血清總膽紅素與非小細(xì)胞肺癌臨床相關(guān)性的初步分析*

王茜 吳建春 駱瑩濱 方志紅 李雁

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科（上海市200071）

肺癌是世界上發(fā)病率第二的惡性腫瘤，但死亡率卻長期居于第一位[1]。空氣中有害物質(zhì)和病原體等的侵害，導(dǎo)致肺部易受到慢性損傷和炎癥的傷害，這是肺癌發(fā)病率高的主要原因之一[2]。

氧化應(yīng)激是由活性氧類、DNA 氧化、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化所介導(dǎo)的一種常見生理過程[3]。由于致癌因子的刺激、代謝活動的增強以及線粒體損傷等因素，氧化應(yīng)激活動增加，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增多，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞面臨更大的ROS 壓力，氧化應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過ROS 介導(dǎo)的一系列氧化應(yīng)激活動，可以引發(fā)原癌基因和抑癌基因突變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]。然而，氧化應(yīng)激作用可以在抗氧化劑的處理下得到控制[5]。

一直以來，膽紅素被認(rèn)為是血紅素分解途徑的最終產(chǎn)物，生物活性有限，其濃度的升高往往是肝臟疾病的標(biāo)志。細(xì)胞通過膽紅素-膽綠素循環(huán)作用積極維持膽紅素在細(xì)胞內(nèi)的平衡。膽紅素的濃度主要取決于氧化壓力的程度，一方面通過線粒體Cyp2A5 進(jìn)行調(diào)節(jié)，另一方面通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1-A1）對膽紅素進(jìn)行葡萄糖醛酸化，導(dǎo)致膽紅素的水溶性增加并使其在膽汁中排泄[6]。膽紅素之所以被認(rèn)為是最有效的內(nèi)源性抗氧化劑，是因為其在體外和體內(nèi)都能產(chǎn)生保護(hù)性的脂質(zhì)過氧化[7]。有證據(jù)表明，膽紅素和膽紅素代謝的相關(guān)產(chǎn)物在一些細(xì)胞活動中具有重要作用，包括細(xì)胞生長、遷移、分化以及免疫反應(yīng)的調(diào)控等[8]。膽紅素已被證實能夠阻止腫瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。間接膽紅素和膽綠素是芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的強效內(nèi)源性激活劑，AhR 作為一種配體，激活的轉(zhuǎn)錄因子可以作用于各種基因，參與膽紅素的生物轉(zhuǎn)化和運輸[8,10]。AhR信號通路參與細(xì)胞凋亡、T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)[11-12]，其介導(dǎo)機(jī)制被證明有助于膽紅素的抗腫瘤作用[13]。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HMOX）和膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BLVR）是膽紅素代謝過程中的兩種關(guān)鍵酶，細(xì)胞內(nèi)膽紅素-膽綠素循環(huán)由HMOX1/2 啟動，并由BLVRA/B維持[8]。除產(chǎn)生膽紅素外，BLVRA 以及HMOX1 可以從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，以氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的方式激活多種信號通路[14-15]。膽綠素和BLVRA 還被證明可以調(diào)節(jié)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），PKC 是一種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的激酶[16]。因此，調(diào)節(jié)血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）及其代謝相關(guān)酶的水平或活性，可能成為預(yù)防或治療腫瘤的新手段。

目前，關(guān)于膽紅素在肺癌的臨床意義及其與腫瘤免疫的關(guān)系研究內(nèi)容有限。TBIL 是否與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，以及血清TBIL 是否通過炎癥細(xì)胞影響肺癌患者抗腫瘤免疫功能的研究報道較少。本研究旨在通過分析非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血清TBIL 與臨床病理特征的關(guān)系以及與炎癥細(xì)胞之間的相關(guān)性，探討其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年3月至2020年12月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院就診的NSCLC 患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)病理診斷（組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)）確診為腺癌或鱗癌；2）臨床資料相對完整；3）卡氏評分（Karnofsky，KPS）≥60 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）確診除肺癌外的其他惡性腫瘤；2）合并嚴(yán)重肝腎功能不全。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 記錄患者的臨床資料以及觀察指標(biāo)，包括年齡、性別、吸煙史、疾病史等一般資料，以及腫瘤相關(guān)病理特征，如腫瘤大小及數(shù)目、患病時間、腫瘤分期（采用第8 版TNM 分期系統(tǒng)）以及生活質(zhì)量評定（采用Karnofsky 評分表，按0～100 評分）；

1.2.2 觀察指標(biāo) 所有研究對象均在早晨空腹采集靜脈血，進(jìn)行血常規(guī)、生物化學(xué)指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物以及細(xì)胞免疫檢查。本研究記錄的數(shù)據(jù)為患者在本院第1 次就診時的檢驗結(jié)果。無病生存期（disease-free survival，DFS）通過電話或門診復(fù)診隨訪獲取。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料使用Kolmogorov-Smirnov 檢驗是否服從正態(tài)分布，服從正態(tài)分布采用±s表示，獨立樣本非參數(shù)t檢驗比較組間差異；非正態(tài)分布的用中位數(shù)M（P25，P75）表示，Mann-WhitneyU檢驗進(jìn)行組間比較。計數(shù)資料采用χ2檢驗。分類變量相關(guān)性分析采用Logistic 回歸分析，檢驗效能采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）下面積評估。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TBIL 水平與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

經(jīng)正態(tài)性檢驗，年齡、患病時間呈非正態(tài)性分布，其他均為計數(shù)資料，因此采用獨立樣本非參數(shù)t檢驗對332 例患者TBIL 水平及患者的臨床病理特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TBIL 在不同性別中表達(dá)存在差異，但在不同年齡段無顯著性差異。在有無吸煙史患者中，TBIL 無顯著性差異；在腫瘤病理特征中，TBIL 在有無淋巴浸潤、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及不同TNM 分期患者中呈顯著性差異（P＜0.05），但不同腫瘤大小以及患病時間中TBIL 無顯著性差異（P＞0.05）。TBIL 水平與肺癌患者臨床病理特征關(guān)系見表1。

2.2 Logistic 回歸分析腫瘤分期的相關(guān)危險因素

根據(jù)腫瘤TNM 分期將患者分為（Ⅰ+Ⅱ期）組和（Ⅲ+Ⅳ期）組，二元Logistic 回歸分析與其相關(guān)的危險因素。結(jié)果顯示：性別、年齡和病程與腫瘤分期無明顯相關(guān)性；代謝組學(xué)相關(guān)因素中，血清TBIL、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮水平與腫瘤分期顯著相關(guān)（P＜0.05）（表2）。通過ROC 曲線下面積評估TBIL 的檢驗效能，P＜0.05 時檢驗值有意義，其中，TBIL、白蛋白以及谷草轉(zhuǎn)氨酶與腫瘤分期的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

表2 二元Logitic 回歸分析腫瘤分期病情程度的影響因素

2.3 TBIL 與NSCLC 患者炎癥細(xì)胞的相關(guān)性分析

由于TBIL 在不同性別中差異分布，因此在男性和女性中分別進(jìn)行分析。根據(jù)約登指數(shù)計算截點值，其中，男性TBIL 水平截點值為13.85 μmol/L，女性TBIL 水平截點值為9.85 μmol/L。將患者分為TBIL 高水平組和TBIL 低水平組，在NSCLC 患者中，男性患者TBIL 低水平組（27.85%）的淋巴細(xì)胞比例均值低于高水平組（31.60%），TBIL 低水平組（2.35）的中心粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）中位數(shù)高于高水平組（1.76，P＜0.05）；女性患者中，低水平組（30.03%）的淋巴細(xì)胞比例均值TBIL 低于高水平組（32.85%），TBIL 低水平組的NLR、CD3、CD4 細(xì)胞比例均高于高水平組（P＜0.05，表3，4）。

表3 男性患者不同TBIL 水平炎癥細(xì)胞表達(dá)情況

2.4 TBIL 對早期NSCLC 患者DFS 的預(yù)后預(yù)測價值

TBIL 在早期肺癌中表達(dá)水平高于晚期患者，為驗證TBIL 是否能夠抑制肺癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，選取224 例早期NSCLC 術(shù)后患者進(jìn)行隨訪，采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗分析血清TBIL 對DFS 的預(yù)測價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常值范圍內(nèi)，當(dāng)女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 時，患者具有較好的預(yù)后（P＜0.05），但在男性患者中TBIL 水平與DFS 無顯著性相關(guān)（圖2）。

表4 女性患者不同TBIL 水平炎癥細(xì)胞表達(dá)情況

3 討論

膽紅素對于增加氧化壓力的疾病具有防御作用。在一項大型前瞻性隊列研究中，對2 662 例結(jié)直腸癌患者重復(fù)檢測肝功能指標(biāo)，并持續(xù)10年隨訪。該研究結(jié)果顯示，血清TBIL 水平是影響結(jié)直腸癌發(fā)展和預(yù)后的獨立因素，較高的血清TBIL 水平與較低的大腸癌風(fēng)險有關(guān)[17]。Horsfall 等[18]針對英國生物庫中的成年人開展了一項大規(guī)模孟德爾隨機(jī)法研究，結(jié)果顯示循環(huán)TBIL 每增加5 μmol/L，肺癌總發(fā)病率就會減少1.2/10 000 人/年。除此以外，在胃癌[19]、乳腺癌、心血管疾病[20]、胰腺炎[21]、代謝綜合征以及呼吸系統(tǒng)疾病[22]中，均有證據(jù)表明較高水平TBIL 可以降低患病風(fēng)險，并與良好的預(yù)后有關(guān)，這種結(jié)果可能與膽紅素的抗氧化能力有關(guān)。臨床上將膽紅素用于肝功能評估，在肝細(xì)胞癌患者中，常用白蛋白-膽紅素（albumin-bilirubin，ALBI）評分評估患者肝功能障礙嚴(yán)重程度，ALBI 較高提示肝功能障礙。近年來多項研究報道，ALBI 與其他惡性腫瘤的預(yù)后可能存在一定關(guān)聯(lián)，如術(shù)前ALBI 評分與CA199 聯(lián)合可作為胰腺癌預(yù)后的一項預(yù)測指標(biāo)[23]。TBIL 有助于篩查和預(yù)防血管病變，避免發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，臨床中也將TBIL 認(rèn)為是糖尿病血管并發(fā)癥的一個保護(hù)性因素[24]。

本研究中男性的中位數(shù)TBIL 水平為13.1 μmol/L，高于女性中位數(shù)TBIL 水平12.3 μmol/L，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。這是由于男性的雌激素水平較低以及紅細(xì)胞周轉(zhuǎn)率較高，男性的TBIL 水平通常高于女性[25]。眾所周知，吸煙是導(dǎo)致肺癌的主要原因，香煙煙霧中的自由基和氧化劑對DNA 的氧化損傷是導(dǎo)致肺癌發(fā)展的主要途徑之一[26]。吸煙與血清TBIL 之間呈負(fù)相關(guān)，吸煙引起的炎癥反應(yīng)和抗氧化過程能夠消耗膽紅素[27]。研究發(fā)現(xiàn)有吸煙史的人群中TBIL＞17 μmol/L 的人群比TBIL＜5 μmol/L 的人群肺癌發(fā)病率低[18]。本研究中有吸煙史的肺癌患者中位數(shù)TBIL 高于無吸煙史者，但無顯著性差異?？紤]是因為本次納入有吸煙史的病例僅77 例，占總樣本量的23.2%，樣本量偏差導(dǎo)致本次結(jié)果不具有代表性。

中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，中性粒細(xì)胞由骨髓造血干細(xì)胞產(chǎn)生，主要參與人體的急性炎癥反應(yīng)，淋巴細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生，是人體免疫應(yīng)答功能的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，外周血的炎性細(xì)胞增多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。如中性粒細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β 和基質(zhì)金屬蛋白酶2，通過改變腫瘤微環(huán)境促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，而淋巴細(xì)胞在宿主抗腫瘤免疫作用中起保護(hù)作用，淋巴細(xì)胞的增加有利于癌癥患者的預(yù)后[28]。慢性炎癥是癌癥的標(biāo)志性特征之一，炎癥細(xì)胞可以釋放ROS，ROS 及其參與的氧化應(yīng)激過程可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及耐藥[5,29]。大量研究數(shù)據(jù)表明，NLR 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，高水平NLR 往往預(yù)示著不良的預(yù)后情況[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 患者中，男性和女性患者的NLR 在TBIL 高水平組均低于低水平組。由此猜想，TBIL 與NLR 之間可能存在協(xié)同作用，共同在肺癌免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，在女性患者中，CD3+T 細(xì)胞比例和CD4+T 細(xì)胞比例在TBIL 低水平組反而高于高水平組（P＜0.05）。有文獻(xiàn)報道，膽紅素對抗原提呈細(xì)胞和T 細(xì)胞能夠產(chǎn)生免疫抑制作用[31]。并且AhR 通路參與了T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的分化具有調(diào)節(jié)作用[32]。

早期肺癌的治療主要是以手術(shù)為主。腫瘤的病理分期（TNM 分期）是重要的預(yù)后因素。本研究顯示，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，TBIL 水平較低，而不同腫瘤大小表達(dá)無顯著性差異。因此，筆者猜想：在腫瘤進(jìn)展期，TBIL 作為內(nèi)源性抗氧化劑可能被消耗。膽紅素除了抗炎、抗氧化作用，對血管損害也有一定預(yù)防作用。如膽紅素水平聯(lián)合血清C 反應(yīng)蛋白可作為診斷肝癌合并大血管侵襲的早期標(biāo)志物，根據(jù)這兩項指標(biāo)的檢測值可以預(yù)估發(fā)生大血管侵襲事件的概率[33]。TBIL 水平可能與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系。另外，本研究隨訪了224 例早期肺癌術(shù)后患者的TBIL 水平及DFS，發(fā)現(xiàn)當(dāng)女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 時具有良好的預(yù)后，但在76 例男性患者中沒有發(fā)現(xiàn)相同的趨勢。目前，TBIL 單個指標(biāo)或聯(lián)合其他指標(biāo)已經(jīng)用于一些疾病進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測，臨床中也證明了通過補充抗氧化劑可以改善癌癥治療的不良反用[34]。本研究數(shù)據(jù)也再一次提示，當(dāng)TBIL 處于較低水平（男性＜13.85 μmol/L，女性＜9.85 μmol/L）時，聯(lián)合抗氧化劑治療可用于改善治療效果。

以上多項結(jié)果提示適當(dāng)升高的TBIL 可有效降低肺癌的進(jìn)展風(fēng)險，但目前還尚無切實可行的研究方案將膽紅素的抗氧化功能用于相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。針對早期沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者如何預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，膽紅素水平偏低患者給予抗氧化劑是否能夠延緩腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，尚需進(jìn)一步研究。本研究為小規(guī)模的臨床資料回顧性分析，具有一定局限性。目前，大多數(shù)臨床研究也是通過診斷后收集的血液樣本進(jìn)行循環(huán)代謝組學(xué)特征研究，這些數(shù)據(jù)可能受到化療、手術(shù)、生活方式等因素的影響而出現(xiàn)偏差，然而這些混雜因素沒有得到適當(dāng)?shù)目刂芠35]。因此，應(yīng)對這些因素進(jìn)行合理劃分，展開大型流行病學(xué)研究，進(jìn)一步明確血清TBIL 對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。