光活化消毒技術(shù)清除小鼠舌部白色念珠菌的實(shí)驗(yàn)研究

光活化消毒技術(shù)（photoactivated disinfection，PAD）是在有氧的條件下，使用具有特定波長的光激活光敏劑實(shí)現(xiàn)殺滅微生物的一項(xiàng)技術(shù)。目前有學(xué)者開展了光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）治療口腔白色念珠菌病的相關(guān)研究，但使用的設(shè)備不同、光源不同、光敏劑種類及濃度不同、光照參數(shù)也不盡相同，而且大多數(shù)研究的孵育時(shí)間和光照時(shí)間均較長

，很難應(yīng)用于體內(nèi)。另外有研究

顯示，白色念珠菌與其他細(xì)菌（如金黃色葡萄球菌等）相比，其細(xì)胞體積大，故更難殺滅。加之體內(nèi)白色念珠菌感染主要表現(xiàn)為以生物膜形式為主的念珠菌病，生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜，較菌液狀態(tài)相對(duì)更難殺滅。因此，保證較好清除率的同時(shí)能夠縮短操作時(shí)間是PAD 應(yīng)用于臨床治療急性假膜型念珠菌性口炎的基礎(chǔ)。

（2）北海銀灘燈塔。正在建設(shè)中的銀灘燈塔，設(shè)計(jì)理念采用合浦西漢漢墓群出土的“銅鳳燈”為造型，內(nèi)含海洋文化、歷史文化與人文精神、旅游文化元素，獨(dú)具特色，將打造成北海市地標(biāo)建筑。

本研究采用PAD

Plus 儀對(duì)急性假膜型念珠菌性口炎小鼠模型進(jìn)行處理，探究PAD 技術(shù)清除小鼠舌部白色念珠菌的效果，為該技術(shù)應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

標(biāo)準(zhǔn)菌株：白色念珠菌SC5314（石家莊和亞生物技術(shù)有限公司）。ICR 雄性小鼠，6 周齡，40 只（購自北京華阜康生物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110322200101896964，統(tǒng)一高壓滅菌墊料，統(tǒng)一飼料，自由飲食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度：22 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度：55%～70%）。本研究已通過河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)號(hào)：［2020］016。

PAD

Plus 儀（DX9001，DENFOTEX，英國）、1 mg/mL 甲苯胺藍(lán)溶液（DENFOTEX，英國）、小型動(dòng)物麻醉機(jī)（R583S，瑞沃德生命科技有限公司，中國）、異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，中國）、念珠菌顯色培養(yǎng)基（上?？片敿挝⑸锟萍加邢薰荆袊?。

第三，質(zhì)量安全水平對(duì)嬰幼兒配方乳粉的進(jìn)口量有顯著影響，且進(jìn)口產(chǎn)品的抽檢合格率對(duì)嬰幼兒配方乳粉的進(jìn)口量有正向影響，國產(chǎn)產(chǎn)品的抽檢合格率對(duì)進(jìn)口量有負(fù)向影響。從變量系數(shù)來看，與進(jìn)口產(chǎn)品抽檢合格率的正向拉動(dòng)作用相比，國產(chǎn)產(chǎn)品檢合格率對(duì)嬰幼兒配方乳粉進(jìn)口貿(mào)易的負(fù)向推動(dòng)作用更強(qiáng)。

1.2 急性假膜型念珠菌性口炎小鼠模型建立

1.2.1 菌液制備 接種前3 天，將白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314 接種到科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基中，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，此為F1，轉(zhuǎn)種，35 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h 得到F2，將其制備成濃度為1 × 10

CFU/mL 的白色念珠菌菌懸液備用。接種前1 天，40 只小鼠肌肉注射醋酸潑尼松龍，注射劑量為100 mg/kg，促使小鼠產(chǎn)生免疫抑制。給予小鼠含0.83 mg/mL 鹽酸四環(huán)素的飲水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水。

課程教學(xué)改革主要涉及教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)組織和教學(xué)評(píng)價(jià)4大板塊，結(jié)合PBL教學(xué)法基本原理，以制藥工程專業(yè)文獻(xiàn)檢索課程為例，筆者做出如下方案(表1)。

接種后第3 天，采用隨機(jī)數(shù)字表法從模型小鼠中挑選30 只小鼠并隨機(jī)分為2 組，對(duì)照組和PAD 處理組（以下稱光活化組），各15 只。肌肉注射醋酸潑尼松龍，注射劑量為100 mg/kg。采用異氟烷吸入麻醉對(duì)30 只實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施麻醉并維持麻醉狀態(tài)。

1.2.3 模型評(píng)估 通過觀察小鼠臨床表現(xiàn)，舌背黏膜有無紅斑或白色偽膜樣損害，舌背真菌載量測定，肝、腎組織及結(jié)腸糞便載量測定、組織病理學(xué)檢查對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

1.3 分組處理

1.2.2 接種 接種當(dāng)天，使用0.6%的戊巴比妥鈉（劑量：0.01 mL/g）對(duì)小鼠實(shí)施麻醉。麻醉后牽出小鼠舌體，用已在1 × 10

CFU/mL 的白色念珠菌菌液中浸泡1 min 的棉簽反復(fù)涂擦小鼠舌背部30 s，保持小鼠舌體于口腔外，靜置60～75 min。接種后第3 天觀察小鼠狀態(tài)并評(píng)估模型。

處理后48 h，分別觀察對(duì)照組、光活化組小鼠狀態(tài)，行臨床檢查、真菌載量測定及舌背組織病理學(xué)檢查。

1.4 觀察及處死動(dòng)物

對(duì)照組：不給予任何處理，行舌背真菌載量測定；光活化組：在小鼠舌背部涂抹1 mg/mL 的甲苯胺藍(lán)溶液，參考產(chǎn)品說明書中該技術(shù)運(yùn)用于根管消毒和牙周袋消毒的參數(shù)，孵育1 min，750 mW LED 紅光照射1 min。光照后即刻行舌背真菌載量測定。

10位在專業(yè)技術(shù)崗位上工作的畢業(yè)生，對(duì)就業(yè)感受有高度的一致性，可以代表性地反映就業(yè)質(zhì)量和人才培養(yǎng)方面的問題。

1.5 PAD 技術(shù)清除急性假膜型念珠菌性口炎小鼠舌部白色念珠菌效果評(píng)價(jià)

1.5.1 臨床表現(xiàn) 觀察小鼠的皮毛、行為及黏膜情況及小鼠舌背白色假膜情況。

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料（小鼠舌背真菌載量轉(zhuǎn)化為Log

CFU/mL 后的值）進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，用

檢驗(yàn)進(jìn)行比較；不服從正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，設(shè)定

＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.3 組織病理學(xué)檢查 切取兩組小鼠的舌體組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，標(biāo)準(zhǔn)化縱向切片。經(jīng)HE 染色及PAS 染色后顯微鏡下放大200 倍和400 倍觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.5.2 舌背真菌載量測定 無菌棉簽涂擦小鼠舌背1 min，棉簽棉絮部分即刻置于盛有1 mL 生理鹽水的離心管中，旋渦振蕩器振蕩1 min，然后生理鹽水連續(xù)10 倍比稀釋，分別得到10～10

倍的稀釋液，每個(gè)稀釋液取10 μL 涂科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)皿，每個(gè)濃度分三個(gè)平行板，35 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上生長的菌落CFU，單位為CFU/mL。

目前，在國內(nèi)建筑市場中，基本形成了以監(jiān)理制為監(jiān)督管理體系來控制工程質(zhì)量，以工程承包企業(yè)的自身技術(shù)力量，按照質(zhì)量保證體系來自控工程質(zhì)量，但事實(shí)卻不盡如人意，工程質(zhì)量問題和工程事故仍頻頻出現(xiàn)，針對(duì)這種狀況，建設(shè)單位為了自己切身利益，就不能任其狀況持續(xù)發(fā)展，而應(yīng)積極主動(dòng)地參與到建筑工程的質(zhì)量管理上來，力促監(jiān)理和施工企業(yè)嚴(yán)把工程質(zhì)量關(guān)，盡量減少和消除工程建設(shè)過程中出現(xiàn)的質(zhì)量問題。下面就此歸納幾個(gè)質(zhì)量管理方法，以供探討。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn)

與正常小鼠相比，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈笠话銧顟B(tài)尚可，但出現(xiàn)毛松、行動(dòng)遲緩、蜷縮及眼瞼閉合等情況，舌背出現(xiàn)不同程度紅斑或白色偽膜，舌背［（4.77 ± 0.35）Log

CFU/mL］及結(jié)腸糞便中（7.17 ×10

CFU/mL）均檢測出大量白色念珠菌，但肝腎組織中未檢測出白色念珠菌，舌背組織切片可見大量白色念珠菌菌絲，急性假膜型念珠菌性口炎小鼠模型建立成功。

處理后48 h，對(duì)照組小鼠仍然保持松毛、行動(dòng)遲緩、蜷縮及眼瞼閉合等情況，小鼠舌背假膜明顯，光活化組小鼠較對(duì)照組小鼠毛順滑、有光澤，行動(dòng)較敏捷，無蜷縮及眼瞼閉合等情況，舌背白色假膜明顯減少（圖1）。

2.2 舌背真菌載量

處理后即刻，光活化組小鼠舌背真菌載量明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.001）。處理后48 h，光活化組小鼠舌背真菌載量仍然顯著低于對(duì)照組（

＜0.001）（表1）。

對(duì)照組小鼠處理后48 h 與處理后即刻的舌背真菌載量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05），光活化組小鼠處理后48 h 舌背真菌載量高于處理后即刻舌背載量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）（表1）。

由此可見,隱喻翻譯主要是依靠經(jīng)驗(yàn)和思維進(jìn)行對(duì)等認(rèn)知映射,但同時(shí)又有許多制約條件。在進(jìn)行隱喻翻譯的過程中,譯者身兼兩種文化的連接橋梁,既要考慮到源語作者的體驗(yàn)和思維,還要考慮譯語讀者的思維和體驗(yàn),譯者對(duì)隱喻的成功翻譯就是讓源語作者和譯語讀者的認(rèn)知相協(xié)調(diào),找到一個(gè)平衡點(diǎn)。這時(shí),源語作者與譯語讀者之間是否有相同經(jīng)歷體驗(yàn)和思維認(rèn)知模式就成為十分關(guān)鍵的因素。下面從兩個(gè)方面來論述。

2.3 舌背組織病理學(xué)觀察

處理后48 h 鏡下觀察小鼠舌體組織縱向切片。經(jīng)HE 染色，對(duì)照組可見上皮組織不同程度增厚且上皮釘突不規(guī)則，上皮淺層可見中性粒細(xì)胞浸潤，個(gè)別位置微小膿腫形成。光活化組較對(duì)照組上皮結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見明顯微小膿腫。經(jīng)PAS 染色，對(duì)照組可見大量菌絲，長桿形或串珠狀菌絲侵入上皮淺表，光活化組菌絲數(shù)量明顯少于對(duì)照組，偶見菌絲侵入角化層，但未深入上皮層（圖2）。

（六）適時(shí)補(bǔ)料 母豬的泌乳量于分娩后逐漸增加，至21 d左右達(dá)到泌乳高峰，后逐漸下降，哺乳仔豬生長迅速，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需求與日俱增，母豬的奶水已不能滿足需要，對(duì)哺乳仔豬必須進(jìn)行補(bǔ)料，提前補(bǔ)料具有促生長的作用。仔豬由于牙床發(fā)癢而啃咬硬物或拱掘地面，常引起下痢，提前補(bǔ)料有益于保健。仔豬開食早，哺乳期間日采食飼料量高，增重亦快，據(jù)報(bào)道，7日齡訓(xùn)練仔豬吃料，30日齡日采食量為0.24 kg，14日齡訓(xùn)練吃料，30日齡日采食量為0.18 kg；7日齡訓(xùn)練吃料，60日齡個(gè)體重15.0 kg，20日齡訓(xùn)練吃料，60日齡個(gè)體重13.5 kg，30日齡訓(xùn)練吃料，60日齡個(gè)體重10.0 kg。

3 討 論

念珠菌（

）是一種常見共生菌，口腔微生物中占比高達(dá)75%，其中白色念珠菌（

）是最常見、毒力最強(qiáng)的念珠菌

。念珠菌常寄生于人體皮膚、口腔和陰道等處，具有條件致病性。健康人可帶有念珠菌但不發(fā)病，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或微生態(tài)環(huán)境失調(diào)時(shí)，非致病性念珠菌可轉(zhuǎn)化為致病性念珠菌，并引起局部組織念珠菌病、系統(tǒng)感染，更有甚者危及生命

。

口腔念珠菌病是一種以白色念珠菌為主導(dǎo)致的口腔黏膜淺層感染性疾病，可發(fā)生于任何年齡，常見于長期使用激素

、HIV 感染者和免疫缺陷患者等。近年來，由于廣譜抗生素及免疫抑制劑應(yīng)用增多、糖尿病

及免疫功能缺陷癥患者增加等原因，導(dǎo)致口腔白色念珠菌病的發(fā)病率逐年增高

。國內(nèi)外已有研究對(duì)口腔念珠菌病，尤其是急性假膜型念珠菌性口炎模型進(jìn)行探索，雖然方法略有差異，但都成功建立了小鼠模型，許多研究者借鑒此種模型評(píng)價(jià)抗真菌藥物或抗真菌光動(dòng)力療法的療效

。本研究基于以往的研究方法，成功建立了舌部急性假膜型念珠菌性口炎模型，小鼠未發(fā)生系統(tǒng)感染。

目前，臨床治療口腔念珠菌病多采用局部或全身使用抗真菌藥物（如唑類藥物、制霉菌素等），但是隨著抗真菌藥物應(yīng)用日益增加，念珠菌的耐藥性也逐漸顯現(xiàn)，并且限制了對(duì)該疾病的治療效果

。這無疑給口腔念珠菌病的治療帶來了新的挑戰(zhàn)。探索一種有效且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，即使對(duì)耐藥的白色念珠菌引起的反復(fù)感染也具有療效的臨床治療方法顯得尤為迫切。

PAD 技術(shù)是在有氧條件下，向組織或活細(xì)胞外加入光敏劑，使光敏劑與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁選擇性結(jié)合，光敏劑通過特定波長的光激發(fā)產(chǎn)生高活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）來攻擊靶細(xì)胞，滅活這些組織細(xì)胞或微生物，從而達(dá)到治療目的的方法

。自1984 年Bertoloni 等發(fā)現(xiàn)可用PAD 殺滅細(xì)菌以來，PAD 的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。目前，PAD 在抗微生物方面的應(yīng)用成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，尤其是在局部抗感染方面日益顯示出其優(yōu)勢，同時(shí)在口腔臨床輔助診療中PAD 也獲得肯定的療效。

由于該技術(shù)不易使微生物產(chǎn)生耐藥性，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注PAD 在口腔黏膜病治療尤其是口腔念珠菌病治療方面的效果。但既往的PDT治療口腔念珠菌病研究中，光敏劑孵育時(shí)間和光照時(shí)間較長。如：血卟啉衍生物需要孵育30 min光照20 min

，二氫卟吩e6 需要孵育20 min 光照14 min

，這對(duì)該技術(shù)應(yīng)用于口腔臨床診療造成一定難度。

體外研究發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)O（toluidine blue O，TBO）介導(dǎo)的抗菌光動(dòng)力化療可以達(dá)到抑制白色念珠菌生物膜形成、降低生物膜活性的效果，提高光敏劑濃度會(huì)增強(qiáng)對(duì)白色念珠菌的抑制作用

，也有學(xué)者提出高濃度TBO 介導(dǎo)的PAD 無需保持長時(shí)間的孵育即可對(duì)病灶產(chǎn)生殺滅效果

。體內(nèi)研究證明甲苯胺藍(lán)僅分布于感染的炎癥組織，不能穿透正常組織，延長滲透時(shí)間仍無明顯變化，正常組織不受PAD 的殺傷。甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力治療不僅能有效殺滅致病菌，且對(duì)正常組織毒副作用小，針對(duì)口腔相關(guān)感染的治療安全、有效

。

本研究采用的儀器為PAD

Plus 儀，該儀器輸出功率有500 mW 和750 mW 兩檔，為LED 光源，能發(fā)出635 nm 波長紅光，光敏劑是成品的甲苯胺藍(lán)溶液，濃度固定為1 mg/mL，無需自配，操作簡便。635 nm 的紅光與甲苯胺藍(lán)高度匹配。相較PAD 治療口腔念珠菌病的以往研究，本研究采用的甲苯胺藍(lán)濃度更高，光照功率更大，理論上孵育時(shí)間和光照時(shí)間更短。鑒于該P(yáng)AD 技術(shù)在齲病窩洞消毒時(shí)孵育60 s，500 mW 光照60 s；在根管消毒時(shí)孵育60 s，750 mW 光照120 s；在牙周袋消毒時(shí)孵育60 s，750 mW 光照60 s，因此本研究初步嘗試采用孵育1 min，750 mW 光照1 min 的參數(shù)。本研究結(jié)果顯示，PAD 處理后即刻，光活化組的舌背真菌載量明顯低于對(duì)照組。PAD 處理后48 h，光活化組的舌背真菌載量仍低于對(duì)照組。PAD 處理后48 h 與即刻相比，光活化組小鼠舌背真菌載量雖然有所升高但仍低于對(duì)照組；而且舌部組織病理學(xué)顯示處理48 h 后光活化組較對(duì)照組上皮釘突排列整齊，中性粒細(xì)胞較少，未見到明顯的微小膿腫，菌絲明顯減少，偶見菌絲侵入角化層，但未深入上皮層。說明白色念珠菌雖然載量有所回升但真菌可能主要處于定植而非感染狀態(tài)，真菌可能多為孢子相，有待進(jìn)一步證實(shí)。相較于既往研究，本方法處理時(shí)間短，在臨床操作中會(huì)有更高的便捷性和實(shí)用性。

雖然本研究采用的方法對(duì)小鼠舌背白色念珠菌清除效果較明顯，但并未完全清除，這可能與白色念珠菌生物膜較菌液狀態(tài)更難殺滅有關(guān)

。白色念珠菌具有強(qiáng)大的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)，能提高其生存能力及毒力水平，幫助其適應(yīng)各種環(huán)境變化，從而逃避宿主的免疫壓力

。也有可能與真核物種（白色念珠菌）與原核細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化膿性鏈球菌等）對(duì)光動(dòng)力抗菌的敏感性不同有關(guān)，真核生物的敏感性相對(duì)較低

。結(jié)合靶點(diǎn)理論分析，白色念珠菌體積大，約是一般細(xì)菌體積的25～50 倍

，每個(gè)細(xì)胞可能含有更多的靶標(biāo)。光動(dòng)力殺傷細(xì)菌是一種單次攻擊過程，而殺滅白色念珠菌可能需要多次攻擊效果會(huì)更好，因此在進(jìn)一步的研究中可以嘗試設(shè)定多次處理模式，同時(shí)通過改善機(jī)體的低免疫狀態(tài)從而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然，本研究也存在一些局限性，鑒于基于PAD

Plus 的PAD 技術(shù)尚無應(yīng)用于體內(nèi)抗白色念珠菌的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)暫只設(shè)置了陰性對(duì)照組，初步探索該技術(shù)在體內(nèi)清除白色念珠菌的有效性，后續(xù)研究將進(jìn)一步開展與相關(guān)藥物療效對(duì)比研究。

鉻是人體的微量營養(yǎng)元素，但鉻的缺乏或過量都將對(duì)人體和動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重危害。土壤為鉻污染物的主要富集體，當(dāng)鉻含量超過一定的限度及土壤的容量，就會(huì)影響土壤微生物的活動(dòng)和土壤酶活性，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生危害[19]。

【Author contributions】 Gu Y，Liu N performed the experiments and wrote the article. Wang JN，Zhang LF directed the data collection and analysis. Liu Q designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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