紅景天苷對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠心功能的影響*

趙白信，于慧娟，焦方杰，邢麗麗，黃蕾，張艷，段少博，姚輝梅

1.鄭州市第七人民醫(yī)院，河南 鄭州 450016；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；3.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是指因缺氧引起的平滑肌細(xì)胞異常增殖及血管重塑而導(dǎo)致肺小動(dòng)脈病變及肺動(dòng)脈壓力升高，最終發(fā)展為右心衰竭，嚴(yán)重威脅患者的生命安全［1-2］。HPH發(fā)病初期較為隱匿，容易被忽視，其臨床診斷需依靠右心導(dǎo)管檢查，但右心導(dǎo)管檢查具有一定的創(chuàng)傷性且對(duì)醫(yī)生技術(shù)有較高的要求，臨床普及性有限。超聲心動(dòng)圖作為一種安全、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)的檢測(cè)方式，可間接評(píng)估肺動(dòng)脈壓力，對(duì)HPH的診療及預(yù)后評(píng)估有重要意義［3-5］。在HPH的進(jìn)展過(guò)程中，肺血管重塑是其重要的病理環(huán)節(jié)，而炎癥反應(yīng)是肺血管重塑的重要驅(qū)動(dòng)因素［6］。因此，減輕炎癥反應(yīng)，抑制肺血管重塑是延緩HPH進(jìn)展的關(guān)鍵。紅景天苷是草本植物紅景天的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗病毒、抗腫瘤作用［7-8］。研究表明，紅景天苷能舒張血管平滑肌，抑制高血壓大鼠的血管重塑，發(fā)揮心血管保護(hù)作用［9］。目前，紅景天苷與肺心病的相關(guān)性研究較多，但關(guān)于其對(duì)HPH小鼠心功能的影響及其作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究建立HPH小鼠模型，探討紅景天苷對(duì)HPH小鼠心功能的影響及作用機(jī)制，旨在為紅景天苷治療HPH提供理論支持與實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物50只雄性C57BL／6小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，12 h／12 h明暗交替環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食。本研究在實(shí)施前已獲得鄭州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：20180006。

1.2 藥物與試劑紅景天苷（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，貨號(hào)：B20504）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海玉博生物科技有限公司，貨號(hào)：205111）；BCA蛋白定量試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號(hào)：80816-500）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：DA1015D、SEKR-0009、SEKR-0005、G1120）；核轉(zhuǎn)錄因子-κB（（nuclear factor kappa B，NF-κB）、p-NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）、p-p38 MAPK一抗及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab223343、ab141406、ab195049、ab278674、ab6728）。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成設(shè)計(jì)。

1.3 儀器ABIViiA TM7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司）；Elx 800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；SLP-2600型石蠟切片機(jī)、DM8000M型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；GE VOLUSON S6型彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)（美國(guó)通用電氣公司）；Allegra X-12型離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特中國(guó)有限公司，離心半徑：10 cm）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備及藥物干預(yù)50只雄性C57BL／6小鼠按體質(zhì)量分為對(duì)照組、模型組及紅景天苷高（200 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）劑量組，每組10只。除對(duì)照組外，其余小鼠依據(jù)參考文獻(xiàn)的方法建立HPH模型［10-11］，具體如下：將小鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，O2濃度維持10%，CO2濃度＜5%，以無(wú)水氯化鈣控制倉(cāng)內(nèi)水蒸氣，每天8 h，每周6 d，維持4周，其余時(shí)間同對(duì)照組處于同一環(huán)境中（常溫常壓及正常的O2濃度和CO2濃度）。紅景天苷高、中、低劑量組小鼠入倉(cāng)前30 min腹腔注射20 mL·kg-1紅景天苷溶液，每天1次，每周6次，維持4周［12］，對(duì)照組和模型組予以腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)末次腹腔注射24 h后實(shí)施超聲心動(dòng)圖檢查，檢測(cè)小鼠右心結(jié)構(gòu)與功能。采用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取左側(cè)臥位及仰臥位采集圖像，12S探頭，rodent模式，二維超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)，于左心室短軸乳頭肌水平測(cè)量偏心指數(shù)（eccentricity index，EI），心尖四腔切面舒張期測(cè)量右心室壁厚度（right ventricular wall thickness，RVWT）、右室基底段內(nèi)徑（right ventricular diameter，RVD）、右室面積變化率（right ventricular fractional area change，RVFAC）。檢測(cè)完成后轉(zhuǎn)化頻譜為多普勒模式，于胸骨旁主動(dòng)脈根部短軸切面肺動(dòng)脈瓣口處測(cè)量肺動(dòng)脈瓣峰值血流速度（plumonary arterial velocity，PAV）及肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間（acceleration time，AT）。

2.3 右心導(dǎo)管法檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary arterial presure，m PAP）及右心室收縮壓（right ventricular systolic presure，RVSP）超聲心動(dòng)圖測(cè)量完畢后，取仰臥位，將小鼠四肢固定于木板，分離右側(cè)頸外動(dòng)脈，PE導(dǎo)管經(jīng)壓力傳感器鏈接PowerLab生理記錄儀，另一端經(jīng)頸外靜脈緩慢插入右心室，再進(jìn)入肺動(dòng)脈，記錄mPAP及RVSP，其中1 kPa＝7.5 mm Hg。

2.4 ELISA法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α水平斷頭法處死小鼠，留取血液1 mL，室溫下靜止1 h，3 000 r·min-1離心15min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清IL-6、TNF-α含量。

2.5 肺動(dòng)脈血管組織病理學(xué)觀察取小鼠肺組織，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成厚度4μm的切片，HE染色，于顯微鏡下觀察肺動(dòng)脈血管組織的病理變化。

2.6 右心肥大指數(shù)（right ventricular hypertrophy

index，RVHI）檢測(cè)PBS緩沖液沖洗干凈心臟，剪開(kāi)心房，沿室間隔將心臟分離成右心室、左心室和室間隔，稱量右心室（right ventricle，RV）、左心室（left ventricle，LV）及室間隔（ventricular septum，S）的質(zhì)量，計(jì)算RVHI。

RVHI＝RV／（LV+S）

2.7 RT-qPCR檢測(cè)肺組織NF-κB m RNA、p38MAPK m RNA的相對(duì)表達(dá)量每組選取5只小鼠肺組織，Trizol法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性25 s，60℃退火35 s，72℃延伸55 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，再次72℃延伸8 min。GAPDH為管家基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.8 Western Blot檢測(cè)肺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB、p-NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量取肺組織，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后加入二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影，Image Lab凝膠圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH的灰度的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對(duì)HPH小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠的RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠的RVWT、RVD顯著降低（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠的RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）。提示紅景天苷能顯著改善HPH小鼠的超聲心動(dòng)圖指標(biāo)，且呈明顯的劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表2 紅景天苷對(duì)HPH小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的影響 （±s，n＝10）

表2 紅景天苷對(duì)HPH小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的影響 （±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

組別 EI／% RVWT（l／mm） RVD（r／mm） RVFAC／% PAV（v／m·s-1） AT（t／s ）30±0.05 26.32±3.20模型組 70.44±4.90a 1.40±0.22a 4.92±0.44a 0.40±0.02a 0.98±0.04a 14.23±1.56a紅景天苷高劑量組 92.01±5.33b 0.68±0.15b 3.51±0.23b 0.52±0.03b 1.20±0.06b 23.01±2.80b紅景天苷中劑量組 84.32±4.85bc 0.85±0.17bc 3.90±0.33bc 0.48±0.03bc 1.13±0.05bc 20.23±2.54bc紅景天苷低劑量組 76.01±5.01bcd 1.11±0.18bcd 4.30±0.35bcd 0.44±0.04bcd 1.05±0.05bcd 16.33±2.29對(duì)照組 98.36±6.62 0.55±0.12 3.22±0.25 0.57±0.04 1.bcd

3.2 紅景天苷對(duì)HPH小鼠mPAP、RVSP、RVHI的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）。說(shuō)明紅景天苷能改善HPH小鼠的心肺功能。見(jiàn)表3。

表3 紅景天苷對(duì)HPH小鼠m PAP、RVSP、RVHI的影響 （±s，n＝10）

表3 紅景天苷對(duì)HPH小鼠m PAP、RVSP、RVHI的影響 （±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

?

3.3 紅景天苷對(duì)HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）。說(shuō)明紅景天苷能降低HPH小鼠的炎癥因子水平。見(jiàn)表4。

表4 紅景天苷對(duì)HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，ng·L-1）

表4 紅景天苷對(duì)HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

組別 n IL-6 TNF-α 10 18.22±3.25 38.54±4.23模型組 10 59.63±5.28a 142.32±8.89a紅景天苷高劑量組 10 26.35±4.35b 50.32±6.01b紅景天苷中劑量組 10 34.01±4.50bc 82.35±7.48bc紅景天苷低劑量組 10 45.30±5.02bcd 102.42±7.85對(duì)照組bcd

3.4 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺動(dòng)脈血管組織病理變化的影響對(duì)照組小鼠肺小動(dòng)脈血管壁薄，形態(tài)、管腔正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠肺小動(dòng)脈血管管壁增厚，管腔變窄，周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有血管重塑表現(xiàn)；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺小動(dòng)脈組織病理變化程度呈劑量依賴性減輕。說(shuō)明紅景天苷能明顯逆轉(zhuǎn)HPH小鼠的肺動(dòng)脈血管組織病理變化。見(jiàn)圖1。

圖1 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺動(dòng)脈血管組織病理變化的影響（HE染色，×200）

3.5 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織NF-κBmRNA、p38MAPK mRNA表達(dá)水平的影響各組小鼠肺組織中NF-κB mRNA、p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織NF-κB mRNA、p38MAPK m RNA表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）

表5 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織NF-κB mRNA、p38MAPK m RNA表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）

mRNA對(duì)照組組別 NF-κB mRNA p38MAPK 0.85±0.23 1.11±0.25模型組 0.82±0.23 1.20±0.25紅景天苷高劑量組 0.88±0.25 1.08±0.26紅景天苷中劑量組 0.84±0.24 1.13±0.28紅景天苷低劑量組0.86±0.22 1.15±0.25

3.6 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38MAPK及p38MAPK蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織p-NFκB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、pp38MAPK／p38MAPK的水平顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）。說(shuō)明紅景天苷能抑制HPH小鼠肺組織中NF-κB、p38MAPK的磷酸化。見(jiàn)圖2，表6。

圖2 Western Blot檢測(cè)p-NF-κB、NF-κB、p-p38MAPK及p38MAPK蛋白表達(dá)

表6 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38M APK及p38M APK蛋白表達(dá)的影響 （±s，n＝5）

表6 紅景天苷對(duì)HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38M APK及p38M APK蛋白表達(dá)的影響 （±s，n＝5）

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

B p-p38MAPK／p38MAPK對(duì)照組組別 p-NF-κB／NF-κ 0.15±0.04 0.08±0.02模型組 0.95±0.15a 0.80±0.15a紅景天苷高劑量組 0.22±0.08b 0.15±0.05b紅景天苷中劑量組 0.42±0.10bc 0.32±0.10bc紅景天苷低劑量組 0.65±0.13bcd 0.50±0.12 bcd

4 討論

HPH的肺血管病變主要局限于細(xì)小動(dòng)脈，血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增生導(dǎo)致管壁增厚、管腔狹窄，肺周圍阻力增加，進(jìn)而出現(xiàn)肺循環(huán)淤阻及右心衰竭［13］。炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的肺毛細(xì)血管管壁通透性增加，肺血管結(jié)構(gòu)破壞，血管內(nèi)皮收縮、舒張因子失衡是導(dǎo)致肺血管阻力升高和血管重塑的重要原因［14］。因此，阻斷炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的病理變化，抑制肺血管重塑，成為治療HPH的重要環(huán)節(jié)。目前雖有內(nèi)皮素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等靶向抗血管擴(kuò)張藥物可減輕HPH的肺血管阻力，但價(jià)格昂貴；而其他糖皮質(zhì)激素、免疫制劑等抗炎藥物的不良反應(yīng)多［15-16］。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，紅景天苷作為中藥紅景天的主要有效成分，在降壓、抗炎、增強(qiáng)免疫、保護(hù)心血管方面的作用逐漸被認(rèn)知，為HPH的治療提供了新的研究方向。

藏藥紅景天具有抗炎、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管等多種藥理作用，廣泛用于一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病、急性腦梗死等疾病的治療，在改善血液循環(huán)、抑制血小板聚集、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方面有顯著的優(yōu)勢(shì)［17-21］。紅景天苷為紅景天的主要化學(xué)成分，能下調(diào)肺組織中TNF-α、IL-1的表達(dá)，改善HPH大鼠肺動(dòng)脈壓、頸動(dòng)脈壓與心肺功能［22］。Wei等［23］研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可抑制大鼠局灶性腦缺血后的炎癥信號(hào)通路，減輕炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善腦缺血。另外，紅景天苷還可抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖，機(jī)制可能與抑制線粒體分裂有關(guān)［24］。以上研究均證實(shí)，紅景天苷具有抑制肺組織炎癥和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、降壓、改善血液循環(huán)的作用。本研究顯示，與模型組比較，紅景天苷給藥組小鼠RVWT、RVD、mPAP、RVSP、RVHI及血清IL-6、TNF-α水平顯著降低，而EI、RVFAC、PAV、AT顯著升高，肺動(dòng)脈血管組織病理變化明顯減輕，且作用效果呈劑量依賴性。提示，紅景天苷可改善HPH進(jìn)展過(guò)程中小鼠的右心結(jié)構(gòu)及功能，降低炎癥水平，抑制肺血管的重塑。

p38MAPK／NF-κB是與炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)的信號(hào)通路。p38MAPK能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化發(fā)揮作用，參與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、分化的細(xì)胞周期過(guò)程［25］。研究證實(shí)，p38MAPK在受到各種刺激時(shí)可迅速磷酸化，促進(jìn)相關(guān)底物的活化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［26］。NF-κB是在成熟B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［27］。You等［28］認(rèn)為磷酸化的NF-κB參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。本研究顯示，與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺組織中p-NFκB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著降低，且呈明顯的劑量依賴性。

綜上所述，紅景天苷可顯著改善HPH小鼠的心臟功能，減輕炎癥反應(yīng)，其作用可能與抑制p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化有關(guān)。