原發(fā)性EB病毒感染患兒AIM2炎癥小體通路的表達及與肝損傷的相關性

金龍騰，孫妍，黃基紅，溫正旺，石海礬，陳益平

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童感染科，浙江 溫州 325000

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是非嗜肝病毒感染引起肝損傷的常見病原體，原發(fā)性EBV感染患者中有70%～90%合并有肝損害[1]，而EBV感染導致肝損傷的機制較為復雜，其中免疫炎癥反應起著重要作用[2]。固有免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線。黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2, AIM2）是細胞質(zhì)雙鏈DNA（double stranded DNA, dsDNA）感應蛋白，可識別外來病原菌或者自身細胞質(zhì)內(nèi)異常存在的DNA，并觸發(fā)炎癥體級聯(lián)反應的激活，導致炎性細胞因子[白細胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18）]的成熟釋放，發(fā)揮促炎作用[3]。AIM2炎癥小體通路是否參與EB病毒感染導致肝損傷目前尚不明確。本研究擬分析原發(fā)性EBV感染患兒外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PMSCs）AIM2炎癥小體通路的表達變化，探討AIM2炎癥小體與肝損傷的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2020年1月至2021年6月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院住院治療的原發(fā)性EBV感染患兒82例為原發(fā)感染組，男42例，女40例，年齡（5.2±2.0）歲。參照兒童EB病毒感染相關疾病的診斷和治療原則專家共識（2021版）[4]，入院時EB-VCA-IgM和血清EBV-DNA檢測均陽性，按有無肝損傷分為肝功能異常組（52例）與肝功能正常組（30例），排除標準：①EBV以外的細菌、病毒、支原體、衣原體感染者；②除EBV感染外患其他原發(fā)性或繼發(fā)性致肝損傷患兒；③近期服用肝損傷藥物者；④惡性腫瘤性疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及近期使用免疫抑制劑的患兒；⑤嚴重心、肝、腎及其他臟器功能異?；純?。同期選取門診體檢EBV-IgG陽性（EB-VCA-IgG、EB-NA-IgG）而EB-VCA-IgM陰性的50例健康兒童為既往感染組，男25例，女25例，年齡（4.7±2.0）歲。門診體檢EBVIgG和EBV-VCA-IgM均陰性的50例健康兒童為對照組，男27例，女23例，年齡（4.6±1.9）歲。3組研究對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。原發(fā)性EBV感染肝功能異常的患兒在住院1周后復查肝功能，38例肝功能恢復正常，14例肝功能好轉(zhuǎn)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準（編號：2021-K-125-01），所有研究對象監(jiān)護人知情同意。

1.2 標本采集、處理 原發(fā)性EBV感染患兒于入院次日、既往EBV感染組及對照組于體檢當日抽取空腹靜脈血，EDTA抗凝管2 mL用以分離PBMCs。抗凝管取血清，加入等體積PBS混勻，再加入等體積人淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），1 500 r/min 離心20 min后出現(xiàn)分層，留取單個核細胞層，加入5倍體積PBS洗滌后離心留取沉淀，保存于-80 ℃冰箱。促凝劑管3 mL，3 500 r/min離心20 min分離血清，-80 ℃凍存。

1.3 AIM2、ASC和caspase-1的mRNA檢測 按TRIzol總RNA提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）說明提取PBMCs總RNA，使用紫外分光光度計測量總RNA純度和濃度。采用實時熒光定量PCR檢測AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達，引物序列見表1。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃，5 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，共40個循環(huán)，每個樣品設3個平行復孔。使用2-ΔΔCt計算AIM2、ASC和caspase-1的mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列（5’-3’）

1.4 IL-1β、IL-18蛋白及其他生化指標的檢測 采用ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-18蛋白水平，試劑盒均購自上海研域化學試劑公司。其他常規(guī)檢測，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase,AST）、EBV抗體、血清EBV-DNA檢測（檢測下限是5.0×102拷貝/mL），由我院檢驗科完成。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計量資料采用±s表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗；相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達及IL-1β、IL-18水平 原發(fā)感染組患兒外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA的表達量及IL-1β、IL-18水平均高于既往感染組和對照組（P＜0.05），既往感染組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 原發(fā)感染組與既往感染組AIM2炎癥小體mRNA相對表達量和IL-1β、IL-18水平

2.2 肝功能異常組與肝功能正常組患兒AIM2、ASC和caspase-1表達及IL-1β、IL-18水平 原發(fā)感染組中，肝功能異常組、肝功能正常組患兒AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達量及IL-1β、IL-18水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝功能異常組相較肝功能正常組更高（P＜0.05），見圖2。

圖2 肝功能異常組與肝功能正常組AIM2炎癥小體mRNA相對表達量和IL-1β、IL-18水平

2.3 原發(fā)感染組患兒AIM2 mRNA表達與ASC、 caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18水平的相關性 Pearson相關分析顯示，原發(fā)性EBV感染患兒AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1 mRNA表達以及IL-1β、IL-18水平均呈正相關（r=0.718、0.729、0.548、0.529，P＜0.05），見圖3。

圖3 原發(fā)感染組患兒AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18的相關性

2.4 原發(fā)感染組患兒血清EBV-DNA載量與AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表達和IL-1β、IL-18水平相關性 Pearson相關性分析顯示，原發(fā)感染組EBV-DNA載量與AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18水平均呈正相關（r=0.712、0.494、0.479、0.384、0.300，P＜0.05），見圖4。

3 討論

EBV是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒，可出現(xiàn)全身多個系統(tǒng)受累，其中肝損傷是原發(fā)性EBV感染最常見的并發(fā)癥，但EBV導致肝損傷的發(fā)病機制目前尚不明確。目前的研究發(fā)現(xiàn)EBV只在肝臟的淋巴細胞核中檢測到，EBV沒有直接侵犯肝細胞、膽道上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞，其對肝臟的損傷可能是EBV感染后淋巴細胞浸潤和炎癥因子導致的免疫損 傷[2，5]。

炎癥小體是一種存在細胞胞漿中的蛋白聚合物，主要由模式識別受體（pattern recognition receptor, PRRs）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein, ASC）以及 caspase-1前體組成。炎癥小體的激活可誘導多種細胞因子的產(chǎn)生，在固有免疫中發(fā)揮重要作用[3]。2002年首次提出AIM2炎癥小體，主要由AIM2、ASC以及pro-caspase-1組成，AIM2通過識別入侵機體的病原體的dsDNA組裝成炎癥小體，激活caspase-1介導細胞焦亡以及IL-1β、IL-18的成熟和釋放，參與機體抗感染免疫反應[6-7]。通過體外細胞感染模型發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌、單核李斯特菌、肺炎鏈球菌、乙型肝炎病毒、鼠巨細胞病毒等病原體感染可激活AIM2炎癥小體[7]。最近有研究發(fā)現(xiàn)EBV感染可誘導人單核細胞中AIM2炎癥小體的激活及caspase-1依賴性IL-1β分泌[8]，但AIM2炎癥小體與EBV感染導致的肝損傷是否存在相關性，目前尚未見報道。本研究顯示，原發(fā)性EBV感染患兒外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達量均顯著高于既往感染組及對照組，并且AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達水平及IL-1β、IL-18水平與EBV DNA載量有正相關性，提示AIM2炎癥小體通路可能參與了原發(fā)EBV感染過程。

炎性小體激活炎性細胞因子的產(chǎn)生和細胞焦亡對肝臟具有重要的生物學效應。目前發(fā)現(xiàn)炎癥小體參與非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等肝臟疾病的發(fā)病機制[9]。HAN等[10]比較慢性乙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis B, CHB）與慢性丙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis C, CHC）患者活檢肝臟組織，發(fā)現(xiàn)CHB患者AIM2的表達顯著高于CHC，并且在HBV高載量組（HBV-DNA≥1×105拷貝/mL）中AIM2的表達高于HBV低載量組（HBV-DNA＜1×105拷貝/mL）。AIM2水平與CHB患者中caspase-1、IL-1β和IL-18的表達呈正相關，提示AIM2表達與CHB相關的炎癥反應相關。既往研究發(fā)現(xiàn)EBV感染引起肝損傷患兒體內(nèi)免疫功能紊亂比肝功能正常組患兒更為明顯[11]。本研究顯示，原發(fā)性EBV感染患兒中，肝功能異常組AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達量及IL-1β、IL-18水平高于肝功能正常組，且AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1的mRNA表達以及IL-1β、IL-18水平均呈正相關，這表明EBV-DNA與AIM2炎癥小體結(jié)合后可能導致caspase-1的活化，并進一步促進IL-1β、IL-18的分泌，從而在EBV肝炎中發(fā)揮作用。

綜上所述，原發(fā)EBV感染患兒AIM2炎癥小體通路的表達發(fā)生改變，并且與EBV感染所致肝損傷存在相關性，這為EBV感染致肝損傷的治療提供了新的研究參考。