• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)突變與大白豬繁殖性能的關(guān)系

    2022-04-06 02:06:56王玲芳李尚來李琦琦杜星吳望軍宋奔馳李齊發(fā)
    關(guān)鍵詞:白豬內(nèi)含子顆粒細(xì)胞

    王玲芳,李尚來,李琦琦,杜星,吳望軍,宋奔馳,李齊發(fā)*

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.宿豫區(qū)正博生豬養(yǎng)殖場,江蘇 宿遷 223800)

    轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)是一種多功能生長因子,是TGF-β超家族中被研究最為廣泛的一員,以細(xì)胞類型依賴性方式調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性,例如特異性地影響細(xì)胞活力、凋亡、增殖、分化、黏附、遷移和上皮-間充質(zhì)化等[1-4]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1在各種正常的組織、細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中均存在,且在卵巢組織中表達(dá)量較高[5]。TGF-β1在哺乳動(dòng)物卵巢組織的多種細(xì)胞中均有表達(dá),如卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和各級卵泡的卵泡膜細(xì)胞,并在卵泡液中檢測到TGF-β1蛋白的存在[2,6]。TGF-β1可調(diào)節(jié)各種卵巢功能,包括類固醇激素合成、卵泡發(fā)育和黃體功能[7]。例如,TGF-β1可抑制人黃體化顆粒細(xì)胞凋亡[8]。TGF-β1還參與顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間相互交流,在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要作用[9]。卵泡液中TGF-β1可以促進(jìn)排卵、受精和早期胚胎發(fā)育,并能抑制顆粒細(xì)胞生長[6]。TGF-β1在豬黃體化顆粒細(xì)胞中可顯著抑制促黃體素誘導(dǎo)的孕酮升高[10]。TGF-β1與母豬繁殖性能關(guān)系密切,研究發(fā)現(xiàn)妊娠母豬血漿中TGF-β1濃度與繁殖性能有關(guān)[11]。另外,TGF-β1基因突變位點(diǎn)多態(tài)性與母豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)[11-12]。吳艷萍[11]利用SSCP技術(shù)在大白豬、長白豬、皮特蘭豬、圣特西豬和二花臉豬等豬種TGF-β1基因中發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變位點(diǎn)[第4內(nèi)含子32核苷酸(nt)處C>T突變,第6內(nèi)含子179 nt處 G>A 突變和1 043 nt處C>T突變,3′-UTR 2 490 nt處G>A突變和2 494 nt處G>A突變],共形成2種單倍型CGCAA(記為A)和TATGG(記為K),關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)大白豬群體中KK型母豬的初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA型,兩者平均每胎相差1.02頭。為了進(jìn)一步研究TGF-β1基因多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)系,本文采用PCR和測序技術(shù)鑒定大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子全序列和突變位點(diǎn),分析突變位點(diǎn)多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)系,以及突變影響母豬繁殖性能的機(jī)制,以篩選可用于大白豬繁殖性狀分子育種的有效標(biāo)記。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    325頭大白母豬耳組織樣來自江蘇省康樂陽光豬場,記錄各胎繁殖性能:總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)、產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)、死胎數(shù)(NSW)和出生窩重(LW),共1 145條記錄。豬新鮮卵巢來自江蘇竹順生物科技有限公司。

    1.2 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中杜洛克豬TGF-β1基因組序列(GenBank ID:397078)和mRNA序列(GenBank ID:NM_214015.2),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由北京擎科生物有限公司合成。

    表1 本試驗(yàn)所用PCR引物

    1.3 PCR擴(kuò)增和測序

    采用苯酚/氯仿抽提法提取豬耳組織樣或卵巢組織樣基因組DNA,使用分光光度計(jì)(Thermo公司)測濃度后稀釋至50 ng·μL-1,置于-20 ℃冰箱保存,以用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、DNA模板1 μL、2 × VazymeLAmp?Master Mix(南京諾唯贊公司)10 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,退火15 s,72 ℃ 40 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離,切膠、回收,由上海生工生物有限公司測序。

    1.4 突變位點(diǎn)篩選、分型和關(guān)聯(lián)性分析

    以大白豬DNA混池(n=20)為模板,利用引物對P1(表1)擴(kuò)增和測定TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列,根據(jù)峰圖尋找潛在的突變位點(diǎn)。利用引物對P2(表1)對單個(gè)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序,確定突變位點(diǎn),再對大白豬群體(n=325)進(jìn)行分型。根據(jù)文獻(xiàn)[13]中的方法統(tǒng)計(jì)大白豬群體中突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率,利用SAS 9.2軟件(SAS Institute Inc)進(jìn)行突變位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析。

    1.5 克隆測序和序列分析

    從豬新鮮卵巢上直徑為3~5 mm卵泡中抽取卵泡液,分離顆粒細(xì)胞,加入1 mL TRizol試劑(Invitrogen司),用TRizol-氯仿法提取顆粒細(xì)胞總RNA。測定RNA濃度后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存在-20 ℃?zhèn)溆?。具體方法參考文獻(xiàn)[14]。利用引物對P3(表1)擴(kuò)增豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因編碼區(qū)序列,擴(kuò)增產(chǎn)物切膠、回收后,按文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行克隆并測序。利用在線軟件miRBase(http://www.mirbase.org/)預(yù)測潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn);通過Jaspar數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);利用在線軟件MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer2/)預(yù)測CpG島(CGI),參數(shù):序列長度>100 bp,CG含量>60%,觀察CpG數(shù)/預(yù)期CpG數(shù)>0.7。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列擴(kuò)增

    利用引物對P1(表1)對大白豬耳組織樣基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,結(jié)果得到單一清晰的條帶(圖1)。測序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與GenBank中杜洛克豬TGF-β1基因相應(yīng)序列的一致性為99.69%。

    圖1 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    2.2 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列分析

    大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列全長189 bp(圖2-A),序列中A、T、C、G堿基含量分別為13.23%、21.69%、39.15%和25.92%,其中A+T含量34.92%,C+G含量65.07%,可見C+G含量明顯大于A+T含量。序列比對發(fā)現(xiàn)大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列與杜洛克豬的一致性為98.94%,比后者多2個(gè)堿基。在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子序列的131~142 nt處發(fā)現(xiàn)一個(gè)由6個(gè)GT二核苷酸重復(fù)組成的微衛(wèi)星序列。利用生物信息學(xué)軟件對大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子上潛在的順式作用元件(cis-acting elements)進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果在這個(gè)區(qū)域預(yù)測到1個(gè)豬miRNA(ssc-miR-574-3p)結(jié)合位點(diǎn)和芳香烴受體(AHR)、Nrf2相關(guān)因子1(NRF1)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1A)等多個(gè)與雌性生殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。另外,利用在線軟件MethPrimer在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子32~132 nt處預(yù)測到1個(gè)CGI,長度101 bp,含有14個(gè)CpG位點(diǎn)(圖2-B)。

    圖2 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子核苷酸序列分析(A)和CpG島預(yù)測(B)

    2.3 大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子突變位點(diǎn)篩選

    以大白豬池DNA為模板,利用引物對P1(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序,在大白豬TGF-β1第4內(nèi)含子63~64核苷酸(nt)處發(fā)現(xiàn)1個(gè)2 bp序列(AC)的插入/缺失突變(圖3)。由于這個(gè)插入/缺失突變位于豬TGF-β1基因的8 666~8 667 nt處,因此命名為g.8666_8667delAC。但本試驗(yàn)并沒有檢測到武艷萍[11]在大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的32 nt處C>T突變。

    圖3 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC突變位點(diǎn)鑒定

    2.4 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性分析

    大白豬群體(n=325)TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)分型顯示大白豬群體中含有3種基因型,分別定義為ins/ins型、ins/del型和del/del型(圖4-A)?;蛐皖l率計(jì)算發(fā)現(xiàn)ins/ins基因型頻率最高(57.8%),在大白豬群體中為優(yōu)勢基因型(圖4-B)。等位基因型頻率計(jì)算結(jié)果顯示等位基因ins的頻率最高(76.2%),為優(yōu)勢等位基因(圖4-C)。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)大白豬群體中TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為0.36,為中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.250.05)。

    圖4 TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性分析

    2.5 g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性與大白豬繁殖性能關(guān)聯(lián)性分析

    關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示:ins/del基因型母豬的初產(chǎn)死胎數(shù)(NSB)顯著高于ins/ins基因型和del/del基因型母豬(P<0.05)(表2)。在所有胎次中,del/del基因型母豬的總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)比ins/ins基因型和ins/del基因型母豬每胎分別高0.47和0.46頭,雖未達(dá)到顯著水平(P>0.05),但每胎相差近0.50頭,在養(yǎng)豬實(shí)踐中也有一定的意義。

    表2 大白豬TGF-β1基因g.8666_8667delAC位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

    2.6 g.8666_8667delAC突變對TGF-β1基因mRNA剪接的影響

    內(nèi)含子突變往往通過改變順式作用元件影響基因轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性,或通過選擇性剪接影響基因的功能[15-16]。分析發(fā)現(xiàn)g.8666_8667delAC突變未引起大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子順式作用元件的改變(圖2-A)。為了分析g.8666_8667delAC突變對豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因選擇性剪接的影響,本試驗(yàn)分離了g.8666_8667delAC位點(diǎn)ins/ins基因型和ins/del基因型豬卵巢顆粒細(xì)胞,克隆測序發(fā)現(xiàn)同一基因型內(nèi)和不同基因型間卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因編碼區(qū)序列長度完全一致,說明g.8666_8667delAC突變對豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因選擇性剪接沒有影響。大白豬TGF-β1基因編碼區(qū)序列長度1 173 bp,與人、獼猴、牛、豬、綿羊和小鼠等哺乳動(dòng)物一樣,也由390個(gè)氨基酸殘基組成,同樣含有經(jīng)典的N-端疏水信號肽、潛伏相關(guān)肽和TGF-β樣結(jié)構(gòu)域(圖5)。大白豬TGF-β1蛋白氨基酸序列與杜洛克豬的同源性為100%,與人、獼猴、牛和小鼠等的同源性分別為94.36%、94.62%、94.62%和89.23%,說明哺乳動(dòng)物TGF-β1蛋白氨基酸序列比較保守。

    圖5 大白豬和哺乳動(dòng)物其他物種TGF-β1基因編碼蛋白氨基酸序列比對分析

    3 討論

    TGF-β1是一個(gè)重要的雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育命運(yùn)(成熟排卵或閉鎖退化)決定因子,影響雌性繁殖力[17-18]。在豬卵巢組織中,TGF-β1在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中高表達(dá),在體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中添加 TGF-β1 可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,抑制顆粒細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)雌激素(E2)和孕酮(P4)等類固醇激素的分泌[13,19-20]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),TGF-β1可調(diào)節(jié)豬卵巢顆粒細(xì)胞狀態(tài)(增殖或凋亡)相關(guān)信號通路如FoxO、TGF-β、Wnt、PIK3-Akt、p53和Ras等通路信號分子的表達(dá);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)多個(gè)已知的影響母豬繁殖性狀的候選基因,如胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3基因(IGFBP3)[21]和WNT家族成員10B基因(WNT10B)[22-23]等也是TGF-β1的下游靶基因。本文在TGF-β1基因第4內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的與大白豬繁殖性能顯著關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)g.8666_8667delAC,進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1基因是大白豬繁殖性狀的關(guān)鍵基因。但我們并未在研究的大白豬群體中發(fā)現(xiàn)前人鑒定的第4內(nèi)含子上的另一個(gè)突變位點(diǎn)。武艷萍[11]研究發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的32 nt處C>T突變位點(diǎn)與第6內(nèi)含子的179 nt處G>A突變和1 043 nt處C>T突變、3′-UTR的2 490 nt處G>A突變和2 494 nt處G>A突變的合并基因型與大白豬初產(chǎn)TNB顯著關(guān)聯(lián)。Du等[13]研究發(fā)現(xiàn) miR-130a 啟動(dòng)子區(qū)-573G>A、-540T>C位點(diǎn)與TGF-β1基因c.1583A>G位點(diǎn)合并基因型與大白豬NBA、NSB和LW顯著關(guān)聯(lián)。

    目前一些功能和作用機(jī)制被注釋的與家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn)主要為啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)和3′-UTR上的突變位點(diǎn)[13,24],而大量的內(nèi)含子區(qū)突變位點(diǎn)則很少被關(guān)注[25]。實(shí)際上,內(nèi)含子突變與宿主基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性和功能關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子可作為基因內(nèi)部啟動(dòng)子或增強(qiáng)子,這些內(nèi)含子突變可引起與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合力的變化,從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[26-27]。在海腎螢光素酶的開放閱讀框(ORF)中,插入人磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)基因的第6內(nèi)含子序列,可以增強(qiáng)海腎螢光素酶基因的表達(dá)[28]。Li等[25]在骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB(BMPR1B)基因第1內(nèi)含子中ESR1反應(yīng)元件(ERE)上發(fā)現(xiàn) 4個(gè)突變位點(diǎn),高繁殖力豬種特異的單倍型ERE與轉(zhuǎn)錄因子ESR1結(jié)合力強(qiáng),子宮中BMPR1B基因mRNA和蛋白表達(dá)水平高。另外,內(nèi)含子突變還通過影響基因的選擇性剪接來影響基因的功能[15-16],研究發(fā)現(xiàn)A型血友病患者F8基因中的內(nèi)含子突變c.6430_3C>G導(dǎo)致F8基因剪接效率低或剪接錯(cuò)誤,影響F8蛋白的正常功能[16]。本文研究發(fā)現(xiàn)g.8666_8667delAC突變未引起大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子上順式作用元件的改變,也不影響豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因的選擇性剪接。因此,g.8666_8667delAC位點(diǎn)突變影響大白豬繁殖性能的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

    綜上,本文獲得了大白豬TGF-β1基因第4內(nèi)含子全序列,發(fā)現(xiàn)了大量的順式作用元件,鑒定到1個(gè)新的小插入/缺失突變(g.8666_8667delAC),其多態(tài)性與大白豬繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián),證實(shí)TGF-β1基因是影響大白豬繁殖性狀的關(guān)鍵基因,其中del/del基因型是TNB的有利基因型,ins/del基因型母豬的NSB較高。另外,本文還證實(shí)第4內(nèi)含子的g.8666_8667delAC位點(diǎn)突變不是通過影響豬卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β1基因的選擇性剪接來影響繁殖性狀的。

    猜你喜歡
    白豬內(nèi)含子顆粒細(xì)胞
    Advanced ocean wave energy harvesting: current progress and future trends
    線粒體核糖體蛋白基因中內(nèi)含子序列間匹配特性分析
    MicroRNA調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞功能的研究進(jìn)展
    “晉汾白豬標(biāo)準(zhǔn)”成為國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
    大腿肌內(nèi)顆粒細(xì)胞瘤1例
    不同方向內(nèi)含子對重組CHO細(xì)胞中神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響
    更 正
    內(nèi)含子的特異性識(shí)別與選擇性剪切*
    補(bǔ)腎活血方對卵巢早衰小鼠顆粒細(xì)胞TGF-β1TGF-βRⅡ、Smad2/3表達(dá)的影響
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:22
    小雪花·小學(xué)生快樂作文(2017年1期)2017-03-24 19:30:56
    我的老师免费观看完整版| 成人亚洲精品av一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 在线播放国产精品三级| 亚洲国产精品成人综合色| 精品福利观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费av毛片视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费看十八禁软件| 欧美黑人欧美精品刺激| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产乱人伦免费视频| 脱女人内裤的视频| 老司机福利观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成年女人永久免费观看视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线a可以看的网站| 久久久久久久久中文| www.熟女人妻精品国产| 好男人在线观看高清免费视频| 淫秽高清视频在线观看| 色吧在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 两个人的视频大全免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 男女那种视频在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产精品精品国产色婷婷| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲av美国av| 国产真实伦视频高清在线观看 | 长腿黑丝高跟| 天堂√8在线中文| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 色视频www国产| 99久久无色码亚洲精品果冻| 丰满人妻一区二区三区视频av | 人人妻人人澡欧美一区二区| 99视频精品全部免费 在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人a区在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一级黄片播放器| 十八禁人妻一区二区| 超碰av人人做人人爽久久 | 久久香蕉国产精品| 亚洲av美国av| 午夜免费成人在线视频| 久久精品91蜜桃| 国产精品99久久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 99久久综合精品五月天人人| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲成人久久性| 欧美不卡视频在线免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 级片在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久色成人| 欧美乱妇无乱码| 日日干狠狠操夜夜爽| avwww免费| 999久久久精品免费观看国产| 在线观看66精品国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 99精品在免费线老司机午夜| 中文在线观看免费www的网站| 免费在线观看日本一区| 欧美日本视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 校园春色视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美高清成人免费视频www| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人av在线播放网站| 免费观看的影片在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 波多野结衣高清作品| 久久久久久久久大av| 亚洲真实伦在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲电影在线观看av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品99久久久久久久久| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品一区二区免费欧美| 精品人妻一区二区三区麻豆 | avwww免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 最好的美女福利视频网| av中文乱码字幕在线| 深夜精品福利| 成年女人永久免费观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 51国产日韩欧美| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日韩综合久久久久久 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲,欧美精品.| 老汉色av国产亚洲站长工具| www.999成人在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲片人在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 色在线成人网| 国产av在哪里看| 亚洲国产精品999在线| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩免费av在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费在线观看影片大全网站| 91字幕亚洲| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲激情在线av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美黑人巨大hd| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜精品在线福利| 亚洲人成电影免费在线| 麻豆国产av国片精品| 在线观看免费午夜福利视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品久久久com| 成人无遮挡网站| 久久亚洲真实| 国产精品 国内视频| 最后的刺客免费高清国语| 免费看十八禁软件| 俺也久久电影网| 性色avwww在线观看| 亚洲精华国产精华精| 丝袜美腿在线中文| 欧美激情在线99| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲成人久久性| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆成人av在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美区成人在线视频| 小说图片视频综合网站| av天堂中文字幕网| 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 五月伊人婷婷丁香| 啦啦啦免费观看视频1| 成人特级av手机在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲熟妇熟女久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久精品综合一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲欧美日韩东京热| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本五十路高清| 国产成年人精品一区二区| 香蕉丝袜av| 精品久久久久久久末码| 欧美色视频一区免费| 国产成人av教育| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产欧美网| av天堂中文字幕网| 午夜福利在线在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本免费a在线| 国产精品 国内视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产单亲对白刺激| 午夜久久久久精精品| 99精品在免费线老司机午夜| 日本熟妇午夜| 国产视频一区二区在线看| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一区福利在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美乱妇无乱码| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩欧美在线二视频| 国产在视频线在精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产伦精品一区二区三区四那| 中文资源天堂在线| 国内精品一区二区在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩人妻高清精品专区| 国产一区在线观看成人免费| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲精华国产精华精| 人妻久久中文字幕网| 国产精品电影一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美三级亚洲精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产三级黄色录像| 国产精品 国内视频| 操出白浆在线播放| 人妻久久中文字幕网| 两个人看的免费小视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美日韩综合久久久久久 | 美女免费视频网站| 日韩欧美三级三区| 免费观看人在逋| 国产淫片久久久久久久久 | 九色成人免费人妻av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产真实乱freesex| 午夜久久久久精精品| 少妇的逼水好多| 亚洲av五月六月丁香网| 91字幕亚洲| 午夜福利欧美成人| 天堂√8在线中文| 日本a在线网址| 成年人黄色毛片网站| 午夜激情福利司机影院| 99久久综合精品五月天人人| xxx96com| 中文字幕久久专区| 亚洲第一电影网av| 波多野结衣巨乳人妻| 白带黄色成豆腐渣| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩欧美三级三区| 免费观看人在逋| 青草久久国产| 少妇的丰满在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产熟女xx| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费看a级黄色片| 国产私拍福利视频在线观看| 天天添夜夜摸| 成人无遮挡网站| xxxwww97欧美| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 一a级毛片在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99riav亚洲国产免费| 国产av一区在线观看免费| 国产免费男女视频| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 最近在线观看免费完整版| 欧美一级a爱片免费观看看| 波野结衣二区三区在线 | 国产精品免费一区二区三区在线| 超碰av人人做人人爽久久 | 国产在视频线在精品| 一本综合久久免费| ponron亚洲| 美女黄网站色视频| 国产黄色小视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 成人国产一区最新在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 香蕉丝袜av| 午夜精品久久久久久毛片777| 天堂网av新在线| 国产精品久久久久久久电影 | 少妇人妻精品综合一区二区 | 在线观看舔阴道视频| 九九在线视频观看精品| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久精品大字幕| 精品不卡国产一区二区三区| eeuss影院久久| 午夜福利免费观看在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美在线黄色| 深爱激情五月婷婷| 狂野欧美激情性xxxx| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色吧在线观看| 国产真实乱freesex| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一个人看的www免费观看视频| 午夜福利欧美成人| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av女优亚洲男人天堂| 欧美大码av| 亚洲专区国产一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 精品久久久久久久末码| 国产精品久久久久久久久免 | 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品久久久久久久久免 | 天天躁日日操中文字幕| 久久草成人影院| 无限看片的www在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 无人区码免费观看不卡| 啦啦啦韩国在线观看视频| 91久久精品电影网| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线观看午夜福利视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜福利欧美成人| 天天躁日日操中文字幕| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品99久久久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲片人在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品久久久久久久久免 | 国产精品久久视频播放| 一进一出抽搐动态| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品91蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产日本99.免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 观看美女的网站| 国产97色在线日韩免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产av在哪里看| 天美传媒精品一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利高清视频| 淫秽高清视频在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 中文字幕高清在线视频| 91字幕亚洲| 国产精品精品国产色婷婷| 国产真实乱freesex| 99久久精品一区二区三区| av天堂在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 在线免费观看的www视频| 操出白浆在线播放| 18+在线观看网站| 国产av在哪里看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产三级中文精品| 天堂√8在线中文| 男插女下体视频免费在线播放| 首页视频小说图片口味搜索| 91在线观看av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美黑人巨大hd| 亚洲avbb在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成人国产综合亚洲| 国产精品av视频在线免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产久久久一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 99久久精品热视频| 免费观看的影片在线观看| 脱女人内裤的视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本黄色片子视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 十八禁网站免费在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99热这里只有是精品50| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 99精品在免费线老司机午夜| av欧美777| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久久久国产a免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 免费看光身美女| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美成狂野欧美在线观看| 丁香六月欧美| 午夜福利18| 高清毛片免费观看视频网站| 99久久精品一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情欧美在线| 手机成人av网站| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产视频一区二区在线看| 免费高清视频大片| 美女 人体艺术 gogo| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 热99在线观看视频| 欧美乱妇无乱码| netflix在线观看网站| 亚洲精品成人久久久久久| 免费看十八禁软件| 看免费av毛片| 村上凉子中文字幕在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久人妻av系列| 此物有八面人人有两片| 午夜福利在线观看吧| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 在线免费观看的www视频| 国产亚洲欧美98| 日本成人三级电影网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久草成人影院| 欧美最新免费一区二区三区 | 中文资源天堂在线| 国产欧美日韩一区二区三| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产午夜福利久久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 窝窝影院91人妻| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线观看舔阴道视频| 国产私拍福利视频在线观看| 国产日本99.免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩乱码在线| 九色国产91popny在线| 一级黄色大片毛片| 国产一区在线观看成人免费| 精品免费久久久久久久清纯| aaaaa片日本免费| 麻豆一二三区av精品| 大型黄色视频在线免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 麻豆成人午夜福利视频| 国产熟女xx| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人av教育| 老司机深夜福利视频在线观看| 色吧在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品欧美国产一区二区三| 国产视频一区二区在线看| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一本一本综合久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 成人特级av手机在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 最新中文字幕久久久久| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产美女午夜福利| 欧美最新免费一区二区三区 | 又紧又爽又黄一区二区| 我要搜黄色片| 久久久精品大字幕| 最新中文字幕久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 九九在线视频观看精品| 国产高清有码在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 制服人妻中文乱码| 久久99热这里只有精品18| 国产69精品久久久久777片| 国产爱豆传媒在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美丝袜亚洲另类 | а√天堂www在线а√下载| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线免费观看的www视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产69精品久久久久777片| 日本与韩国留学比较| 女人被狂操c到高潮| 午夜福利在线在线| 亚洲成人久久爱视频| 国内精品美女久久久久久| 俺也久久电影网| 欧美最新免费一区二区三区 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美三级亚洲精品| 午夜老司机福利剧场| 激情在线观看视频在线高清| 成人午夜高清在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 久久久国产精品麻豆| 脱女人内裤的视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成人三级黄色视频| av片东京热男人的天堂| 嫩草影视91久久| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品永久免费网站| eeuss影院久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日本黄色片子视频| www日本黄色视频网| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲天堂国产精品一区在线| 五月玫瑰六月丁香| 可以在线观看毛片的网站| 嫩草影院精品99| 99久久精品一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 一区福利在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美日韩福利视频一区二区| 全区人妻精品视频| 久久性视频一级片| 欧美三级亚洲精品| 日韩高清综合在线| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美日本视频| 88av欧美| 久久伊人香网站| 最新中文字幕久久久久| 精品久久久久久成人av| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成年免费大片在线观看| 国产野战对白在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产三级在线视频| 免费在线观看亚洲国产| 男女午夜视频在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产97色在线日韩免费| 亚洲自拍偷在线| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品久久久久久久久免 | 最近最新中文字幕大全电影3| www.色视频.com|