類孟買血型FUT1、FUT2基因突變及家系遺傳分析

劉秋菊，蔣賢國(guó)

蒼南縣人民醫(yī)院 輸血科，浙江 溫州 325800

目前國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（International Society of Blood Transfusion, ISBT）命名發(fā)布紅細(xì)胞血型系統(tǒng)已有43個(gè)，除ABO、Rh血型系統(tǒng)外還有一個(gè)重要血型系統(tǒng)-H血型系統(tǒng)，該H抗原受控于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（α-1，2-fucosyltransferase,FUT1）（H）編碼的α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的作用，另一種水溶性H抗原受控于FUT2基因（或Se）編碼的α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的作用，當(dāng)FUT1和或FUT2基因突變時(shí)，導(dǎo)致H抗原的全部或部分缺失，產(chǎn)生孟買型、類孟買型等稀有血型[1-2]。近期我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)了1例類孟買血型，對(duì)其進(jìn)行FUT1、FUT2基因測(cè)序及家系遺傳分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，男，65歲，漢族，2019年12月12日因“泡沫尿多年、血肌酐升高”就診于蒼南縣人民醫(yī)院，12月22日檢測(cè)血型時(shí)發(fā)現(xiàn)血型結(jié)果凝集減弱，經(jīng)先證者及家人簽署知情同意書后，抽取其妻子、女兒靜脈血液進(jìn)行血型血清學(xué)鑒定及基因檢測(cè)。本研究獲蒼南縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑儀器 單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑（批號(hào)20190713）、抗-A1凝集素試劑（批號(hào)20190607）、單克隆抗-H血型定型試劑（批號(hào)20190926）均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；反定型人A、B、O型紅細(xì)胞留取3人份同型供血者血液由本科室制備，當(dāng)天使用；DNA提取液由北京天根生化科技有限公司提供，人類ABO血型基因分型檢測(cè)試劑盒、人類H血型系統(tǒng)基因分型檢測(cè)試劑盒（PCR-SBT法）由江蘇偉禾生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作；電泳儀（EPS300，上海天能科技有限公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)（MICRO17，美國(guó)Thermo公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）、PCR儀（ABI 9700，美國(guó)ABI公司）、DNA測(cè)序儀（ABI 3130，美國(guó)ABI公司），嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 方法

1.3.1 血型血清學(xué)試驗(yàn)：ABO正反定型、H抗原采用試管凝集法，嚴(yán)格根據(jù)試劑說(shuō)明書操作；吸收放散試驗(yàn)、ABH血型物質(zhì)檢測(cè)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。判斷標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞與抗-H血清不凝集者為類孟買型，否則為非類孟買型。

1.3.2 DNA提?。翰捎肈NA提取液對(duì)其進(jìn)行DNA結(jié)合和純化，核酸樣本ODA260/A280：1.6～2.0，采用磁珠法。

1.3.3 ABO基因測(cè)序：嚴(yán)格按人類ABO血型基因分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，根據(jù)Gene Bank提供ABO基因序列信息（NG_006669.1）設(shè)計(jì)ABO基因第1至第7外顯子擴(kuò)增引物，引物同擴(kuò)增測(cè)序引物。對(duì)樣本ABO基因外顯子進(jìn)行E6E7 PCR擴(kuò)增后，采用2.5%瓊脂糖凝膠對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，產(chǎn)物條帶確定后根據(jù)其亮度，進(jìn)行其基因測(cè)序；測(cè)序采用Sanger法。

1.3.4FUT1、FUT2基因測(cè)序：嚴(yán)格按照人類H血型系統(tǒng)基因分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性2 min，93 ℃變性35 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)36次，最后72 ℃延伸10 min，冷卻到4 ℃。采用Sanger法測(cè)序。

1.3.5 結(jié)果判定基因型：采用Chromas Version 2.6.5軟件閱讀測(cè)序圖譜，與ABO*A1.01序列 （GeneBank序列號(hào)NG006669.1）比較確定其突變位點(diǎn)，根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的Names for ABO（ISBT001）blood group alleles v1.1 171023數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合結(jié)果判定其ABO基因型；根據(jù)ISBT提供的Names for H（ISBT 018）Blood Group Alleles文件以綜合結(jié)果判定（以FUT1、FUT2為參考序列）。全部委托江蘇偉禾生物科技有限公司進(jìn)行技術(shù)測(cè)序服務(wù)。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果 先證者正定型A抗原凝集1+、其女兒正定型O型，反定型均為A型，通過吸收放散試驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞上存在A抗原，唾液和凝集抑制試驗(yàn)提示先證者分泌型，A和H物質(zhì)陽(yáng)性，結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果推測(cè)血型為Amh型；其妻子血清學(xué)檢測(cè)為A型，非類孟買型。見表1。

表1 先證者及家系A(chǔ)BO血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 ABO基因測(cè)序 先證者、妻子及女兒基因型均為ABO*A1.02/O.01.02。

2.3FUT1、FUT2基因測(cè)序 先證者及女兒FUT1：c.551-552delAG（見圖1）、FUT2：c.357C＞T、c.385A＞T（見圖2）。

圖1 先證者和女兒FUT1基因測(cè)序結(jié)果（c.551-552delAG）

圖2 先證者和女兒FUT2基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

類孟買血型是一種罕見紅細(xì)胞表型，發(fā)生率低，紅細(xì)胞上缺乏H抗原。文獻(xiàn)報(bào)道其既具有明顯遺傳異質(zhì)性，又有一定的分布區(qū)域性，在日本、泰國(guó)及中國(guó)的臺(tái)灣、福建、香港、北京、云南拉祜族人群的頻率分別為1～2/300 000、1/5 000、1/8 000、1/8 500、1/15 620、1/102萬(wàn)、2.2%[1，3]。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，孟買、類孟買血型抗原合成、分泌以及表達(dá)等機(jī)制逐步深入[2，4-5]。H抗原缺失的分子研究基礎(chǔ)由FUT1基因突變引起[6-8]。根據(jù)dbRBCBGMT發(fā)布的數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，目前已發(fā)現(xiàn)60多種FUT1基因，基因異常包含缺失、插入突變和錯(cuò)義突變等，且大部分都是錯(cuò)義突變。

KELLY等[10]在1994年第一次報(bào)道孟買、類孟買血型的分子機(jī)制。據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)道[1]，與紅細(xì)胞H抗原缺陷相關(guān)FUT1最常見變異為FUT1*01N.06（c.551_552delAG）、FUT1*01N.13（c.881_882delTT）和FUT1*01W.09（c.658C＞T）；FUT2等位基因以FUT2*01和FUT2*09基因存在，以c.357C＞T與c.716 G＞A變異；類孟買血型基因缺陷FUT1基因和正常或表達(dá)弱FUT2基因，其H抗原強(qiáng)弱決定變異型α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性強(qiáng)弱，反應(yīng)其紅細(xì)胞（或不）與抗A抗B抗體發(fā)生凝集現(xiàn)象，或其通過吸收放散試驗(yàn)檢測(cè)出A或B抗原，但也有報(bào)道不能檢出[11]。國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道類孟買血型最常見單體型為547-552delAG，其導(dǎo)致的移碼變異引起氨基酸多肽鏈提前終止在268位，最終使α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶失去活性不能合成H抗原。本例先證者血清學(xué)發(fā)現(xiàn)血型結(jié)果凝集減弱，H抗原陰性，紅細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)檢出A抗原，ABO基因分型A02，通過基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)FUT1c.551-552delAG，導(dǎo)致p.Glu184Valfs*85突變，F(xiàn)UT2c.357C＞和c.385A＞T突變，該突變?cè)趨⒖紨?shù)據(jù)庫(kù)中雖尚未公布，但文獻(xiàn)中偶有報(bào)道含c.357C＞T、c.385A＞T位點(diǎn)個(gè)體為分泌型。本研究的基因分型與血清學(xué)兩者結(jié)果相互驗(yàn)證確認(rèn)先證者為類孟買血型，其妻子為正常的O型，女兒血型同先證者，根據(jù)家系分析先證者的血型及基因突變遺傳給其女兒。

類孟買血型確認(rèn)目前主要依據(jù)血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，其血清學(xué)特點(diǎn)：紅細(xì)胞上有弱A、B抗原，可通過吸收放散實(shí)驗(yàn)檢出，與抗-H試劑不凝集反應(yīng)，部分有抗-H、抗-HI或兩者皆有的抗體。為防止類孟買血型漏檢，在平常疑難血型鑒定中可增加抗-H血型試劑使用，輸血首選自體輸血或同型輸血，如無(wú)血源，切實(shí)考慮抗-A、抗-B和抗-HI是否存在，可選擇37 ℃與供血者無(wú)反應(yīng)的ABO同型紅細(xì)胞輸注，最大限度減少溶血存在的風(fēng)險(xiǎn)，如緊急搶救沒有同型血液需要輸注O型懸浮紅細(xì)胞時(shí)，采用鹽水法和抗人球蛋白法配血均相合血液，以防止抗-H引起輸血反應(yīng)[14]。先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)有助于幫助類孟買型患者準(zhǔn)確鑒定血型，能夠佐證補(bǔ)充血清學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，家系成員結(jié)果分析對(duì)該類患者遺傳機(jī)制及后續(xù)精準(zhǔn)輸血具有重要的臨床意義[15]。