半夏不同炮制品脂溶性成分及氨基酸的分析鑒定*

徐晶 趙學(xué)群

(1.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.中提(濰坊)生物科技研究有限公司，山東 濰坊 261205)

半夏是天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。其藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“半夏味辛平，主傷寒，寒熱，心下堅(jiān)，下氣，咽喉腫痛，頭眩，胸脹，咳逆，腸鳴，止汗”。其性溫、味辛、有毒，具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效[1-2]。半夏主要化學(xué)成分為半夏淀粉、生物堿、膽胡蘿卜苷、草酸鈣、氨基酸、脂肪酸、無(wú)機(jī)元素、揮發(fā)油等[3]。半夏生品毒性較大，多經(jīng)白礬、生姜、石灰、甘草等輔料炮制后使用，炮制后其毒性明顯降低，藥性和藥效隨之改變[4-5]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2020年版)收載有清半夏、姜半夏、法半夏三種炮制品，功效各有側(cè)重。清半夏(輔料為白礬)長(zhǎng)于燥濕化痰，姜半夏(輔料為生姜、白礬)偏于降逆止嘔，法半夏(輔料為甘草、生石灰)善和胃燥濕。中藥炮制的核心理論是炮制前后化學(xué)成分的變化引起功效的改變[6-8]。半夏中成分復(fù)雜，主要有效成分尚未明確，需要對(duì)其有效成分進(jìn)行評(píng)價(jià)[9-12]，目前對(duì)半夏成分研究越來(lái)越多[13-17]，但對(duì)半夏炮制品化學(xué)成分的系統(tǒng)分析和炮制品之間的差異性成分的比較少有研究，尚未見(jiàn)較全面的關(guān)于炮制對(duì)脂溶性成分和氨基酸含量影響的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和氨基酸分析儀對(duì)半夏不同炮制品中脂溶性成分和氨基酸進(jìn)行分析，并比較清半夏、姜半夏、法半夏之間的成分差異，為半夏炮制品的質(zhì)量控制提供參考，也為臨床用藥的有效性和安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 清半夏、姜半夏、法半夏購(gòu)于北京同仁堂有限責(zé)任公司，經(jīng)山東師范大學(xué)樊守金教授鑒定，均符合現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)。

屈臣氏(Watsons)蒸餾水；石油醚(AR)重蒸；甲醇(AR)；鹽酸(AR)；氨基酸混合標(biāo)樣(美國(guó)通用電氣公司)；茚三酮溶液(美國(guó)通用電氣公司)。

1.2儀器與設(shè)備 320GC-MS毛細(xì)管氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)VARIAN)；Biochrom 31氨基酸分析儀(美國(guó)通用電氣)。

1.3方法

1.3.1樣品前處理 脂溶性檢測(cè)樣品前處理。清半夏、姜半夏、法半夏各取500 g，粉碎后，各用3 L甲醇滲漉提取3次，每次4 d；分別合并提取液，38 ℃減壓濃縮成粗浸膏。把粗浸膏分散到600 mL蒸餾水中，依次分別用600 mL的(60～90 ℃)石油醚萃取3次，于38 ℃減壓濃縮，再經(jīng)冷凍干燥器凍干后得到萃取物。各取1 mg，分別溶于10 mL甲醇中，超聲溶解后裝入進(jìn)樣瓶。

氨基酸檢測(cè)樣品前處理。取干燥的清半夏、姜半夏、法半夏粉碎后，過(guò)20目篩。分別取0.4 g置于安瓿瓶中，加6 mol·L-1的鹽酸溶液20 mL，抽真空后封口，放置110 ℃烘箱內(nèi)水解24 h，取出冷卻過(guò)濾，于100 ℃水浴上蒸去鹽酸，至100 mL容量瓶用0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋定容，過(guò)0.45 μm水相微孔的濾膜，即得。

1.3.2分析方法 GC-MS分析方法：氣相色譜條件，色譜柱為VARIAN VF-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱。柱溫60 ℃(保持2 min)，以5 ℃·min-1升溫至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃·min-1升溫至280 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)，載氣流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL，采用不分流方式進(jìn)樣；溶劑延遲3 min。質(zhì)譜條件，電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～500 amu。數(shù)據(jù)處理采用NIST系統(tǒng)質(zhì)譜庫(kù)。

氨基酸分析方法：分離柱直徑4.6 mm×40 mm，柱溫50 ℃，緩沖液泵壓9～12 Pa，流速0.5 mL·min-1，茚三酮流速0.4 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1成分檢測(cè)結(jié)果

2.1.1脂溶性成分 按上述條件，用GC-MS對(duì)清半夏、姜半夏、法半夏脂溶性成分進(jìn)行了測(cè)定，得到了各自的總色譜離子流譜圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 清半夏、姜半夏、法半夏脂溶性成分總離子流圖

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后獲得相應(yīng)的質(zhì)譜圖。通過(guò)工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工解析[18-19]，確認(rèn)各化合物，按照峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 清半夏、姜半夏、法半夏脂溶性成分GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表1 清半夏、姜半夏、法半夏脂溶性成分GC-MS分析結(jié)果

2.1.2氨基酸成分 取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品，使用氨基酸分析儀對(duì)清半夏、姜半夏、法半夏的氨基酸成分和含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 清半夏、姜半夏、法半夏氨基酸含量測(cè)定結(jié)果

2.2成分分析

2.2.1脂溶性成分分析 從表1可見(jiàn)，脂溶性成分以酯類(lèi)、烷烴類(lèi)、酸類(lèi)為主。清半夏共分離鑒定出25個(gè)色譜峰，姜半夏共分離鑒定出25個(gè)色譜峰，法半夏共分離鑒定出19個(gè)色譜峰。清半夏主要成分(相對(duì)含量大于5%)依次為棕櫚酸(25.34%)、亞麻醇(17.85%)、酞酸二丁酯(11.69%)、間苯二甲酸二辛酯(7.96%)、油酸(6.73%)、反油酸甲酯(5.66%)、棕櫚酸乙酯(5.50%)。姜半夏主要成分依次為酞酸二丁酯(26.04%)、間苯二甲酸二辛酯(16.07%)、反油酸甲酯(8.19%)、棕櫚酸乙酯(6.50%)。法半夏主要成分為酞酸二丁酯(5.49%)。從脂溶性成分組成及分析中可以看出，清半夏和姜半夏主要成分相似，兩者共有化合物23種，法半夏主要成分和含量與前兩者差別較大。其中姜半夏中酞酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、反油酸甲酯、環(huán)己基壬烯、間苯二甲酸二辛酯的相對(duì)含量要明顯高于清半夏。

2.2.2氨基酸成分分析 從測(cè)定結(jié)果看，清半夏和姜半夏均含有16種氨基酸，法半夏中含有15種氨基酸(未檢測(cè)到蛋氨酸)。其中檢測(cè)出的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸7種氨基酸為人體必需氨基酸，組氨酸和精氨酸2種氨基酸為半必須氨基酸。清半夏中必需氨基酸含量占總氨基酸總量的40.7%，姜半夏中必需氨基酸含量占總氨基酸總量的40.2%，法半夏中必需氨基酸含量占總氨基酸總量的40.3%。清半夏中半必需氨基酸含量占總氨基酸總量的10.3%，姜半夏中半必需氨基酸含量占總氨基酸總量的10.4%，法半夏中半必需氨基酸含量占總氨基酸總量的10.4%。因此可以看出，半夏不同炮制品含有的必需氨基酸和半必需氨基酸占比基本一致。半夏炮制品總氨基酸含量順序：清半夏>姜半夏>法半夏。

清半夏中氨基酸主要成分(含量大于0.070 g·100 g-1)依次為天冬氨酸(0.138 g·100 g-1)、谷氨酸(0.104 g·100 g-1)、亮氨酸(0.095 g·100 g-1)、纈氨酸(0.090 g·100 g-1)、精氨酸(0.071 g·100 g-1)；姜半夏中氨基酸主要成分(含量大于0.070 g·100 g-1)依次為天冬氨酸(0.144 g·100 g-1)、谷氨酸(0.101 g·100 g-1)、亮氨酸(0.099 g·100 g-1)；法半夏中氨基酸主要成分(含量大于0.070 g·100 g-1)為天冬氨酸(0.072 g·100 g-1)。不同炮制品半夏均以天冬氨酸含量最高，氨基酸種類(lèi)差別不大，但含量差別較大。

3 討論

對(duì)清半夏、姜半夏、法半夏脂溶性成分進(jìn)行分析和鑒定，脂溶性成分主要含有酯類(lèi)、烷烴類(lèi)、酸類(lèi)，其中清半夏和姜半夏主要成分相似，而法半夏主要成分和含量與前兩者差別較大。清半夏中有機(jī)酸(棕櫚酸和油酸)相對(duì)含量較高，占總成分的30.07%，而在姜半夏和法半夏中均未檢出，說(shuō)明炮制工藝的不同使有機(jī)酸成分發(fā)生改變。藥理研究證實(shí)半夏中總游離有機(jī)酸具有止咳、祛痰、體外抑制腫瘤細(xì)胞的作用[20]，棕櫚酸具有抗腫瘤、抗衰老活性[21-22]。三種炮制品中都含有一定量的角鯊烯和環(huán)氧石竹烯。角鯊烯是一種長(zhǎng)鏈三萜化合物，可提高機(jī)體免疫、抗紫外線、抗衰老、抗疲勞、抗心腦血管疾病等[23]。環(huán)氧石竹烯，可治療皮膚霉菌病，尤其是短期治療甲霉菌病的新的抗真菌劑[24]，同時(shí)還具有止傷痛、消炎抗炎作用[25]。由此可見(jiàn)，脂溶性成分中含量較高的化合物如棕櫚酸、角鯊烯和環(huán)氧石竹烯都具有很好的生物活性，為深入研究半夏的藥用價(jià)值和綜合開(kāi)發(fā)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)清半夏、姜半夏、法半夏氨基酸成分進(jìn)行分析和鑒定，氨基酸種類(lèi)差別不大，但含量差別較大。其中含有的必需氨基酸和半必需氨基酸占比基本一致，且均以天冬氨酸含量最高，但法半夏氨基酸含量顯著降低，可能是因?yàn)榕谥品椒ㄖ杏玫缴?，與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致法半夏中氨基酸成分和含量降低，因此炮制方法對(duì)半夏氨基酸的含量影響比較大。氨基酸具有一定的藥理活性，半夏不同炮制品中含量最高的氨基酸均為天冬氨酸，其次為谷氨酸和亮氨酸。天冬氨酸具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效，含量順序?yàn)椋航胂?清半夏>法半夏。谷氨酸含量其次，對(duì)肝病、精神分裂癥、神經(jīng)衰弱均有療效，含量順序?yàn)椋呵灏胂?姜半夏>法半夏。亮氨酸可以起到氧化供能、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和提高免疫功能的作用，含量順序?yàn)椋航胂?清半夏>法半夏。另外，甘氨酸具有鎮(zhèn)吐的功效[26]，含量順序?yàn)椋航胂?清半夏>法半夏，與姜半夏偏于降逆止嘔的功效一致。

4 結(jié)論

目前2020年版《中國(guó)藥典》一部中對(duì)于半夏炮制品未有統(tǒng)一氨基酸鑒別標(biāo)準(zhǔn)[27]，清半夏的鑒別有精氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，姜半夏和法半夏未有氨基酸的鑒別。而氨基酸是反映半夏炮制品活性和炮制品質(zhì)的重要成分，因此建議將精氨酸、丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，以及具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效的天冬氨酸，作為統(tǒng)一評(píng)價(jià)半夏不同炮制品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)半夏不同炮制品含量進(jìn)行測(cè)定，可以為半夏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化提供參考，為進(jìn)一步探討半夏炮制品的藥理作用和開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。