條件下，一些復(fù)制從R環(huán)開始，在遇到ssDNA切口時(shí)，復(fù)制叉崩潰會(huì)產(chǎn)生DSB，從而促進(jìn)細(xì)菌的SIM，最終幫助細(xì)菌適應(yīng)壓力[24-25]。酵母細(xì)胞中GAL為響應(yīng)環(huán)境變化的基因，通過lncRNA誘導(dǎo)R環(huán)的形成來暫時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活從而快速響應(yīng)環(huán)境變化[26]。

2.1.2 促進(jìn)病理性R環(huán)的因素：能夠增加RNA和DNA接觸機(jī)會(huì)的因素會(huì)促進(jìn)R環(huán)的形成，例如非模板DNA鏈斷裂[27-28]，負(fù)超螺旋（有利于DNA展開）[27，29]，阻礙非模板DNA鏈的非規(guī)范DNA結(jié)構(gòu)（例如G4-四鏈體和三鏈體）[30]，非模板DNA鏈的螯合配體[31]或者空間上游離RNA末端的接近等[32]。在尤文氏肉瘤中，EWS-FLI1蛋白調(diào)節(jié)RNA聚合酶II（RNA polymerase II, RNAPII）延伸并與剪接機(jī)制相互作用促進(jìn)了R環(huán)的形成，阻斷尤文氏肉瘤的乳腺癌基因1（breast cancer 1, BRCA1）修復(fù)，部分介導(dǎo)了尤文氏肉瘤對(duì)化療的敏感性[33]。

2.2 抑制R環(huán)形成的因子 病理性的R環(huán)是危險(xiǎn)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸產(chǎn)生負(fù)面影響并嚴(yán)重?fù)p害基因組完整性，是超突變、超重組、染色體重排或染色體丟失的潛在來源。這種威脅使得細(xì)胞進(jìn)化出不同的因子和機(jī)制來防止共轉(zhuǎn)錄R環(huán)的形成或去除RNA：DNA雜交[34]。

2.2.1 引物酶-聚合酶PrimPol與R環(huán)：PrimPol屬于AEP超級(jí)家族，是一種具有合成DNA引物的獨(dú)特能力，以及能夠繞過某些DNA病變的非過程DNA聚合酶。繞過DNA病變的能力賦予了細(xì)胞DNA損傷耐受性，這對(duì)于存在未修復(fù)DNA損傷的情況下支持持續(xù)的復(fù)制體進(jìn)展至關(guān)重要。無法忍受這種損害會(huì)導(dǎo)致復(fù)制叉長(zhǎng)時(shí)間停滯、崩潰，并最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和（或）細(xì)胞死亡。GAA重復(fù)序列和許多其他引起疾病的串聯(lián)重復(fù)序列可以形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如發(fā)夾、三鏈體（H-DNA）或G-四鏈體（G4）。不參與這些結(jié)構(gòu)形成的DNA鏈暴露為ssDNA。該暴露的ssDNA易于與互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)錄物雜交，從而導(dǎo)致R環(huán)的形成[35]。PrimPol通過發(fā)揮其跨病變合成和引發(fā)酶的作用，繞過DNA損傷下游、G4二級(jí)結(jié)構(gòu)和鏈終止核苷酸類似物等DNA損傷位點(diǎn)[36]，重新啟動(dòng)DNA復(fù)制，防止復(fù)制過程中過量的ssDNA暴露，從而限制了這些序列附近的R環(huán)積累（見圖1）。PrimPol的缺失會(huì)導(dǎo)致人細(xì)胞DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)附近R環(huán)形成的增加，增加了細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定[37]。

圖1 PrimPol預(yù)防R環(huán)的形成

2.2.2 范可尼貧血（Fanconi anemia, FA）相關(guān)蛋白與R環(huán)：FA途徑下有許多蛋白參與調(diào)節(jié)R環(huán)，保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。研究表明，F(xiàn)A途徑下的范可尼貧血組D2蛋白（Fanconi anemia group D2 protein,FANCD2）在R環(huán)形成過程中具有保護(hù)作用[38-39]。R環(huán)的形成促進(jìn)了FANCD2在大型脆弱基因上的積累[39]。 FANCD2能募集RNA處理酶，包括異質(zhì)核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U,hnRNPU）和DEAD-box解旋酶47（DEAD-box helicase 47, DDX47）。hnRNPU是一種RNA結(jié)合蛋白，在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)pre-mRNA剪接、mRNA穩(wěn)定性以及更廣泛的間期染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中起作用。FANCD2可能通過將hnRNPU定位于R環(huán)形成的位點(diǎn)，促進(jìn)巨大的易碎基因基因座上的pre-mRNA剪接[38]。DDX47為DEAD框蛋白家族的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）依賴性RNA解旋酶，可以解開DNA:RNA雜合體破壞R環(huán)[39]（見圖2）。除了FANCD2外，F(xiàn)A途徑的范可尼貧血組D1蛋白（Fanconi anemia group D1 protein,FANCD1）成員乳腺癌基因2（breast cancer 2,BRCA2）也能防止R環(huán)的積累[40]。BRCA2與RNAPII相互作用，以調(diào)節(jié)啟動(dòng)子近端暫停（promoter proximal pause, PPP）位點(diǎn)釋放，同時(shí)募集RNase H2促進(jìn)R環(huán)的去除[22]（見圖2），從而防止病理性的R環(huán)積累[41]。FA途徑下還有一部分因子參與調(diào)控R環(huán)，例如BRCA1通過募集肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)蛋白（senataxin,SETX）解旋酶參與調(diào)控與轉(zhuǎn)錄終止相關(guān)的R環(huán)[42]。最近有研究表明，MRN可以促進(jìn)FA途徑內(nèi)的關(guān)鍵抗R環(huán)蛋白范可尼貧血互補(bǔ)群M（FA complementation group M, FANCM）有效地募集到細(xì)胞中R環(huán)易發(fā)位 點(diǎn)[43]。

圖2 以FANCD2和BRCA2為例的兩種抑制R環(huán)形成的途徑

2.2.3 RNase H與R環(huán)：真核細(xì)胞具有單體H1和異源三聚體H2兩種類型的RNase H酶，它們專門用于消除基因組中的RNA-DNA雜交[44]。RNase H1和RNase H2利用5’→3’核酸外切酶活性從環(huán)中去除RNA。這些酶在原核生物和真核生物中在進(jìn)化上是保守的，并且是消化雜交RNA的唯一已知的RNA特異性核糖核酸酶[45]。多個(gè)研究表明，RNase H可以促進(jìn)R環(huán)的去除[23，46-49]。在許多的研究中利用RNase H酶的特性，通過過表達(dá)RNase H來特異性地去除R環(huán)或者驗(yàn)證R環(huán)的存在[2，16，20，26，32，50]。

還有一些因子與R環(huán)的關(guān)系比較復(fù)雜。DHX9雖然可以促進(jìn)病理性和非病理性R環(huán)的形成[20]，但在一些情況下也會(huì)抑制R環(huán)的形成，例如DHX9促進(jìn)喜樹堿處理的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的R環(huán)抑制，并防止R環(huán)相關(guān)的DNA損傷[51]。此外，MRN與R環(huán)的關(guān)系也存在兩面性[43]。

2.3 R環(huán)與DNA損傷

首先R環(huán)是一種DNA損傷引發(fā)劑，它能在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)誘導(dǎo)DNA損傷。在復(fù)制過程中，復(fù)制叉前形成的R環(huán)可能會(huì)阻礙復(fù)制體的進(jìn)程，從而導(dǎo)致復(fù)制叉的崩潰或斷裂，產(chǎn)生DNA損傷[1，44]。R環(huán)還會(huì)引起轉(zhuǎn)錄-復(fù)制碰撞，從而導(dǎo)致DNA損傷和基因組不穩(wěn)定[52]。其次，R環(huán)可能作為中間體導(dǎo)致了DNA的損 傷，例如G4配體對(duì)DNA的損傷由R環(huán)介導(dǎo)。

R環(huán)對(duì)DNA損傷的影響不僅僅體現(xiàn)在對(duì)DNA的直接損傷上，也可能體現(xiàn)在對(duì)DNA修復(fù)過程的影響。DNA修復(fù)主要有兩個(gè)經(jīng)典途徑HR和NHEJ。R環(huán)對(duì)DNA損傷修復(fù)的一個(gè)主要影響是改變切除的效率，這一步驟決定了修復(fù)由HR還是NHEJ進(jìn)行。在裂變酵母 中，R環(huán)的形成可防止DSB處的過度切除，但在DSB形成后的早期，R環(huán)的去除也是有效的RPA結(jié)合所必需的。敲低RNase H可以穩(wěn)定DSB位點(diǎn)周圍的RNA-DNA雜交體，并嚴(yán)重?fù)p害ssDNA結(jié)合RPA復(fù)合物的募集。相比之下，過表達(dá)RNase H1會(huì)破壞這些雜交體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致過度的鏈切除和RPA募集以及DSB周圍重復(fù)區(qū)域的嚴(yán)重丟失[4]。在輕度復(fù)制壓力下，XPG處理R環(huán)產(chǎn)生的瞬時(shí)DSB導(dǎo)致WS單元中的HR通路下共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasiamutated gene, ATM）信號(hào)激活及其下游細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶（checkpoint kinase, CHK）1的激活[53-54]，促進(jìn)DNA修復(fù)從而保護(hù)基因組的穩(wěn)定性。

3 R環(huán)與疾病

3.1 R環(huán)與非腫瘤性疾病 在人類基因組不穩(wěn)定相關(guān)的多種疾病中發(fā)現(xiàn)了R環(huán)的增加（見表2）。目前有研究表明骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes, MDS）可能既是剪接又是轉(zhuǎn)錄的疾病，其中剪接因子的突變（如U2AF35）誘導(dǎo)的R環(huán)形成，并且形成的R環(huán)與骨髓來源的血液祖細(xì)胞增殖受損有關(guān)，促進(jìn)了MDS的形成[55]。肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等神經(jīng)退行性疾病也與R環(huán)形成有關(guān)，患者細(xì)胞內(nèi)C9ORF72（C9）基因的第一個(gè)內(nèi)含子中富含G的擴(kuò)展序列可以在置換的DNA鏈（G4-DNA）中形成G四聯(lián)體，從而使優(yōu)先在富含G的位點(diǎn)形成的R環(huán)穩(wěn)定，導(dǎo)致C90RF72基因轉(zhuǎn)錄受損；顯性青少年肌萎縮側(cè)索硬化癥 （ALS4）患者的細(xì)胞內(nèi)的SETX基因會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致R環(huán)的減少。ALS4細(xì)胞中的R環(huán)越少，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）的負(fù)調(diào)節(jié)因子BAMBI的表達(dá)就越低，然后引起TGF-β通路的異常激活，這可能導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能障礙和死 亡[56]。Wiskott-Aldrich綜合征（WAS）也與R環(huán)有關(guān)，R環(huán)可能通過影響DNA復(fù)制和（或）修復(fù)而損害基因組完整性，從而導(dǎo)致兒童白血病的發(fā)病率很高[47]。

表2 R環(huán)影響不同疾病的發(fā)生發(fā)展

3.2 R環(huán)與腫瘤 癌基因的激活通常會(huì)啟動(dòng)產(chǎn)生癌癥特征的異常轉(zhuǎn)錄程序。這種轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突（tranion-replication conflict, TRC）的可能性是雙重的：首先，快速增殖和高轉(zhuǎn)錄頻率增加了R環(huán)形成的可能性[57]；其次，特定的DNA復(fù)制時(shí)間，再加上致癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)入，可能導(dǎo)致與新獲得的致癌轉(zhuǎn)錄狀態(tài)發(fā)生沖突，從而促進(jìn)TRC處的R環(huán)[58]。有文獻(xiàn)報(bào)道，R環(huán)基因表達(dá)水平與癌癥患者的存活率相關(guān)（P＜0.05）[59]。

R環(huán)參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。尤因肉瘤與R環(huán)關(guān)系比較密切。在尤因肉瘤中，EWS-FLI1融合蛋白的表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致R環(huán)積累，同時(shí)通過增加RNAPII與BRCA1相互作用而損害HR，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定[33，60]。在乳腺癌的雌激素受體途徑中，發(fā)現(xiàn)R環(huán)在雌激素誘導(dǎo)的基因上積累并驅(qū)動(dòng)DNA損傷[61]。乳腺癌易感性因素BRCA1和BRCA2驅(qū)動(dòng)的通路中的干擾也會(huì)引起R環(huán)驅(qū)動(dòng)的DNA損傷。用致癌性醛處理的細(xì)胞會(huì)降解BRCA2，進(jìn)而積累破壞DNA的R環(huán)[62]。這些R環(huán)直接與小鼠的乳腺腫瘤發(fā)生有關(guān)[63]。R環(huán)的存在與基因的不穩(wěn)定性有著很大關(guān)系。在釀酒酵母菌株中發(fā)現(xiàn)，缺少M(fèi)lp1/2核籃蛋白的細(xì)胞顯示出AID依賴性基因組不穩(wěn)定性和復(fù)制缺陷，這些缺陷被RNase H1過表達(dá)抑制[64]。通過復(fù)制中間體的2-D瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到了同時(shí)缺失RNase H和拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase I, topoI）的酵母細(xì)胞的rDNA基因座中R環(huán)的復(fù)制，并被認(rèn)為有助于復(fù)制數(shù)的變化，這與致癌作用高度相關(guān)[65]。在枯草芽孢桿菌中，復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的正面碰撞可能導(dǎo)致普遍的R環(huán)形成。此類R環(huán)可以阻止復(fù)制，增加誘變作用，并抑制復(fù)制重啟和應(yīng)激生存所需基因的表 達(dá)[66]。受調(diào)控的復(fù)制是R環(huán)影響細(xì)菌的細(xì)胞生理和基因組穩(wěn)定性的另一種主要機(jī)制[24]。

由于R環(huán)是轉(zhuǎn)錄的常見副產(chǎn)物，因此可以利用癌細(xì)胞的R環(huán)耐受性來使某些腫瘤對(duì)化學(xué)治療敏感，從而重新激活癌癥對(duì)R環(huán)結(jié)構(gòu)和內(nèi)源性的反應(yīng)[59]。R環(huán)介導(dǎo)的遺傳損傷（R環(huán)不耐受）可能使腫瘤更容易受到DNA損傷劑和細(xì)胞死亡的影響，這可能會(huì)促進(jìn)涉及細(xì)胞毒性療法和R環(huán)靶向藥物的新型聯(lián)合療法的開發(fā)。在滑膜和尤因肉瘤（SS/ES）中，臨床ATR抑制劑（ATR inhibitor, ATRi）的使用導(dǎo)致R環(huán)的積累并增加了對(duì)化學(xué)療法的敏感性[67]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）抑制劑可增強(qiáng)SS細(xì)胞ATRi的抗腫瘤活性，這表明使用ATRi的聯(lián)合療法有望成為治療肉瘤的新方法[67]。EWS-FLI融合蛋白已顯示可增加R環(huán)形成并失活，從而使尤因肉瘤細(xì)胞系對(duì)遺傳毒性藥物（如依托泊苷、喜樹堿和PARP抑制劑）高度敏感[33]。

4 總結(jié)與展望

自R環(huán)被發(fā)現(xiàn)后，針對(duì)R環(huán)的檢測(cè)技術(shù)更新迭代，從最開始的電泳技術(shù)到后來的免疫沉淀技術(shù)，再到現(xiàn)在在免疫沉淀技術(shù)上發(fā)展的免疫熒光技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，使得我們對(duì)R環(huán)能夠更加精確定位，更全面地檢測(cè)R環(huán)，從而更好地研究R環(huán)的相關(guān)信息。在腫瘤的治療方法上，已經(jīng)開發(fā)了一些與R環(huán)相關(guān)的療法，并且通過聯(lián)合治療而提高療效。在非腫瘤性疾病中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的某些疾病與R環(huán)的形成有關(guān)，未來有望根據(jù)這些位點(diǎn)或者有針對(duì)性地除去這些R環(huán)來治療或者輔助治療這些疾病。雖然病理性R環(huán)與基因組不穩(wěn)定和復(fù)制壓力相關(guān)聯(lián)，癌癥和許多遺傳疾病的特征，以及多種神經(jīng)退行性疾病與R環(huán)積累相關(guān)，但我們?nèi)晕丛赗環(huán)與疾病之間建立因果關(guān)系。因此，需要了解R環(huán)穩(wěn)態(tài)的分子基 礎(chǔ)，以及保護(hù)細(xì)胞不受病理性R環(huán)影響的機(jī)制，以理解R環(huán)作為轉(zhuǎn)錄的隱藏面的作用。由于病理性R環(huán)的存在會(huì)影響復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，所以當(dāng)前針對(duì)抑制R環(huán)形成以及減少R環(huán)對(duì)基因組影響的因子研究比較多，如RNase H酶、FA途徑等，而針對(duì)R環(huán)存在的生理功能研究卻較少。在抑制R環(huán)形成的影響因子中，有許多與DNA修復(fù)途徑有關(guān)，例如FA途徑等，說明細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出不同的因子和機(jī)制來防止共轉(zhuǎn)錄R環(huán)的形成，以利于細(xì)胞的生存。此外，細(xì)胞也進(jìn)化出了與R環(huán)共存或者說利用R環(huán)參與生理過程的功能，例如R環(huán)導(dǎo)致的SIM，在CpG島上形成的R環(huán)保護(hù)這些區(qū)域免受DNA甲基化的影響。雖然我們已經(jīng)探索很多可能影響R環(huán)形成的場(chǎng)景和因素，但是仍然有很多信息不明確，包括：全基因中R環(huán)的分布和存在時(shí)間，R環(huán)在轉(zhuǎn)錄沖突中出現(xiàn)的頻率及其影響程度，細(xì)胞如何識(shí)別生理性R環(huán)與病理性R環(huán)，不同細(xì)胞中R環(huán)形成的頻率是否不同。圍繞這一些問題進(jìn)行研究可以更好地理解R環(huán)在細(xì)胞中的生理和病理學(xué)意義，為研究R環(huán)的影響因素和相關(guān)疾病的關(guān)系找到新的突破口。