麻黃附子細(xì)辛湯對(duì)陽(yáng)虛型非小細(xì)胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響*

李亮 陳昱丞 王強(qiáng) 周潔

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典病房，天津 300000；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300000)

據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)道，肺癌是全球癌癥死亡的首要原因。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病理分型的80%左右。據(jù)中國(guó)腫瘤登記中心的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肺癌為中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率及病死率首位。肺癌已成為威脅公眾生命健康安全的嚴(yán)重疾病之一[1]，且大部分肺癌患者確診已屬中晚期，甚至已喪失手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，同時(shí)患者難以耐受現(xiàn)代醫(yī)學(xué)放化療帶來(lái)的不良反應(yīng)，因此，采取多學(xué)科綜合治療的模式，積極研究中醫(yī)藥治療手段，以期最大程度的控制腫瘤進(jìn)展、改善患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間已成為腫瘤治療發(fā)展的趨勢(shì)。探尋非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生、演變規(guī)律以及新的治療手段對(duì)提高療效至關(guān)重要。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinasePI3K)/蛋白激酶B(proteinki-naseBPKB，又稱Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mam-malian target of rapamycin，MTOR)(PI3K/Akt/mTOR)通路在正常細(xì)胞生理?xiàng)l件中，以及病理情況下腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移中均是中樞調(diào)節(jié)因子。該途徑包含3個(gè)主要驅(qū)動(dòng)因子：PI3激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。PI3K/Akt/mTOR通路在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)展、增殖轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)中具有重要的作用[2]。我們?cè)陂L(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)麻黃附子細(xì)辛湯治療非小細(xì)胞肺癌療效顯著[3]，通過(guò)對(duì)麻黃附子細(xì)辛湯阻斷非小細(xì)胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，旨在對(duì)麻黃附子細(xì)辛湯治療陽(yáng)虛型非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 麻黃附子細(xì)辛湯(麻黃12 g，細(xì)辛3 g，附子9 g)購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院。按相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)，用蒸餾水稀釋至40 mL，分別作為麻黃附子細(xì)辛湯低劑量、中劑量、高劑量的灌胃藥液，無(wú)菌4 ℃保存。灌胃時(shí)水浴至約20 ℃使用。注射用順鉑(DDP)，20 mg/支，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，生理鹽水稀釋至0.367 mg·mL-1，避光保存。順鉑注射液(齊魯制藥有限公司)，注射用氫化可的松注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司)。采用含100 U·mL-1青、鏈霉素、10%滅活胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，水合氯醛(天津科密歐試劑公司)。PI3K p85αpolyclonal antibody、PI3K p110αpolyclonal antibody、Akt polyclonal antibody、Phospho-Akt Rabbit mAb、mTOR polyclonal antibody、Phospho-mTOR Rabbit mAb(Biworld公司)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠70只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C57BL/6NCrl小鼠SPF級(jí)。

1.3方法 采用注射用氫化可的松注射液25 mg·kg-1·d-1肌肉注射制作陽(yáng)虛型模型，1次·d-1，連續(xù)15 d，陽(yáng)虛型造模16 d后，采用LLC肺癌細(xì)胞株傳代培養(yǎng)移植法構(gòu)建小鼠體內(nèi)肺癌移植瘤模型。接種10 d后，以皮下摸到3～5 mm3的米粒樣硬物，待其長(zhǎng)至1 cm3左右，每組剝?nèi)?只移植瘤行病理檢測(cè)均為癌細(xì)胞，說(shuō)明造模成功。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組，化療組，麻黃附子細(xì)辛湯高、中、低劑量組(中藥高、中、低組)，聯(lián)合組(麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組+順鉑)，每組6只。模型組(M)：0.2 mL·10 g-1生理鹽水灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射生理鹽水0.4 mL；麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組(MH):80.48 g·kg-1(相當(dāng)于臨床成人日用量的4倍)中藥藥液灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射生理鹽水0.4 mL；麻黃附子細(xì)辛湯中劑量組(MM):40.24 g·kg-1(相當(dāng)于臨床成人日用量的2倍)中藥藥液灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射生理鹽水0.4 mL；麻黃附子細(xì)辛湯低劑量組(ML):20.12 g·kg-1(相當(dāng)于臨床成人日用量的1倍)中藥藥液灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射生理鹽水0.4 mL；化療組(C):0.2 mL·10 g-1生理鹽水灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射DDP溶液0.4 mL；聯(lián)合組(CMH):80.48 g·kg-1中藥藥液灌胃10 d，并分別于第1、3、5 d腹腔注射DDP溶液0.4 mL。

運(yùn)用Western Blot法檢測(cè)腫瘤組織PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1模型組、麻黃附子細(xì)辛湯低、中、高劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平 四組PI3K p85α、PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR相對(duì)表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四組p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.102)；以麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組PI3K p85α的相對(duì)表達(dá)水平為最低(P<0.008)；以麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組PI3K p110α的相對(duì)表達(dá)水平為最低(P<0.008)；與模型組相比，低劑量組Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；以麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為最低。與模型組比較，低劑量組p-Akt相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；與低劑量組相比，高劑量組p-Akt相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。(表1、圖1)

表1 模型組、麻黃附子細(xì)辛湯低、中、高劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖1 模型組、麻黃附子細(xì)辛湯高、中、低劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.2模型組、化療組、聯(lián)合組、麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 四組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、PI3K p110α相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；四組PI3K p85α蛋白未測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。與模型組相比，聯(lián)合組Akt相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；與模型組相比，聯(lián)合組p-Akt相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；與聯(lián)合組相比，高劑量組p-Akt相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；與模型組相比，聯(lián)合組mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。與模型組相比，聯(lián)合組、麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組p-mTOR相對(duì)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)；麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組、聯(lián)合組對(duì)PI3K p110α相對(duì)表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.008)。(表2、圖2)

表2 模型組、化療組、聯(lián)合組、麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖2 模型組、化療組、聯(lián)合組、麻黃附子細(xì)辛湯高劑量組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

肺癌(lung cancer)是目前世界上死亡率最高，并且對(duì)人類健康與生命構(gòu)成最大威脅的惡性腫瘤[4]。肺癌分型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌 (small cell lung cancer，SCLC)，NSCLC 5年生存率為16%[5]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，NSCLC的診療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但因其診斷率低、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移迅速、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等病理特點(diǎn)，NSCLC的診治及預(yù)后仍不容樂(lè)觀。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的過(guò)度激活在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中起中樞橋梁作用，并與PI3K下游靶蛋白Akt持續(xù)活化傳導(dǎo)密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道[6]，I型PI3K激活細(xì)胞表面受體，通過(guò)G蛋白受體、酪氨酸激酶受體將信號(hào)進(jìn)行傳遞，p110和p85構(gòu)成IA型PI3K，p110和Ras直接結(jié)合激活PI3K；或與磷酸化酪氨酸殘基結(jié)構(gòu)結(jié)合，引起二聚體改變而被激活。PI3K活化后磷酸化生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phos-phatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)并與Akt的PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)結(jié)合導(dǎo)致Akt蛋白移位；并磷酸化蘇氨酸308(Thr-308)位點(diǎn)和疏水區(qū)絲氨酸473(Ser-473)位點(diǎn)活化Akt蛋白[7]。Akt作為PI3K下游的靶蛋白，其磷酸化磷酸肌醇脂依賴性蛋白激酶(phosphoinostide dependent protein kinase，PDK)可促使通路活化。另一方面，PI3Kp85α作為IA型PI3K/Akt通路激活的始動(dòng)環(huán)節(jié)，磷酸化酪氨酸殘基，激活PI3K[8]。同時(shí)，PI3Kp85α作為獨(dú)立信號(hào)分子可調(diào)節(jié)PI3K的活性影響該通路的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的進(jìn)展[9]。而且，PI3Kp85α能夠抑制p110的持續(xù)活化，其發(fā)生突變后喪失其抑制作用，使p110持續(xù)活化，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[10]。PI3K/Akt通路可激活下游核糖體蛋白及mTOR，重新構(gòu)建肌動(dòng)蛋白，加快腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)侵襲性[11]。

中醫(yī)古籍中并無(wú)“肺癌”之病名，肺癌可歸類為“肺積”，“息賁”，“肺巖”，“肺脹”，“痰飲”等范疇?！峨y經(jīng)·五十五難》曰：“積者，陰氣也，其始發(fā)有常處，其痛不離其部，上下有所終始，左右有所窮處”，即積者屬陰，發(fā)病部位固定; 《靈樞·百病始生》有“積之所生，得寒乃生，厥乃成積也”的論述，均強(qiáng)調(diào)腫瘤多為陰邪致病。而腎陽(yáng)是臟腑陰陽(yáng)的根本，對(duì)機(jī)體臟腑組織器官具有推動(dòng)、溫煦作用；腫瘤病變，日久累及腎陽(yáng)，涉及肺脾，早期主要以腎精不足為主，中晚期以腎陽(yáng)虧虛為突出表現(xiàn)?？梢婈?yáng)虛為腫瘤形成的根本，寒凝痰聚于經(jīng)絡(luò)臟腑，為腫瘤形成提供內(nèi)環(huán)境[12-14]。

因此從陽(yáng)虛論治肺癌有一定的理論及臨床實(shí)踐基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步探討。

在臨床工作中，本課題組對(duì)脾腎陽(yáng)虛致肺癌的機(jī)理形成了獨(dú)到的見解。肺癌的發(fā)病與肺脾腎三臟功能失調(diào)及水液輸布異常密切相關(guān)。麻黃附子細(xì)辛湯，源于《傷寒論》，原文第301條：“少陰病，始得之，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃細(xì)辛附子湯主之?！贝藯l闡釋少陰病寒化兼表的辨證施治。方中，麻黃發(fā)汗解表，宣肺平喘，利水消腫，亦具散寒通滯之功；附子回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛；附子可上助心陽(yáng)，中溫脾陽(yáng)，下補(bǔ)腎陽(yáng)。細(xì)辛解表散寒，祛風(fēng)止痛，通竅，溫肺化飲，細(xì)辛入肺散在表之寒，又入腎除入里之寒。

在對(duì)單藥的研究中，三藥[15-18]均可抑制腫瘤細(xì)胞；尤其附子可提高大鼠自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量，可發(fā)揮機(jī)體自身的抗腫瘤活性，起到類似于免疫細(xì)胞的作用。同時(shí)，三藥合方[19-21]亦可起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。王中奇[19]認(rèn)為陽(yáng)虛為肺癌發(fā)病的根本，臨床運(yùn)用“溫散宣通”之麻黃附子細(xì)辛湯治療非小細(xì)胞肺癌，腫塊較前縮小，胸腔積液較前幾乎全部吸收，無(wú)明顯喘咳胸悶氣急，臨床效果顯著。在對(duì)肺癌并發(fā)癥的治療中，朱芳[22]對(duì)肺癌疼痛感強(qiáng)烈患者予以麻黃附子細(xì)辛湯治療后，疼痛情況有所緩解。

本實(shí)驗(yàn)從整體藥效方面探討麻黃附子細(xì)辛湯阻斷陽(yáng)虛型非小細(xì)胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)麻黃附子細(xì)辛湯可一定程度上減弱PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達(dá)水平，對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)具備一定的抑制功效。

本實(shí)驗(yàn)有部分蛋白表達(dá)未測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，部分蛋白實(shí)驗(yàn)顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮與麻黃附子細(xì)辛湯煎煮濃度太低，導(dǎo)致藥物濃度過(guò)低相關(guān)；同時(shí)下一步可研究麻黃附子細(xì)辛湯與PD-1/PD-L1通路的關(guān)系，進(jìn)一步探討麻黃附子細(xì)辛湯抑瘤的分子機(jī)制。