青藤堿通過ERK1／2-GSK3β-NFκB信號通路對腎移植大鼠急性排斥反應的作用及機制研究*

王曉勃，王長安，吳秋杰

鄭州市第七人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

終末期腎病是各種腎臟疾病發(fā)展到腎衰竭階段的共同綜合征，腎移植是目前治療終末期腎病最有效的方法，對于提高患者的生命質量具有重要意義［1］。隨著臨床移植水平的提高及各種新型免疫制劑的應用，腎移植效果得到顯著改善，患者短期內的生活質量明顯提高，但長期存活率依然較低［2-3］。腎移植術后的急性排斥反應仍是術后最主要的難題，也是導致慢性排斥反應和移植腎失功的首要原因，同時長期使用免疫抑制劑給患者帶來較大不良反應，影響患者長期生活質量［4］。因此，尋找一種安全有效的抑制急性排斥反應的藥物，是保證移植腎長期存活的關鍵。青藤堿（sinomenine，SIN）是從中藥青風藤中提取的一種生物堿單體，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理學作用，對多種疾病均有較好療效［5-6］。既往研究顯示，SIN具有阻滯免疫應答減少排斥反應的作用［7］，但其具體作用機制研究尚少。本研究通過建立同種異體腎移植大鼠模型，探討SIN在腎移植急性排斥反應中的作用，為SIN用于臨床治療腎移植急性排斥反應提供理論基礎。

1 材料

1.1 動物供體：Wistar大鼠，雄性，80只，7～8周齡，體質量（270±20）g，受體：SD大鼠，雄性，90只，7～8周齡，體質量（250±20）g，所有大鼠均為SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0001。大鼠購入后保持溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12 h／12 h循環(huán)，適應性飼養(yǎng)7 d。本研究經鄭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，倫理批號：20191015031。

1.2 藥物與試劑青藤堿（≥98%，每支20 mg，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：191016）；環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）注射劑（≥99%，每支250 mg，挪威Sandoz公司，貨號：B28163）；戊巴比妥鈉（青島捷世康生物科技有限公司，批號：191203）；肝素鈉（武漢德晟生化科技有限公司，批號：190901）；平衡鹽溶液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GL1724）；注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：191108）；甲醛溶液（美國Merck公司，貨號：47608）；白細胞介素（interleukin，IL）-2、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫分析檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：191015、190906）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號：15596-018）；反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司，貨號：RR036A），兔抗大鼠細胞外信號調節(jié)激酶1／2（extranal-signal regulated kinase 1／2，ERK1／2）、p-ERK1／2、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、p-GSK3β、核轉錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65一抗（美國Abcam公司，貨號：ab17942、ab126445、ab185141、ab68476、ab239882、ab239882）。

1.3 儀器AU5800型全自動生化分析儀（Beckman Coulter）；M10125型PCR儀、Experion型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 大鼠腎移植急性排斥模型的建立及分組取80只Wistar供體大鼠，術前12 h禁食不禁水，按1 mL·kg-1腹腔注射體積分數3%戊巴比妥鈉進行麻醉，仰臥固定后，由劍突至恥骨聯合，腹部正中切口，暴露腹腔，鈍性分離輸尿管及膀胱，游離腹主動脈及下腔靜脈，結扎周圍血管，游離左腎及腎動靜脈，結扎腎上腺動靜脈。用血管夾夾閉腹主動脈，將4℃肝素平衡鹽溶液（含肝素鈉625 U·mL-1）灌注左腎，結扎左腎靜脈，待供體腎顏色變?yōu)辄S白色，腎靜脈流出液體變清亮時停止灌注，切斷左腎相關聯的輸尿管、腹主動脈和下腔靜脈取下，剪去供腎多余的脂肪組織及下腔靜脈，適當修整后放入4℃肝素平衡鹽溶液中保存。取80只SD受體大鼠麻醉后暴露左腎并切除，將供腎置入受體腹腔，靜脈端行端端吻合，動脈端行端側吻合，打開血管夾，供腎充血變紅，輸尿管周圍可見明顯滲血，連續(xù)縫合腹壁肌層。術后肌肉注射青霉素10萬單位，連續(xù)3 d，預防感染，其余10只SD大鼠設為假手術組，開腹后游離左腎，不做切除，之后關腹，其他操作同上。將手術成功68只大鼠隨機分為模型組17只，SIN低劑量組17只，SIN高劑量組17只，陽性對照組17只。

2.2 干預方法術后24 h，鹽酸青藤堿用生理鹽水稀釋成質量分數1%的溶液，CsA用生理鹽水稀釋成0.25%的溶液，SIN低劑量組、SIN高劑量組分別按15 mg·kg-1、30 mg·kg-1體質量腹腔注射鹽酸青藤堿溶液，陽性對照組按5 mg·kg-1體質量腹腔注射CsA，每天1次，假手術組和腎移植組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，至受體鼠死亡。

2.3 觀察生存時間術后大鼠正常飼喂，模型組、SIN低劑量組、SIN高劑量組、陽性對照組隨機各取8只大鼠，用于觀察大鼠存活時間。

2.4 檢測腎功能移植7 d后，模型組、SIN低劑量組、SIN高劑量組、陽性對照組剩余大鼠及假手術組大鼠，麻醉后，腹主動脈采血5mL，2 500 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，取上清，一部分使用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；另一部分于-20℃保存。

2.5 檢測血清IL-2、TNF-α水平取保存血清，采用酶聯免疫分析法檢測血清IL-2、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書，反應結束后，用酶標儀在波長450 nm處讀取吸光值，根據標準品濃度和吸光值繪制標準曲線，計算各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平。

2.6 觀察腎組織病理學變化采血完畢，處死大鼠，摘取左腎，沿冠狀面切開后，一半置于40 ng·L-1中性甲醛中固定24 h，取出固定好的腎臟標本，依次進行濃度梯度酒精脫水，通過二甲苯透明，放入液體石蠟進行包埋，冷卻后切片（片厚約4μm），行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察腎形態(tài)學變化。按照Banff腎移植病理分類［8］，分別對小動脈內膜增生、腎小管萎縮、間質纖維化、腎小球硬化、單個核細胞浸潤等損害進行評分，每項得分0～3分，采用雙盲法由2名人員單獨對每只大鼠進行評分，取兩人評分的均值作為最終評分。

2.7 檢測大鼠腎臟ERK1／2 mRNA、GSK3βm RNA、NF-κB p65 mRNA水平左腎另一半置于液氮中保存。取液氮保存腎組織70 mg，使用Trizol試劑盒說明書提取總RNA，測定其純度和濃度，取總RNA按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。反應體系包括：模板cDNA 2μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶10μL，雙蒸水6μL。以β-actin為內參，進行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列

2.8 檢測大鼠腎臟ERK1／2、GSK3β、NF-κB p65及其磷酸化蛋白水平取液氮保存的腎臟80 mg，冰上研磨，離心取上清，加入RIPA裂解液裂解細胞，BCA法檢測蛋白濃度，100℃水浴5 min蛋白變性，蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干法將蛋白轉移至PDVF膜，5%脫脂牛奶搖床封閉1 h，TBST溶液洗膜，加入稀釋的一抗ERK1／2、p-ERK1／2、GSK3β、p-GSK3β、NF-κB p65、p-NFκB p65（1∶2 000）、β-actin（1∶4 000）4℃搖床過夜，TBST溶液洗膜，加入HRP標記的稀釋后的二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育1 h，TBST溶液洗膜，滴加ECL試劑，暗室下顯影、曝光成像。通過Image J軟件分析圖像，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠存活時間比較與模型組比較，SIN低、高劑量組和陽性對照組大鼠平均存活時間極顯著延長（P＜0.01）；與SIN低劑量組比較，SIN高劑量組和陽性對照組大鼠平均存活時間極顯著延長（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠存活時間比較 （±s，d）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與SIN低劑量組比較，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001

存活時間模型組組別 n 7.96±0.83 SIN低劑量組 9 9.72±0.98**SIN高劑量組 9 11.75±1.16**＃＃陽性對照組 9 12.14±1.25**＃＃＃9

3.2 各組大鼠血清Scr、BUN水平比較與假手術組比較，模型組血清Scr、BUN水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIN低、高劑量組和陽性對照組血清Scr、BUN水平降低（P＜0.05）；與SIN低劑量組比較，SIN高劑量組和陽性對照組大鼠血清Scr、BUN水平極顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清Scr、BUN水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清Scr、BUN水平比較（±s）

注：與假手術組比較，***P＜0.001；與模型組比較，＃＃＃P＜0.001；與SIN低劑量組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

組別 n Scr（c／μmol·L-1）BUN（c／mmol·L-1）10 68.26±10.54 9.16±3.01模型組 9 163.58±16.21*** 53.25±5.29***SIN低劑量組 9 122.98±15.13＃＃＃ 36.13±3.32＃＃＃SIN高劑量組 9 97.56±12.22＃＃?！鳌?22.49±2.56＃＃＃△△△陽性對照組 9 93.21±13.14＃＃?！鳌鳌?0.18±2.61＃＃＃假手術組△△△

3.3 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-2、TNF-α水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SIN低、高劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-2、TNF-α水平極顯著降低（P＜0.001）；與SIN低劑量組比較，SIN高劑量組和陽性對照組血清IL-2、TNF-α水平極顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較 （±s）

表4 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較 （±s）

注：與假手術組比較，***P＜0.001；與模型組比較，＃＃＃P＜0.001；與SIN低劑量組比較，△△△P＜0.001

組別 n IL-2（ρ／ng·L-1）TNF-α（ρ／μg·L-1）10 90.26±28.15 43.63±8.59模型組 9 556.12±50.26*** 136.58±13.48***SIN低劑量組 9 384.67±42.73＃＃＃ 96.21±10.63＃＃＃SIN高劑量組 9 221.19±31.48＃＃?！鳌鳌?2.64±9.14＃＃?！鳌鳌麝栃詫φ战M 9 207.25±30.23＃＃＃△△△69.58±8.98＃＃＃假手術組△△△

3.4 大鼠腎臟形態(tài)學變化假手術組大鼠腎臟腎小管及腎間質結構正常，未見明顯損傷；模型組大鼠腎小管上皮細胞腫脹，部分細胞出現壞死、萎縮，腎間質充血，出現管型和間質內炎細胞浸潤；SIN低劑量組、SIN高劑量組和陽性對照組均有不同程度改善，腎間質充血緩解，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

與模型組比較，SIN低、高劑量組和陽性對照組Banff評分極顯著降低（P＜0.001）；與SIN低劑量組比較，SIN高劑量組和陽性對照組Banff評分降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理學改變（HE染色，×200）

表5 腎組織Banff評分比較 （±s，分）

表5 腎組織Banff評分比較 （±s，分）

注：與模型組比較，***P＜0.001；與SIN低劑量組比較，＃＃＃P＜0.001

評分模型組組別 n Banff 11.26±1.21 SIN低劑量組 9 7.39±1.06***SIN高劑量組 9 3.25±0.91＃＃＃陽性對照組 9 3.07±0.83 9＃＃＃

3.5 各組大鼠腎臟ERK 1／2、GSK 3β、NF-κB p65蛋白及其磷酸化蛋白水平比較與假手術組比較，模型組大鼠腎臟p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NFκB p65蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIN低劑量組、SIN高劑量組、陽性對照組大鼠腎臟p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與SIN低劑量組比較，SIN高劑量組、陽性對照組p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表6，圖2。

表6 各組大鼠腎臟p-ERK 1／2／ERK 1／2、p-GSK3β／GSK3β和p-NF-κB p65／NF-κB p65比較 （±s）

表6 各組大鼠腎臟p-ERK 1／2／ERK 1／2、p-GSK3β／GSK3β和p-NF-κB p65／NF-κB p65比較 （±s）

注：與假手術組比較，***P＜0.001；與模型組比較，＃＃＃P＜0.001；與SIN低劑量組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

B p65假手術組組別 n p-ERK1／2／ERK1／2 p-GSK3β／GSK3β p-NF-κB p65／NF-κ 10 0.34±0.06 0.42±0.06 0.32±0.05模型組 9 0.99±0.08*** 0.96±0.09*** 0.97±0.09***SIN低劑量組 9 0.77±0.07＃＃＃ 0.77±0.08＃＃＃ 0.78±0.08＃＃＃SIN高劑量組 9 0.60±0.07＃＃?！鳌鳌?0.62±0.07＃＃＃△△ 0.53±0.06＃＃?！鳌鳌麝栃詫φ战M 9 0.55±0.06＃＃＃△△△ 0.61±0.07＃＃?！鳌鳌?0.50±0.07＃＃?！鳌鳌?/p>

圖2 腎組織各蛋白表達水平

4 討論

腎移植是目前最成熟的器官移植手術之一，受者術后需使用免疫抑制劑（如CsA等）以控制腎術后急性排斥反應［9-10］。但免疫抑制劑存在肝、腎毒性及骨髓移植等不良反應，導致機體免疫力下降、感染增加，降低移植腎存活時間，減少免疫抑制劑對患者的困擾，延長移植腎存活時間，成為腎移植方向急需解決的問題［11］。研究顯示，多種中藥及其活性成分在抑制免疫方面具有顯著效果，為解決同種異體腎移植排斥反應提供新的方法和途徑［12-13］。青風藤在我國民間用于風濕痹痛歷史悠久，SIN是青風藤主要活性成分，臨床上用于類風濕類關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的治療，療效確切、安全性高，在器官移植術后的抗免疫排斥也凸顯出良好效果，逐漸用于多方面免疫耐受的研究［14］。

當腎功能受損時，會導致Scr、BUN無法排出，濃度升高。IL-2可促進排斥反應發(fā)生，逆轉已經產生的免疫耐受，TNF-α能促進炎癥因的產生，發(fā)生放大效應，加重炎癥細胞的聚集和浸潤。SIN是從中藥中提取的生物活性堿，在創(chuàng)傷性脊髓損傷、膿毒癥等疾病中具有明顯抗炎效果［15-16］。研究顯示，SIN可通過降低移植物中的炎癥因子，對移植器官產生抗免疫排斥作用［17］。本研究發(fā)現，SIN各組較模型組大鼠生存時間延長，大鼠血清Scr、BUN、IL-2、TNF-α水平降低，Banff評分降低，病理損傷得到改善，且SIN高劑量組與CsA的陽性對照組效果相當，提示SIN可降低腎移植大鼠炎性反應、抗腎移植急性排斥反應，發(fā)揮腎保護作用。研究報道，SIN可延長皮膚移植小鼠模型中移植皮片的存活時間，降低血漿IL-2水平，具有抑制免疫排斥反應的作用［18］。研究顯示，SIN可降低肝細胞癌大鼠模型肝移植術后炎癥因子水平，抑制細胞免疫反應［19］。鄧衛(wèi)平等［20］在巨細胞病毒性肝炎模型大鼠中得到類似結果，SIN相關制劑可阻斷抗原遞呈作用，減輕肝移植術后急性排斥反應。以上研究均提示，SIN在器官移植方面的抗排斥反應作用，本研究結果也顯示SIN對同種異體腎移植大鼠具有一定抑制急性排斥反應作用，發(fā)揮腎保護作用。

ERK1／2是一種絲氨酸／蘇氨酸類激酶，磷酸化活化后通過促使細胞內外信號轉移，調控細胞的增殖、凋亡、分化等［21］。GSK3β與多條信號通路關系密切，表達失調可引起腫瘤、神經性疾病、糖尿病等多種疾?。?2-24］。NF-κB在體內廣泛參與炎癥調節(jié)過程，通常以p50-p65異二聚體的形式存在呈非活化狀態(tài)，活化后產生多種細胞因子參與炎癥反應［25］。器官移植后，活化的ERK1／2通過磷酸化下游GSK3β，進而激活NF-κB，誘導下游炎癥細胞因子釋放，促進炎癥細胞浸潤，加重排斥反應［26］。研究證實，p-GSK3β和p-NF-κB p65表達異常升高，與器官移植后移植物失功有密切關系［27］。ERK1／2表達降低后，可顯著抑制p-GSK3β表達，進而調控ERK1／2-GSK3β-NF-κB信號通路，減輕炎癥反應［28］。研究顯示，ERK1／2活化被抑制后，通過下游級聯反應，降低NF-κB表達，減輕細胞炎癥反應［29］。研究表明，激活ERK1／2-GSK3β-NF-κB信號通路可引起大鼠腎移植術后炎癥反應，促進慢性腎失功進展，而抑制該通路后，可延緩腎失功進展［30］。本研究SIN各組大鼠腎臟p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65表達均較模型組顯著下降，提示SIN減輕腎移植大鼠急性排斥反應可能是與抑制ERK1／2-GSK3β-NF-κB信號通路有關。通過降低ERK1／2磷酸化水平，進而抑制其下游GSK3β活化，減輕炎癥反應，減輕移植術后排斥反應。

綜上所述，SIN具有一定抗腎移植大鼠移植術后急性排斥反應的作用，可能是通過阻滯ERK1／2-GSK3β-NF-κB信號通路活化發(fā)揮抑制作用，為臨床治療腎移植術后急性排斥反應提供一定實驗依據。