脂肪和肥胖相關基因通過TLR2/p38信號通路促進異位子宮內膜間質細胞纖維化

王焓，段萍

1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦科，黑龍江 哈爾濱 150000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325000

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是病因未明且難以根治的慢性炎癥性疾病[1]，大約有10%的育齡期女性受其影響[2]，對婦女的生活質量產生重大影響，表現(xiàn)為痛經、不孕和慢性盆腔疼痛等[3]。目前主流學說仍為Sampson學說，但月經逆行的發(fā)生率和EMs的發(fā)病率存在顯著不符[4]，表明存在其他病因影響EMs的發(fā)病。因此，探索EMs的發(fā)病機制備受關注。

纖維化是指纖維結締組織在炎癥發(fā)生或受損組織內及其周圍過度積聚[5]，是大多數(shù)慢性炎癥性疾病的一個病理特征，可以影響任何器官，輕則導致器官形成永久性瘢痕，重則導致器官功能失調和衰竭[6]。有研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾水平的改變可影響細胞纖維化的能力[7-8]，但目前m6A修飾對EMs纖維化的影響還未見報道。本研究旨在探討m6A去甲基化酶脂肪質量和肥胖相關（fat and obesityassociated，F(xiàn)TO）基因對異位子宮內膜間質細胞（ectopic endometrial stromal cells, eESCs）纖維化的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析 利用m6A2 Target數(shù)據(jù)庫（http://m6a2target.canceromics.org/）預測可能與FTO具有靶向關系的含m6A結合位點的蛋白質。

1.2 原代細胞培養(yǎng) 收集子宮肌瘤患者的在位內膜組織與卵巢子宮內膜異位瘤或深度浸潤性EMs患者的異位病變，并切成1 mm3的碎片，隨后與4%的IV型膠原酶（C5138，Sigma，美國）混勻，于37 ℃的恒溫水浴中消化45～60 min。消化后的組織經充分過濾后獲得細胞懸液。于1 200×g，5 min離心細胞懸液，棄去上清液，用DMEM洗滌，重復3次。最終剩余的細胞重懸于含有15%胎牛血清（FBS，以色列）的DMEM中，并在37 ℃和5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至70%時，用胰蛋白酶EDTA（0.25%，Gibco，美國）消化、傳代培養(yǎng)。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime PCR，qRT-PCR） 用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA后，用反轉錄試劑盒（TOYOBO，上海）進行反轉錄獲得cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO，上海）在qRT-PCR系統(tǒng)上進行qRT-PCR。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR實驗中所用引物序列

1.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞并提取蛋白，轉移至PVDF膜上，使用15%的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，分別加入FTO抗體（27226-1-AP，1:1 000）、COL-1抗體（14695-1-AP，1:1 000）、SMA抗體（14395-1-AP，1:1 000）、CTGF抗體（23936-1-AP，1:1 000）、FN抗體（15613-1-AP，1:1 000）、TLR2抗體（17236-1-AP，1:1 000）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38）抗體（14064-1-AP，1:1 000）、磷酸-p38絲裂原活化蛋白激酶（phospho-p38 mitogen-activated protein kinases, p-p38）抗體（28796-1-AP，1:1 000）在4 ℃孵育過夜（抗體均購自武漢Proteintech公司），室溫用對應的二抗孵育2 h，蛋白質條帶通過增強化學發(fā)光（ECL）溶液進行可視化。用ImageJ軟件對蛋白表達進行量化。

1.5 M6A修飾的定量檢測 采用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒（P-9005，EpiGentek，美國）測定RNA中總體m6A水平的變化。每個樣品分析的RNA均為200 ng，將RNA包被在檢測孔上。根據(jù)說明書，在孔內加入相應的緩沖液。最后在450 nm處檢測吸光度，根據(jù)標準曲線計算m6A水平。

1.6 慢病毒轉染 在HEK293T細胞中制備慢病毒，收集上清液用于eESCs的轉染。當細胞融合密度達到50%～60%時，去除eESCs的原始培養(yǎng)基，加入慢病毒上清液與相同體積的完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)，感染復數(shù)為120，同時加入聚丁烯（8 μg/mL）。轉染48 h后，嘌呤霉素（4 μg/mL）篩選轉染細胞并維持72 h。

為抑制TLR2的表達，從Ribo-Bio獲得針對TLR2和陰性對照（si-NC）的siRNA。siRNA轉染按說明書（賽默飛，美國）進行。siRNA的靶序列為：si-TLR2 5’-GCTTCGATGTGGTTTG-3’。

1.7 EdU實驗 用EdU試劑盒（C0071S，碧云天，上海）測定細胞增殖。細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓 24 h后進行檢測。所有實驗均重復3次。

1.8 MeRIP-qPCR 通過離心柱提取完整的總RNA，通過polyATtract mRNA分離體系進一步純化mRNA。使用Magna MeRIP m6A試劑盒（17-10499，Millipore，美國）進行m6A RNA免疫沉淀。

1.9 RNA穩(wěn)定性檢測 用5 μg/mL放線菌素D（HY-17559，MCE，上海）處理細胞，抑制總體mRNA轉錄。在指定時間點（0、3、6 h）培養(yǎng)后，收集細胞，提取RNA樣本進行反轉錄。qRT-PCR檢測TLR2 mRNA轉錄水平。

1.10 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FTO在EMs中低表達 qRT-PCR顯示，m6A甲基化酶Mettl3明顯高表達，而m6A去甲基化酶FTO在EMs病變中的表達明顯低于正常子宮內膜組織（P＜0.01），見圖1A。原代細胞培養(yǎng)結果顯示，與正常子宮內膜間質細胞（nESCs）相比，eESCs中的FTO表達顯著降低，m6A水平顯著增高（均P＜0.01），見圖1B、圖1C、圖1D、圖1E。

圖1 FTO在EMs中低表達

2.2 FTO過表達促進eESCs纖維化并抑制其增殖 為探究FTO過表達對eESCs的影響，我們用慢病毒介導的FTO過表達載體（LV-FTO）和空載體（EV）轉染eESCs。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉染LV-FTO后的eESCs形態(tài)上變得更加細長（見圖2A）。qRT-PCR顯示，與nESCs相比，eESCs中COL-1、SMA、CTGF、FN mRNA明顯高表達（P＜0.01），見圖2B。Western blot結果也證實了這一結論（見圖2C）。EdU檢測結果顯示，F(xiàn)TO過表達抑制了eESCs增殖（見圖2D）。

圖2 FTO過表達促進eESCs纖維化并抑制其增殖

2.3 FTO通過介導TLR2的m6A修飾影響eESCs纖維化 生物信息學分析顯示，TLR2可能是FTO的潛在下游靶點（見圖3A）。因此，我們探究了FTO是否通過m6A RNA去甲基化的方式來影響TLR2的表達。與空載體相比，F(xiàn)TO的過表達提高了TLR2的蛋白水平（見圖3B），而對TLR2的mRNA水平幾乎沒有影響（見圖3C）。MeRIP-qPCR結果顯示，F(xiàn)TO過表達明顯降低了TLR2的mRNA轉錄物上的m6A水平（P＜0.01），見圖3D。RNA穩(wěn)定性檢測也證實，F(xiàn)TO過表達延長了TLR2 mRNA的半衰期，提高了TLR2的穩(wěn)定性（P＜0.01），見圖3E、圖3F。qRT-PCR結果顯示，TLR2敲除顯著降低了FTO過表達對纖維化的影響（見圖3G）。

圖3 FTO通過介導TLR2的m6A修飾影響eESCs纖維化

2.4 TLR2通過抑制p38促進eESCs纖維化 Western blot結果顯示，TLR2敲除后p38的磷酸化水平顯著增強（P＜0.05），見圖4A、圖4B。在TLR2過表達的基礎上，我們通過p38的激活劑（dehydroaluminum chloride, DHC）增強p38水平。定量RT-PCR結果顯示，DHC成功抵消TLR2促進eESCs纖維化的作用（P＜ 0.01），見圖4C。Western blot結果也得到一致結論（見圖4D）。

圖4 TLR2通過抑制p38促進eESCs纖維化

3 討論

EMs的經典定義是指子宮外異常位置存在子宮內膜樣組織。雖然慢性炎癥是EMs公認的特征，但該疾病的確切病因仍不明確。

既往研究發(fā)現(xiàn)細胞的纖維化水平影響細胞增殖和遷移能力[5]，然而在EMs中纖維化機制探究尚未見報道，所以本研究中定位于EMs纖維化的機制探索。

m6A修飾是真核生物中mRNA最豐富的修飾，影響mRNA代謝的各個層面[9]。據(jù)報道METTL3敲低可促進eESCs的遷移和侵襲，抑制Mettl3/m6A/miR126途徑可能通過增強細胞遷移和侵襲來促進EMs的發(fā)展[10]。然而有關m6A修飾與EMs纖維化的關系還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)在EMs中FTO處于低表達狀態(tài)，過表達FTO可以通過TLR2/p38信號通路促進eESCs纖維化并抑制細胞增殖。通過檢測纖維化標志物COL-1、SMA、CTGF和FN的表達水平，發(fā)現(xiàn)在eESCs中提高FTO的表達，在體外具有促進eESCs纖維化的作用。

Toll樣受體（TLRs）是屬于先天免疫的模式識別受體，可識別和防御入侵的微生物[11]。研究發(fā) 現(xiàn)，TLR2可誘導促炎細胞因子的產生，促進組織纖維化[12]，同時有研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因啟動子低甲基化與根尖周圍炎癥中促炎細胞因子和血管生成標志物的轉錄活性有關[13]。本研究通過m6A2 Target數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)TLR2存在FTO發(fā)生m6A修飾的位點。進一步實驗表明，F(xiàn)TO過表達促進TLR2的蛋白表達，但不影響其mRNA水平。MeRIP-qPCR實驗證實在eESCs中FTO可通過m6A修飾的方式提高TLR2轉錄本水平，RNA穩(wěn)定性實驗結果也顯示，F(xiàn)TO的過表達延長TLR2半衰期從而提高其穩(wěn)定性。此外，在本研究中，我們證實下調TLR2可以顯著逆轉FTO對eESCs纖維化的影響，磷酸化的p38顯著增強。進一步體外實驗證實，p38激活劑可顯著減低eESCs纖維化標志物的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EMs中FTO呈低表達狀態(tài)，過表達FTO可以促進eESCs的纖維化并抑制細胞增殖，而且這種作用與TLR2/p38信號通路相關。