蟲草益腎顆粒對高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及p22phox表達(dá)的影響

劉爽 宋立群

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 杭州 310005 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的主要原因，30%～40%的糖尿病患者會發(fā)生DKD[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，DKD病理改變的主要原因是人腎小球系膜細(xì)胞（human glomerular mesangial cells，HMCs）的異常增殖[2]，因此本研究以HMCs作為研究對象。氧化應(yīng)激反應(yīng)在DKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，氧化應(yīng)激的增強(qiáng)可導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生，引起中性粒細(xì)胞發(fā)生炎性浸潤，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[3-6]。生理情況下，ROS的清除與生成處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)；而在病理情況下，當(dāng)組織中生成的ROS超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。腎臟中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是參與ROS生成的主要氧化酶之一[7]，p22phox是NADPH氧化酶的亞單位，主要存在于細(xì)胞膜上，當(dāng)NADPH氧化酶激活后，p22phox表達(dá)升高，并在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS。因此，抑制NADPH氧化酶表達(dá)可以抑制ROS產(chǎn)生，從而避免氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的腎臟損傷，并最終抑制DKD進(jìn)一步發(fā)展[8-10]。蟲草益腎顆粒為宋立群教授應(yīng)用多年的臨床經(jīng)驗方，在治療DKD方面療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，蟲草益腎顆?？赏ㄟ^抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進(jìn)過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，從而提高機(jī)體抗氧化能力[11]。本研究通過觀察蟲草益腎顆粒含藥血清對高糖條件下HMCs增殖和氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)一步探究蟲草益腎顆粒防治DKD的作用機(jī)制，為蟲草益腎顆粒治療DKD提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性無特定病原體 （specific pathogen free，SPF）級Wistar大鼠50只，10周齡，體質(zhì)量200～220 g，購買并飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（黑）2017-010]。實驗動物的使用嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 干預(yù)藥物 蟲草益腎顆粒組成：生黃芪30 g、制大黃10 g、水蛭3 g、貓須草20 g、蟲草菌絲粉10 g，所有中藥購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。將上方煎煮、濃縮后制成顆粒劑，規(guī)格為12 g/袋。福辛普利購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院西藥房（商品名：蒙諾，規(guī)格：10 mg/片，批號：1705054）。

1.3 主要試劑和儀器 洛斯維爾·帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)液及胎牛血清均購于Gibco公司（批號：11875-093、10091-148）；細(xì) 胞 增 殖 檢 測 （cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒購于Biosharp公司（批號：BS350B）；葡萄糖干粉購于Sigma公司（批號：G7528）；總RNA提取試劑購于上海拜力生物科技有限公司（批號：BL201704）；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于深圳市康百得生物科技有限公司（批號：20170428）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于哈爾濱?；?（批號：20160516）；p22phox抗體購于Abcam公司 （批號：ab75941）。 Mini-Opticon2型PCR儀購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；EPICSXL型流式細(xì)胞儀為美國Beckmann Coulter公司產(chǎn)品；UVP-200凝膠成像系統(tǒng)購于美國UVP公司；Multiskan 354酶標(biāo)儀為芬蘭Labsystems公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 蟲草益腎顆粒含藥血清的制備 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組，福辛普利組，蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組，每組10只。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[12]計算得出大鼠福辛普利的成人臨床等效劑量為0.9 mg·kg-1，以成人臨床等效劑量為蟲草益腎顆粒低劑量組，中劑量組與高劑量組分別為低劑量組的2倍和4倍。正常組予0.9%氯化鈉溶液灌胃，福辛普利組以0.9mg/（kg·d）灌胃，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組分別以3.24 mg/（kg·d）、6.48 mg/（kg·d）、12.96 mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境及條件相同，持續(xù)干預(yù)7 d后，于末次給藥后2 h眼眶取血，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，56℃、30 min滅活，無菌條件下過濾除菌，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) HMCs由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院惠贈，于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時開始實驗。

1.4.3 分組與給藥 將HMCs隨機(jī)分為6組：正常組，高糖組（加入30 mmol·L-1葡萄糖），福辛普利組（加入10%福辛普利組大鼠含藥血清），蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組（分別加入10%蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組大鼠含藥血清）。

1.4.4 指標(biāo)檢測

1.4.4.1 細(xì)胞增殖檢測 以CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖情況。將對數(shù)生長期HMCs接種于96孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7～8×103/孔，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。每個時間點分別設(shè)10個復(fù)孔，培養(yǎng)至24、48、72 h時，分別加入10 μL/孔的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h。4 h后取出，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度。

1.4.4.2 各組細(xì)胞ROS的表達(dá)情況 HMCs以1×105個/mL接種于6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48、72 h后，以流式細(xì)胞儀檢測各組ROS水平。

1.4.4.3 Real-time qPCR檢測各組細(xì)胞p22phox的mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞，提取RNA并定量，根據(jù)試劑盒說明書將所獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 15 min，95℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，每個樣品各設(shè)3個復(fù)孔，以2-△△ct計算mRNA的相對表達(dá)量。引物設(shè)計和合成均由日本Takara公司完成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.4.4 免疫印跡法檢測各組細(xì)胞p22phox的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量后，按每孔50 μg上樣，行十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳 （sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂奶粉配制的含有Tween的tris緩沖液（tris buffer solution Tween，TBST）封閉1 h，加入一抗（稀釋比例：1∶1 000），室溫?fù)u床孵育2 h后洗滌3次；加入二抗（稀釋比例：1∶5 000），孵育1 h后洗滌3次，以β-actin作為內(nèi)參，加入電化學(xué)發(fā)光液顯色1 min，攝片掃描后用Image-Pro Plus 5.0軟件計算條帶相對灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行圖表處理。計量資料以±s表示，不同組同一時間點及同一組不同時間點差異比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用最小顯著差異法（least significant difference-t，LSD-t）檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與高糖組細(xì)胞不同時間點增殖情況比較

隨著培養(yǎng)時間延長，正常組和高糖組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，各時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中，正常組和高糖組在48 h時的增速均最高，隨后便進(jìn)入增殖平臺期，速度逐漸趨于平緩；在各個時間段內(nèi)，高糖組HMCs增殖速度始終高于正常組，不過在48～72 h時間段內(nèi)，高糖組的HMCs增殖速度與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 正常組與高糖組細(xì)胞不同時間點增殖情況比較Fig.1 Comparison of cell proliferation between normal group and high glucose group at different time points

干預(yù)24 h后，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒低、中劑量組及福辛普利組的HMCs增殖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而蟲草益腎顆粒高劑量組的HMCs增殖水平明顯低于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明干預(yù)24 h后，蟲草益腎顆粒高劑量組對HMCs增殖的抑制效果明顯。干預(yù)48、72 h后，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組及福辛普利組均明顯抑制了HMCs增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。 見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖比較Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

表2 各組細(xì)胞增殖比較Tab.2 Comparison of proliferation in each group（±s，n=10）

注：與正常組同時點比較， ##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01.

組別 2 4 h 4 8 h 7 2 h正常組 0.3 3 9±0.0 8 5 0.9 7 5±0.1 3 6 0.9 8 8±0.0 9 4高糖組 0.6 6 3±0.1 0 8## 1.3 7 3±0.0 9 8## 1.3 9 3±0.0 6 9##福辛普利組 0.5 7 3±0.1 1 9## 1.2 1 5±0.1 0 8##▲▲ 1.1 1 1±0.1 2 2##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 0.6 3 3±0.1 0 0## 1.2 5 1±0.1 1 7##▲ 1.2 0 6±0.0 5 1##▲▲蟲草益腎顆粒中劑量組 0.6 1 4±0.0 9 9## 1.2 2 1±0.1 1 6##▲ 1.1 4 9±0.0 6 9##▲▲蟲草益腎顆粒高劑量組 0.5 1 5±0.0 5 5##▲ 1.1 8 4±0.0 9 3##▲▲ 1.0 9 6±0.0 5 9##▲▲

2.2 各組細(xì)胞ROS表達(dá)比較 與正常組比較，相同時點高糖組的ROS表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。與高糖組比較，各藥物干預(yù)組ROS表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），表明藥物干預(yù)有效。與福辛普利組比較，干預(yù)48 h后，蟲草益腎顆粒各劑量組ROS表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），其中高劑量組的ROS表達(dá)量低于福辛普利組，表明蟲草益腎顆粒高劑量組療效相比福辛普利組更佳；干預(yù)72 h后，蟲草益腎顆粒中、高劑量組的ROS表達(dá)量均低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明隨著藥物干預(yù)時間延長，中、高劑量的蟲草益腎顆粒組抑制ROS表達(dá)的效果高于福辛普利組。見表3。

表3 各組細(xì)胞ROS表達(dá)比較Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

表3 各組細(xì)胞ROS表達(dá)比較Tab.3 Comparison of ROS expression in each group （±s，n=6）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

R O S/%4 8 h 7 2 h正常組 6.4 5±0.6 2 8.4 7±1.3 3高糖組 2 7.1 5±1.9 9## 3 0.4 5±2.1 5##福辛普利組 1 3.4 8±1.1 0##▲▲ 1 7.5 8±0.7 0##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 1 7.4 3±0.7 8##▲▲△△ 2 0.1 5±1.7 1##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 1 5.1 3±1.4 0##▲▲△ 1 5.6 3±1.2 4##▲▲△蟲草益腎顆粒高劑量組 1 0.4 8±1.0 5##▲▲△△ 1 3.6 0±1.3 1##▲▲△△組別

2.3 各組細(xì)胞p22phox的mRNA表達(dá)比較 與正常組比較，相同時點高糖組p22phox mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各藥物干預(yù)組p22phox mRNA表達(dá)水平均下降（P＜0.01），其中蟲草益腎顆粒高劑量組和福辛普利組的效果最為明顯。干預(yù)48 h后，與福辛普利組比較，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox mRNA表達(dá)水平較高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)72 h后，與福辛普利組比較，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox mRNA表達(dá)水平低于福辛普利組（P＜0.01），而蟲草益腎顆粒中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），蟲草益腎顆粒低劑量組p22phox mRNA表達(dá)水平高于福辛普利組（P＜0.01）。見表4。

表4 各組細(xì)胞p22phox的mRNA表達(dá)比較Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

表4 各組細(xì)胞p22phox的mRNA表達(dá)比較Tab.4 Comparison of p22phox mRNA expression in each group （±s，n=3）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x m R N A 4 8 h 7 2 h正常組 1.0 1 9±0.0 3 6 1.0 1 3±0.0 2 5高糖組 1.7 7 1±0.0 5 5## 2.1 4 7±0.0 6 1##福辛普利組 1.3 0 9±0.0 9 3##▲▲ 1.6 1 2±0.0 1 5##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 1.5 6 2±0.0 4 3##▲▲△△ 1.7 2 2±0.0 3 2##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 1.4 7 7±0.0 5 1##▲▲△△ 1.6 2 6±0.0 3 0##▲▲蟲草益腎顆粒高劑量組 1.3 4 7±0.0 7 5##▲▲ 1.5 2 2±0.0 2 4##▲▲△△組別

2.4 各組細(xì)胞p22phox的蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，相同時點高糖組p22phox蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與高糖組比較，各藥物干預(yù)組蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。與福辛普利組比較，干預(yù)48 h后，蟲草益腎顆粒低、中、高劑量組p22phox蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01，P＜0.05）；干預(yù)72 h后，蟲草益腎顆粒高劑量組p22phox蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而蟲草益腎顆粒低、中劑量組蛋白表達(dá)高于福辛普利組（P＜0.01）。 見表5。

表5 各組細(xì)胞p22phox的蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

表5 各組細(xì)胞p22phox的蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of p22phox protein expression in each group （±s，n=3）

注：與正常組同時點比較，##P＜0.01；與高糖組同時點比較，▲▲P＜0.01；與福辛普利組同時點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group at the same time， ##P＜0.01;compared with high glucose group at the same time， ▲▲P＜0.01;compared with Fosinopril group at the same time， △P＜0.05， △△P＜0.01.

p 2 2 p h o x蛋白4 8 h 7 2 h正常組 0.1 0 0±0.0 0 2 0.2 6 4±0.0 0 6高糖組 1.0 0 5±0.0 4 7## 1.0 0 1±0.0 4 9##福辛普利組 0.2 2 3±0.0 3 8##▲▲ 0.4 3 2±0.0 1 5##▲▲蟲草益腎顆粒低劑量組 0.4 6 6±0.0 3 5##▲▲△△ 0.7 9 9±0.0 1 9##▲▲△△蟲草益腎顆粒中劑量組 0.4 6 4±0.0 3 2##▲▲△△ 0.6 9 2±0.0 2 7##▲▲△△蟲草益腎顆粒高劑量組 0.2 9 7±0.0 2 7##▲▲△ 0.4 6 6±0.0 1 7##▲▲組別

3 討論

DKD在中國古代醫(yī)籍中沒有相同病名的記載，但是與DKD癥狀類似的病癥記載卻并不少，如古代醫(yī)籍中關(guān)于“腎消”或“消腎”的論述就與DKD的癥狀相類似。當(dāng)然，這些論述只是與DKD某個階段的癥狀相似，DKD發(fā)展到中后期，會出現(xiàn)水腫、少尿以及貧血等多種癥狀，又與古代醫(yī)籍中的“水腫”“淋證”“虛勞”等相似?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，該病病機(jī)為腎虛，腎虛影響三焦氣化而產(chǎn)生瘀血、痰濕以及濁毒等病理產(chǎn)物，這些病理產(chǎn)物互為表里，相互影響，導(dǎo)致病情遷延難愈[13-14]。本研究團(tuán)隊認(rèn)為，DKD的病機(jī)多為本虛標(biāo)實，以脾腎虧虛為本，以痰瘀互結(jié)為標(biāo)，三焦氣機(jī)壅滯不通，氣化功能失常，引起臟腑升降失司而致病，故治療上應(yīng)注意調(diào)暢氣機(jī)，通利三焦[15]。宋立群教授以健脾益腎、祛瘀泄?jié)釣镈KD的治療大法，在治療上選用經(jīng)驗方蟲草益腎顆粒（發(fā)酵蟲草菌絲粉、生黃芪、貓須草、制大黃、水蛭）。方中重用蟲草為君，補(bǔ)肺益腎；生黃芪、制大黃為臣，補(bǔ)脾活血泄?jié)?；貓須草（別名腎茶）、水蛭為佐使，利濕破血逐瘀、芳化濕濁，全方溫、清、補(bǔ)、消并用，共奏養(yǎng)護(hù)正氣、祛痰逐瘀、推陳致新之功，對于DKD正虛不足、痰瘀互結(jié)、久病失養(yǎng)者頗為適宜。

在本研究中，以24 h為間隔，對72 h內(nèi)高糖環(huán)境下的HMCs增殖情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)72 h內(nèi)高糖環(huán)境下的HMCs增殖特點為雙相過程，同時也證實此次研究選擇的時點（48、72 h）具有實驗意義；同一藥物濃度下，不同作用時點的HMCs增殖速度具有明顯差異。干預(yù)72 h后，蟲草益腎顆粒對HMCs增殖的抑制作用更為明顯，療效更好，說明蟲草益腎顆粒療效存在時間依賴性；在同一時間點，隨著藥物濃度增加，HMCs增殖速度逐漸下降，說明蟲草益腎顆粒療效存在藥物濃度依賴性。

在正常的人體中，抗氧化系統(tǒng)會通過抗氧化反應(yīng)來清除體內(nèi)的ROS，從而使細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)保持在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)[16]。但是，當(dāng)氧化應(yīng)激反應(yīng)過度時，人體組織細(xì)胞就會出現(xiàn)氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步損傷腎臟，引起DKD[17-19]。在腎臟中，ROS的生成與NADPH氧化酶有直接關(guān)系[20]，NADPH氧化酶是一個由細(xì)胞膜結(jié)合色素b558、細(xì)胞胞質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白以及小分子三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白構(gòu)成的酶復(fù)合體，其中細(xì)胞膜結(jié)合色素b558，主要是由p22phox和gp91phox/NADPH氧化酶2構(gòu)成，腎臟中ROS便是由表達(dá)于HMCs的p22phox產(chǎn)生的[21-23]，因此本研究通過檢測p22phox表達(dá)情況，以及由p22phox產(chǎn)生的ROS水平，從基因和蛋白水平兩個角度來分析蟲草益腎顆粒對機(jī)體過度氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制效果。結(jié)果表明，高糖環(huán)境下HMCs的ROS水平明顯上升，說明HMCs處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)。藥物干預(yù)之后，各藥物干預(yù)組HMCs的ROS水平均明顯下降，干預(yù)48 h后，僅蟲草益腎顆粒高劑量組的療效優(yōu)于福辛普利組，干預(yù)72 h后，蟲草益腎顆粒中、高劑量組的療效均優(yōu)于福辛普利組，由此可見，蟲草益腎顆粒對于抑制ROS生成的效果存在時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。在同一時間點，蟲草益腎顆粒高劑量組抑制p22phox表達(dá)情況明顯優(yōu)于低、中劑量組，提示蟲草益腎顆粒存在劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著干預(yù)時間的延長，干預(yù)72 h時蟲草益腎顆粒抑制p22phox基因表達(dá)的作用強(qiáng)于福辛普利組。通過以上結(jié)果可以看出，蟲草益腎顆粒抑制p22phox基因表達(dá)具有時間效應(yīng)關(guān)系。對于p22phox蛋白表達(dá)，干預(yù)48 h后蟲草益腎顆粒高劑量組抑制p22phox蛋白表達(dá)的作用弱于福辛普利組；干預(yù)72 h后，兩者對p22phox蛋白表達(dá)抑制效果持平，分析認(rèn)為蟲草益腎顆粒抑制p22phox蛋白表達(dá)的能力弱于福辛普利組，其原因可能與其更長的半衰期有關(guān)。從以上結(jié)果可以看出，蟲草益腎顆粒在抑制ROS生成方面雖然優(yōu)于福辛普利組，但是在抑制p22phox基因表達(dá)和蛋白表達(dá)方面則沒有明顯的優(yōu)勢，這可能是因為蟲草益腎顆粒在抑制ROS生成方面有其他信號通路參與。

綜上所述，本研究提示蟲草益腎顆粒可能通過抑制p22phox基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)p22phox蛋白表達(dá)，來減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩DKD的發(fā)生發(fā)展。