鈦表面不同硅烷偶聯(lián)c（RGDfK）環(huán)肽的表征及生物相容性分析

鈦的骨結(jié)合能力與表面結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成密切相關(guān)，對(duì)鈦金屬進(jìn)行表面處理及負(fù)載涂層，可改變鈦表面的微觀結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，從而提高細(xì)胞早期黏附和成骨分化水平

。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）多肽是一種有效且常用的刺激細(xì)胞黏附的肽序列，被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使骨組織再生

。以往研究中，學(xué)者以硅烷偶聯(lián)的方式形成了鈦-硅烷-RGD 多肽的三層結(jié)構(gòu)，證實(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖以及成骨分化

。硅烷種類繁多，尤其是末端基團(tuán)的不同可能給硅烷提供不同的化學(xué)活性，然而尚未見(jiàn)研究對(duì)比鈦表面以不同末端基團(tuán)的硅烷偶聯(lián)RGD 多肽的效率及所實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞活性。本研究使用氨基、巰基、氯基、烯酰氧基4 種不同末端的硅烷，即3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、3-氯丙基三乙氧基硅烷（3-chloropro-pyltriethoxysilane，CPTES）、3-巰基丙基三甲氧基硅烷（3-mercaptopropyltriethoxysilane，MPTS）、3-異丁烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-MPS）作為偶聯(lián)劑將c(RGDfK)環(huán)肽固定于鈦表面，對(duì)各組的化學(xué)結(jié)合進(jìn)行表征分析，并對(duì)比其對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞黏附、增殖及分化的影響。

最近，紹興市經(jīng)濟(jì)和信息化委員會(huì)公布了2018年紹興市“隱形冠軍”企業(yè)名單，浙江力普粉碎設(shè)備有限公司榜上有名。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，中國(guó)），鈦片（陜西盛輝鈦業(yè)有限公司，中國(guó)），APTES、CPTES、MPTS、γ-MPS（麥克林，中國(guó)），c（RGDfK）（合肥國(guó)肽生物科技有限公司，中國(guó)），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（白鯊，中國(guó)），胎牛血清（Cell Sciences，美國(guó)），青霉素/鏈霉素溶液（Gibco，美國(guó)），α-MEM（α-minimum essential medium，α-MEM）培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）（Apexbio，美國(guó)），鬼筆環(huán)肽（Apexbio，美國(guó)），CCK-8 試劑盒（Dojindo Molecular Technology，Kumamoto，日本），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（南京建成，中國(guó)），BCA（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，中國(guó)），接觸角計(jì)（SL250，Kino Industry，Boston，MA，美國(guó)），X 射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）（Escalab 250xi，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（MAIA3 TESCAN，捷克），激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）（LSM 780，CalZeiss AG，德國(guó)），酶標(biāo)儀（PerkinElmer，Waltham，MA，美國(guó)）。

1.2 涂層制備方法

加工24 枚直徑30 mm、厚1 mm 的圓形鈦片以及48 枚直徑5 mm、厚1 mm 的圓形鈦片。所有鈦片用400 目、800 目、1 200 目、2 000 目研磨用碳化硅紙依次進(jìn)行機(jī)械拋光。拋光后，用丙酮、乙醇和超純水依次超聲清洗15 min，60 ℃烘干后置于干燥皿中保持干燥。

鈦片分組處理（直徑30 mm 鈦片每組4 個(gè)，直徑5 mm 鈦片每組8 個(gè)）：①NT 組，鈦片表面不做處理，空白對(duì)照組；②OH 組，堿熱處理，即10 mL 60 ℃的5 mol/L NaOH 溶液中浸泡24 h，超純水沖洗兩遍，37 ℃干燥

；③OHAP 組，堿熱處理后，在50 mL 5%APTES 的無(wú)水乙醇溶液中常溫避光浸泡24 h，隨后取出，無(wú)水乙醇中超聲清洗15 min 以去除物理吸附的硅烷顆粒，37 ℃干燥，在110 ℃下固化1 h

；④OHCP 組，堿熱處理，使用CPTES 與OHAP組同法做硅烷化處理；⑤OHMPT 組，堿熱處理，使用MPTS與OHAP組同法做硅烷化處理，硅烷處理后在1%戊二醛溶液中浸泡1 h，超純水沖洗，37 ℃干燥；⑥OHMPS 組，堿熱處理，使用γ-MPS 與OHAP 組同法做硅烷化處理。上述OHAP、OHCP、OHMPT、OHMPS 組鈦片分別處理后，高壓蒸汽滅菌，然后浸入4 ℃的0.1 mg/mL c（RGDfK）肽/PBS 溶液中15 h，取出后PBS 清洗，常溫干燥。細(xì)胞培養(yǎng)之前，所有樣本均紫外消毒，并用PBS 沖洗。

1.3 表面處理的表征分析

1.3.1 表面潤(rùn)濕性能 各組隨機(jī)選取直徑30 mm鈦片1 枚，以1 μL 去離子水為檢測(cè)液，使用接觸角計(jì)測(cè)量中心點(diǎn)的接觸角。

1.3.2 X 射線光電子能譜（XPS）分析 隨機(jī)選取直徑5 mm 鈦片1 枚，XPS 評(píng)估表面硅烷化及c（RGDfK）連接情況。在225 W 下用單色AlKa 輻照（1 486.7 eV）進(jìn)行測(cè)量，入射角為90°。使用XPSPEAK41 軟件進(jìn)行光譜分析，評(píng)估Si2p、Cl2p、C1s、N1s、titanium2p、O1s 的強(qiáng)度。

激光共聚焦掃描顯微鏡觀察6 組鈦試件與MC3T3-E1 細(xì)胞共培養(yǎng)6 h 后的細(xì)胞黏附情況（圖4），可見(jiàn)NT 組細(xì)胞鋪展不佳，呈長(zhǎng)梭形，未觀察到明顯的細(xì)胞偽足。OH 組、OHAP 組、OHCP 組、OHMPT 組、OHMPS 組細(xì)胞鋪展呈圓形，見(jiàn)較多細(xì)胞微絲；其中，OHAP 組的鈦片細(xì)胞鋪展最好，偽足伸展最為充分。

1.4 細(xì)胞行為

根據(jù)酰胺-N/Ti 元素比，OHMPS 組負(fù)載c（RGD）fK 環(huán)肽稍高于OHCP 組及OHMPT 組，但遠(yuǎn)未達(dá)到該組硅烷負(fù)載率的優(yōu)勢(shì)，OHAP 組結(jié)合的c（RGD）fK 含量最少。

1.4.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將直徑為5 mm 的鈦片樣品置于96 孔板中，每組1 個(gè)，以3 000 個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞。培養(yǎng)6 h 后，將黏附在鈦片表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，然后在室溫下用0.5%Triton X-100 在PBS 中通透15 min，用DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。使用CLSM 觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將直徑為5 mm 的鈦片樣品置于96 孔板中，每組5 個(gè)，以3 000 個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞。培養(yǎng)7 d 后使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖率。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度值。以含有CCK-8溶液但沒(méi)有接種細(xì)胞的孔為空白對(duì)照。

2016年底，云南建設(shè)完成1個(gè)統(tǒng)籌全省服務(wù)資源的樞紐服務(wù)平臺(tái)、16個(gè)州市綜合服務(wù)窗口平臺(tái)和13個(gè)重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)集群（行業(yè)）專業(yè)窗口服務(wù)平臺(tái)的網(wǎng)絡(luò)體系。兩年來(lái)平臺(tái)累計(jì)帶動(dòng)1398家服務(wù)機(jī)構(gòu)，其中有近330家服務(wù)機(jī)構(gòu)在平臺(tái)網(wǎng)絡(luò)在線系統(tǒng)通過(guò)發(fā)布服務(wù)信息、開(kāi)展線上服務(wù)等方式，為全省中小微企業(yè)不同發(fā)展階段提供全方位服務(wù)支撐。每年依托各州市中小企業(yè)“窗口”服務(wù)平臺(tái)，重點(diǎn)圍繞政策解讀、信息發(fā)布、創(chuàng)業(yè)輔導(dǎo)、技術(shù)支撐、互動(dòng)對(duì)接、展覽展示、創(chuàng)新論壇等內(nèi)容，采取形式多樣、種類豐富的方式集中開(kāi)展了“雙創(chuàng)”活動(dòng)。

增殖率（%）＝（各實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值-空白孔吸光度平均值）/（無(wú)材料只有細(xì)胞組吸光度平均值-空白孔吸光度平均值）× 100%

使用SPSS 22，對(duì)上述接觸角測(cè)量、細(xì)胞增殖、ALP 活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在方差齊性條件下采用單因素方差分析和LSD-

檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估組間差異，以

＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4.4 ALP 活性檢測(cè) 將直徑為30 mm 的鈦片樣品置于6 孔板中，每組3 個(gè)，以8 × 10

個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞，7 d 后，使用ALP 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP 活性，并使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)的蛋白總量作為標(biāo)準(zhǔn)。

OHAP、OHCP、OHMPS 組N 元素峰呈現(xiàn)出兩種組分，為399.8～400.2 eV 及401～402 eV，分別對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)中酰胺鍵和伯胺

，各組中酰胺鍵的含量為83%～88%，而OHMPT 組N 元素中均為酰胺鍵成分（圖3）。

2 結(jié) 果

2.1 處理表面的表征分析

SEM 觀察顯示，拋光的鈦片呈光滑表面，堿熱處理在鈦片表面形成了海綿狀三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小約為100～200 nm，接枝各種硅烷及c（RGDfK）環(huán)肽使部分孔隙被填滿（圖1）。

XPS 結(jié)果顯示，堿熱處理后鈦表面O 元素增加，證明活化后大量羥基成功負(fù)載于鈦表面，負(fù)載硅烷及c（RGDfK）環(huán)肽后Si、N 元素含量增加，提示硅烷及多肽的有效連接（表1）。Si/Ti 值結(jié)果提示OHMPS 組硅烷的負(fù)載量相對(duì)于其他三種硅烷高數(shù)倍，提示γ-MPS 與活化后鈦表面的結(jié)合能力最強(qiáng)。

1) 當(dāng)r=2時(shí),由定理5知，Pn滿足二階常系數(shù)齊次線性差分方程相應(yīng)的特征方程為特征根為由引理2得差分方程的通解為

接觸角測(cè)量結(jié)果顯示，拋光的鈦片接觸角超過(guò)90°，提示并非親水性表面；堿熱處理后的多孔結(jié)構(gòu)使接觸角急劇降低，呈現(xiàn)極親水的狀態(tài)；而進(jìn)一步接枝硅烷及多肽后，各組水接觸角則均有不同程度的回升，其中OHMPS 組的接觸角回升最多（

＝0.142；OHAP 組：

＜0.05；OHCP 組：

＜0.05；OHMPT 組：

＜0.05；OHMPS 組：

＜0.05）（圖2）。

深圳港在2014年率先出臺(tái)“綠色航運(yùn)”補(bǔ)貼政策，對(duì)于使用低硫油的船舶每年補(bǔ)貼2億元人民幣。其中，船舶使用硫含量0.1%～0.5%m/m燃油，政府補(bǔ)貼低硫油和重油差價(jià)的75%；船舶使用硫含量≤0.1%m/m燃油，政府補(bǔ)貼低硫油和重油差價(jià)的100%。政策出臺(tái)以來(lái)，深圳“綠色港口”建設(shè)成效顯著。截至2017年6月底，深圳港已有7643艘次遠(yuǎn)洋船舶靠泊期間使用低硫燃油，減排硫氧化物約2873.9噸，減排氮氧化物約230.3噸，減排PM2.5污染物約273.7噸。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的α-MEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃含5% CO

的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測(cè)ALP 活性時(shí)，細(xì)胞在添加50 μg/mL抗壞血酸、10 Mm β-甘油磷酸鹽和10nM 地塞米松的上述培養(yǎng)基中孵育以誘導(dǎo)成骨分化。

2.2 細(xì)胞黏附性比較

1.3.3 表面形貌 每組挑選1 枚直徑5 mm 鈦片噴金，SEM 在二次電子模式下觀察，工作電壓20 kV，工作距離（5.425 ± 0.5）mm。

2.3 細(xì)胞增殖情況比較

MC3T3-E1 細(xì)胞與鈦試件共培養(yǎng)7 d 后，OHAP、OHMPT、OHMPS 組均顯示出良好的增殖潛力，與NT 組相比有顯著差異（

＝0.089；OHAP 組：

＝0.013；OHMPT 組：

＝0.002；OHMPS 組：

＝0.025）（圖5）。OHMPT 組增殖活性最好。OH 組和OHCP 組與NT 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OH 組：

＝0.934；OHCP 組：

＝0.139）。

2.4 細(xì)胞成骨活性比較

各組鈦片表面接種MC3T3-E1 細(xì)胞并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7 d 的ALP 活性如圖6 所示，可以發(fā)現(xiàn)各種硅烷-c（RGDfK）環(huán)肽處理組均促進(jìn)了細(xì)胞ALP 的表達(dá)，其中，OHAP、OHMPT、OHMPS 組的相對(duì)表達(dá)量較高，與NT 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＝0.051，OHAP 組：

＝0.002；OHMPT 組：

＝0.007；OHMPS 組：

＝0.001），而OH 組、OHCP 組較NT 組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OH 組：

＝0.173，OHCP 組：

＝0.167）。

3 討 論

RGD 多肽是生物材料領(lǐng)域中研究最為廣泛的功能性多肽之一，其在纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中檢測(cè)出，且證實(shí)其能與細(xì)胞膜上多種整合素特異性識(shí)別，是人體內(nèi)廣泛存在并使用的肽序列

。在許多實(shí)驗(yàn)中，RGD 多肽在促進(jìn)多種細(xì)胞類型與不同材料的結(jié)合方面有效，目前RGD 多肽在研究中的應(yīng)用主要在于和多種活性物質(zhì)共同作用、改善材料表面生物性能，也有研究將其用于靶向藥物載體的制備。人工合成的環(huán)肽較線肽有更好的抗酶解能力和熱穩(wěn)定性，應(yīng)用前景更廣

。

對(duì)材料進(jìn)行表面活化，運(yùn)用偶聯(lián)劑改性，進(jìn)而負(fù)載多肽涂層是將多肽結(jié)合于鈦表面的常用方法

。本研究中，首先按照文獻(xiàn)［7］中的方法，對(duì)鈦表面進(jìn)行堿熱處理，強(qiáng)堿對(duì)鈦的腐蝕作用使得鈦表面形成亞微米級(jí)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔洞，可以提高金屬表面潤(rùn)濕性。DAPI 及鬼筆環(huán)肽染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察證實(shí)堿熱處理也可以一定程度改善材料表面的細(xì)胞黏附。堿熱處理還使鈦表面負(fù)載了大量羥基，為利用硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)一步進(jìn)行表面改性提供了化學(xué)基礎(chǔ)

。硅烷中的甲氧基或乙氧基水解后，可與堿熱活化表面上的羥基發(fā)生縮聚反應(yīng)，形成Ti-O-Si 鍵，彼此之間在加熱后也可形成Si-O-Si 鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定連接

。本實(shí)驗(yàn)中，可能由于堿熱處理后部分孔隙較大，負(fù)載硅烷后呈現(xiàn)出部分孔隙被填滿、部分孔隙未能填滿的不完整的膜結(jié)構(gòu)，這可能對(duì)硅烷涂層的強(qiáng)度有所影響，但堿熱處理后的亞微米結(jié)構(gòu)得以保留。考慮到c（RGDfK）僅是由五個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量較小，其與硅烷結(jié)合后難以通過(guò)掃描電鏡觀察到其結(jié)構(gòu)，填滿孔隙的結(jié)構(gòu)主要是聚合后的硅烷。其中，各組之間的孔隙填滿的形態(tài)略有不同，這可能和不同末端基團(tuán)的硅烷在鈦表面的聚合方式差異有關(guān)。

硅烷的另一端為活性基團(tuán)，可與c（RGDfK）反應(yīng)。OHAP 組中，主要依靠氨基與c（RGDfK）中羧基的靜電相互作用以及堿熱處理后的表面多孔形貌將其固定；MPTS 組中，巰基與戊二醛的一側(cè)醛基反應(yīng)生成C-S 鍵，另一側(cè)醛基與c（RGDfK）的氨基反應(yīng)生成席夫堿

；CPTES 組中，來(lái)自CPTES 有機(jī)官能團(tuán)的氯原子是反應(yīng)的親電中心，c（RGDfK）中非結(jié)合部位的游離胺基是親核基團(tuán)，氯原子可以直接和氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)

；而γ-MPS 中的烯酰氧基可以和氨基發(fā)生氮雜Michael 加成反應(yīng)，乙烯基的雙鍵打開(kāi)，通過(guò)C-N 鍵相連。

XPS 結(jié)果證明c（RGDfK）結(jié)合于材料表面。本研究發(fā)現(xiàn)，MPTS、γ-MPS、CPTES 均結(jié)合了較多的c（RGDfK），其生物學(xué)性能較處理前有所改善，OHMPS 組負(fù)載c（RGDfK）環(huán)肽稍高于OHCP 組及OHMPT 組，但遠(yuǎn)未達(dá)到該組硅烷負(fù)載率的優(yōu)勢(shì)，可能是由于在溫和環(huán)境下γ-MPS 與c（RGDfK）反應(yīng)不活潑。而APTES 修飾后的鈦表面雖然固定的c（RGDfK）不多，但對(duì)細(xì)胞黏附性能的改善較γ-MPS 組反而更好。此前有學(xué)者認(rèn)為，人工合成RGD 多肽的促黏附效果與天然的有大量結(jié)合域蛋白相比較弱，在暴露于血清等有大量天然蛋白的溶液時(shí)，由于天然蛋白引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)，表面修飾的RGD 多肽對(duì)細(xì)胞黏附的影響并不明顯

。

當(dāng)孩子就診用藥物后，需要耐心等待藥物發(fā)揮作用，因?yàn)樗幬镌谘褐羞_(dá)到一定濃度的時(shí)候才能發(fā)揮作用。不建議家長(zhǎng)反復(fù)去醫(yī)院就診，重復(fù)用藥，疊加用藥，致使藥物在孩子體內(nèi)蓄積，引發(fā)不良反應(yīng)；或者不等藥物發(fā)揮作用就停藥而換另一種藥物。頻繁換藥反而容易造成疾病遷延不愈，尤其是一些細(xì)菌感染的疾病，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

本研究中，除OHCP 組外，硅烷偶聯(lián)c（RGDfK）處理后，細(xì)胞增殖和成骨分化活性均增強(qiáng)，OHMPT組、OHMPS 組、OHAP 組間沒(méi)有顯著差別。OHAP組雖然結(jié)合的c（RGDfK）較少，但其表面未反應(yīng)的硅烷末端在溶液中可水解為帶正電荷的NH

，這有利于蛋白質(zhì)的吸附，從而促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和成骨分化

。而OHCP 組表面殘留的硅烷末端水解后為帶負(fù)電的Cl

，這可以部分解釋該組生物學(xué)性能不佳的問(wèn)題。

(3)回?zé)嵯到y(tǒng)優(yōu)化成果顯示，隨著機(jī)組負(fù)荷率的下降，汽輪機(jī)熱耗和供電煤耗下降值隨之?dāng)U大，說(shuō)明基于0號(hào)高壓加熱器的回?zé)嵯到y(tǒng)適合大容量高參數(shù)機(jī)組的調(diào)峰需求。

基于以上分析，可以得出以下結(jié)論：MPTS、CPTES、γ-MPS 三種硅烷能夠作為偶聯(lián)劑將c（RGDfK）環(huán)肽結(jié)合于鈦表面，提供促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖和分化的作用，其中γ-MPS 偶聯(lián)c（RGDfK）環(huán)肽的效果最好，而MPTS、CPTES、γ-MPS 連接c（RGDfK）環(huán)肽后具有相似的生物學(xué)性能。

賽十娘說(shuō)著就哽咽起來(lái)，眼淚直往下掉。緩了一會(huì)兒，又接著說(shuō)：“飛機(jī)走遠(yuǎn)了，我翻過(guò)身，見(jiàn)我媽身上都是血，后背掀掉了一大塊。我媽當(dāng)時(shí)還冇斷氣，她拉著我的手，流著淚說(shuō)，娘再也護(hù)不了你了……你已經(jīng)十六了，娘是真想看著你成家啊……”

另外，“吃禁果”是男女之情的隱喻，摩西說(shuō)得過(guò)于委婉，可人們還是猜得出來(lái)，繁衍后代就等于生生不息，永遠(yuǎn)不死了。

【Author contributions】 Zhou QY designed the study，analyzed the data，wrote the article. Hong GY，Wu T assisted the performing of the experiments. Chen C，Xie HF designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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