三陰型乳腺癌間質(zhì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞CD4、CD8、Foxp3和PD-L1表達(dá)的臨床病理意義

鐘戀君，王進(jìn)京，鄭 洪

乳腺癌是全球女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且腫瘤內(nèi)部存在高度異質(zhì)性，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1-2]。三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中極具侵襲性的一種亞型，占所有浸潤(rùn)性乳腺癌的10%～20%，具有侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，預(yù)后較差[3]。TNBC的主要生物學(xué)特征為缺乏ER、PR和HER-2的表達(dá)，有研究表明，TNBC中高密度間質(zhì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(stromal tumor-infiltrating lymphocytes, sTILs)是獨(dú)立預(yù)后因素，并能夠延長(zhǎng)TNBC患者的總生存期(overall survival, OS)[4]。在sTILs的不同亞群中，腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(TILs-T)在乳腺中發(fā)揮主要的抗腫瘤活性，包括CD4+(輔助)和CD8+(細(xì)胞毒性)sTILs[5-6]。另外，有研究認(rèn)為高水平的Foxp3+Tregs與不良預(yù)后有關(guān)[7-9]，然而并未達(dá)成共識(shí)。此外有研究表明，相比其他乳腺癌亞型，TNBC腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中存在程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)高表達(dá)[10-11]，這為發(fā)現(xiàn)乳腺癌治療新靶點(diǎn)提供了依據(jù)。然而，目前針對(duì)CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs及PD-L1+sTILs在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步研究以充分了解其意義。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)評(píng)估92例TNBC腫瘤區(qū)域內(nèi)sTILs的浸潤(rùn)密度，并采用免疫組化EnVision法檢測(cè)TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤(rùn)密度及sTILs的PD-L1蛋白表達(dá)情況，探討TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤(rùn)密度和sTILs中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2015～2019年收治的具有完整臨床病理資料的女性TNBC標(biāo)本92例，所有患者均未行放療或化療，且由兩位副高以上職稱病理醫(yī)師閱片后明確診斷。92例TNBC患者中位年齡45歲(26～75歲)，腫瘤中位直徑2.0 cm(1.0～7.0 cm)。組織學(xué)類型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，其中低級(jí)別癌(組織學(xué)分級(jí)Ⅰ+Ⅱ級(jí))44例，高級(jí)別癌(組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí))48例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例；74例Ki-67增殖指數(shù)>20%。

1.2 方法對(duì)92例TNBC標(biāo)本行免疫組化EnVision法染色。兔抗人CD4(SP35)、CD8(SP16)抗體及免疫組化EnVision法試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司，兔抗人Foxp3(10211R)抗體購(gòu)自北京博奧森生物公司，兔抗人PD-L1(SP142)抗體購(gòu)自上海羅氏診斷產(chǎn)品公司(Ventana檢測(cè)平臺(tái))。以扁桃體組織作為陽(yáng)性對(duì)照。染色步驟：標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，乙醇分級(jí)水化，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液修復(fù)，PBS沖洗，滴加一抗后-4 ℃恒溫箱中過(guò)夜，滴加山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗處理，DAB顯色。蘇木精對(duì)比染色，鹽酸乙醇分化、反藍(lán)，乙醇分級(jí)脫水，封固。

sTILs結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國(guó)際TILs工作組建議，sTILs評(píng)分定義為單核炎性細(xì)胞占據(jù)腫瘤基質(zhì)面積的百分比。(1)首先在低倍鏡下評(píng)估整張HE切片，觀察sTILs分布是否均勻；(2)若sTILs分布較均勻，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)；(3)若sTILs分布不均勻，排除分布最高和最低區(qū)域，隨機(jī)選取8個(gè)視野在高倍鏡下計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

PD-L1結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：首先觀察腫瘤細(xì)胞中免疫細(xì)胞(immunocyte, IC)的PD-L1染色情況，在腫瘤內(nèi)和(或)腫瘤周?chē)g質(zhì)中任何強(qiáng)度PD-L1染色的IC所占腫瘤區(qū)域面積的百分比≥1%定義為陽(yáng)性。

CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)首先在低倍鏡下評(píng)估整張切片，觀察腫瘤基質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞分布是否均勻；(2)若分布較均勻，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均數(shù)；(3)若分布不均勻，排除分布最高和最低區(qū)域，隨機(jī)選取3個(gè)視野在高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)(Chi-Square test)或Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)分類變量進(jìn)行相關(guān)性分析，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)TNBC預(yù)后相關(guān)因子進(jìn)行單因素和多因素分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sTILs中PD-L1表達(dá)及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關(guān)系本組92例TNBC中，將sTILs浸潤(rùn)密度以10%和50%為臨界值分為低密度組(≤10%)、中密度組(>10%，≤50%)和高密度組(>50%)(圖1)，并進(jìn)行HE切片評(píng)估，其中sTILs中任何強(qiáng)度PD-L1染色的IC所占腫瘤區(qū)域面積的百分比≥1%確定為陽(yáng)性(圖2A)，而CD4+(圖2B)、CD8+(圖2C)、Foxp3+(圖2D)sTILs均以各自中位值為臨界值進(jìn)行分組將它們分為低密度組和高密度組。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得出：CD4+sTILs浸潤(rùn)密度(6～242)個(gè)/HPF，中位值為38個(gè)/HPF；CD8+sTILs浸潤(rùn)密度(8～298)個(gè)/HPF，中位值42個(gè)/HPF；Foxp3+sTILs浸潤(rùn)密度(4～34)個(gè)/HPF，中位值8個(gè)/HPF。

圖1 TNBC中腫瘤細(xì)胞呈片狀或條索狀排列并浸潤(rùn)周?chē)g質(zhì)，其腫瘤細(xì)胞團(tuán)周?chē)g質(zhì)見(jiàn)數(shù)量不等的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)：A.低密度sTILs(≤10%)；B.高密度sTILs(>50%) 圖2 TNBC中sTILs呈散在或彌漫分布在腫瘤細(xì)胞團(tuán)的周?chē)g質(zhì)中：A.PD-L1+sTILs的表達(dá)，EnVision兩步法；B.CD4+sTILs的表達(dá)，EnVision兩步法；C.CD8+sTILs的表達(dá)，EnVision兩步法；D.Foxp3+sTILs的表達(dá)，EnVision兩步法

2.1.1sTILs中PD-L1表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系 92例TNBC sTILs中PD-L1陽(yáng)性20例，陰性72例。將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：sTILs中PD-L1表達(dá)與TNBC組織學(xué)分級(jí)、sTILs浸潤(rùn)密度顯著相關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 PD-L1與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

2.1.2sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關(guān)系 sTILs與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(rs=0.334，P=0.001)，與組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。CD4+、CD8+sTILs均與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.261，P=0.012；rs=-0.287，P=0.006)，與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(rs=0.208，P=0.047；rs=0.286，P=0.006)，與sTILs呈正相關(guān)(rs=0.311，P=0.003；rs=0.368，P<0.05)，而與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。Foxp3+sTILs與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)(rs=0.353，P=0.001)，與年齡呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.227，P=0.030)，與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)及sTILs無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

2.2 sTILs中PD-L1表達(dá)及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs與TNBC患者預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)92例TNBC預(yù)后相關(guān)因子進(jìn)行單因素和多因素分析。所有患者的治療方式相同，均為手術(shù)輔以相同藥物放、化療，92例TNBC患者均從明確診斷后進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間1～67個(gè)月，其中存活80例，死亡12例，平均隨訪時(shí)間31.54個(gè)月，其中42例(45.7%)隨訪時(shí)間不滿5年，包括出現(xiàn)終點(diǎn)事件(死亡)而終止的病例。PD-L1陽(yáng)性組20例，其中存活15例，死亡5例，平均生存時(shí)間22.60個(gè)月；PD-L1陰性組72例，其中存活65例，死亡7例，平均生存時(shí)間33.84個(gè)月。Kaplan-Meier分析表明：sTILs中PD-L1表達(dá)與TNBC患者預(yù)后顯著相關(guān)，與PD-L1陰性患者相比，PD-L1陽(yáng)性患者的OS更短(P=0.039，圖3A)；而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也與較短的OS相關(guān)(P=0.012，圖3B)。Cox回歸分析顯示：sTILs中PD-L1表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是OS的獨(dú)立因素(P<0.05，表3)。sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs在患者預(yù)后中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)，即與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。

圖3 TNBC sTILs中PD-L1表達(dá)(A)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(B)與患者OS的關(guān)系

表3 TNBC患者OS的單變量和多變量分析

3 討論

TNBC具有高侵襲性和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，一般預(yù)后較差，而傳統(tǒng)的手術(shù)治療輔以放、化療雖然能夠一定程度上提高患者術(shù)后的生活質(zhì)量，但患者病死率仍無(wú)明顯下降。因此，尋找新的可靠的治療靶點(diǎn)有助于改善患者的預(yù)后及生存率。sTILs作為T(mén)NBC的獨(dú)立預(yù)后因素，可以通過(guò)其內(nèi)部免疫亞群，包括CD4+和CD8+sTILs在乳腺癌中發(fā)揮主要的抗腫瘤活性，與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)TNBC中PD-L1高表達(dá)及Foxp3+Tregs高浸潤(rùn)可能與患者的不良預(yù)后有關(guān)。然而，對(duì)于上述研究在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析TNBC中sTILs的PD-L1蛋白表達(dá)及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸潤(rùn)密度，探討sTILs及其免疫亞群與TNBC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，從而進(jìn)一步揭示腫瘤免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制，為乳腺癌的免疫治療提供新的靶點(diǎn)和臨床依據(jù)。

乳腺癌TME中，sTILs在宿主對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在一項(xiàng)關(guān)于淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)高密度的sTILs與高水平的Ki-67相關(guān)[12]，另一項(xiàng)乳腺癌的研究亦獲得了同樣的結(jié)論[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNBC中高密度的sTILs與高水平的Ki-67呈正相關(guān)，這與上述兩項(xiàng)研究結(jié)果相符合，作者推測(cè)sTILs浸潤(rùn)密度的增高與乳腺癌腫瘤細(xì)胞的分化和增殖密切相關(guān)，這說(shuō)明sTILs具有重要的抗腫瘤免疫作用。最近一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究[14]發(fā)現(xiàn)：CD8+sTILs與組織學(xué)分級(jí)及Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+sTILs均與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)，而與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)。CD4+sTILs是一類輔助性T細(xì)胞，它可以激活腫瘤特異性CD8+sTILs增殖和記憶，而CD8+sTILs是機(jī)體發(fā)揮細(xì)胞免疫抗腫瘤反應(yīng)的主要參與者。因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)論可推測(cè)，處于高增殖活性的乳腺癌通過(guò)與CD8+sTILs相互作用，并使后者產(chǎn)生如γ干擾素等細(xì)胞因子，直接或間接促進(jìn)和增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用，以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。而另外一項(xiàng)對(duì)88例TNBC活檢標(biāo)本的研究[15]發(fā)現(xiàn)CD8+sTILs與臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，其原因可能是標(biāo)本的來(lái)源形式(活檢標(biāo)本或手術(shù)標(biāo)本)及儲(chǔ)存時(shí)間差異等造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Foxp3+sTILs是一種重要的免疫抑制細(xì)胞，它可以通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞的抗原提呈，抑制T細(xì)胞殺傷功能，幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。Goto等[16]在一項(xiàng)針對(duì)TNBC的研究中發(fā)現(xiàn)：高水平的Foxp3+sTILs與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，即腫瘤分化越差Foxp3+sTILs浸潤(rùn)越高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這提示Foxp3+sTILs可能通過(guò)釋放TGF-β和IL-10等因子直接或間接抑制腫瘤特異性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，這可能是乳腺癌免疫治療新的潛在靶點(diǎn)。然而，Glajcar等[17]的研究認(rèn)為高水平的Foxp3+sTILs與Ki-67增殖指數(shù)、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這可能與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的類型選擇、收集標(biāo)本數(shù)量及免疫組化抗體類型不同相關(guān)，有待進(jìn)一步探索。PD-1/PD-L1是重要的免疫檢查點(diǎn)，它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和sTILs的功能。盡管關(guān)于PD-L1在乳腺癌的研究取得了一定成果，但目前關(guān)于sTILs中PD-L1表達(dá)及其在乳腺癌中的預(yù)后意義仍未得到充分研究。先前的研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、組織學(xué)分級(jí)有關(guān)[18]。亦有研究表明，PD-L1在sTILs中的表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)[19-20]。本實(shí)驗(yàn)使用抗體為PD-L1(SP142)，檢測(cè)結(jié)果顯示sTILs中PD-L1表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，同時(shí)PD-L1陽(yáng)性患者具有更短的OS，這表明TNBC腫瘤細(xì)胞的分化越差，sTILs中PD-L1表達(dá)越高，患者的預(yù)后越差。

以往大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，高水平的sTILs與TNBC患者預(yù)后良好相關(guān)，即高密度sTILs的TNBC患者具有較長(zhǎng)的OS，然而本實(shí)驗(yàn)卻未能證明該觀點(diǎn)，這可能與本組選取的TNBC樣本量有限有關(guān)，而標(biāo)本的類型及儲(chǔ)存時(shí)間、抗體的差異等也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，有待后續(xù)擴(kuò)充樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行論證。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sTILs中PD-L1表達(dá)與TNBC的不良預(yù)后相關(guān)，sTILs中PD-L1陽(yáng)性患者較PD-L1陰性患者具有較短的OS。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，PD-L1高表達(dá)可能是TILs介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的結(jié)果，腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)PD-L1與免疫細(xì)胞的PD-1結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的腫瘤殺傷作用，同時(shí)也可能通過(guò)分泌腫瘤細(xì)胞因子直接或間接促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。有研究認(rèn)為PD-L1表達(dá)與良好的預(yù)后之間存在正相關(guān)，還有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)與預(yù)后之間呈負(fù)相關(guān)或無(wú)相關(guān)性[21-22]，這可能是由于不同抗體的敏感性和特異性不同，或腫瘤樣本的類型和儲(chǔ)存時(shí)間以及腫瘤自身異質(zhì)性等因素造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。雖然PD-L1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的意義仍有爭(zhēng)議，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與TNBC的不良預(yù)后相關(guān)，這更加說(shuō)明了免疫檢查點(diǎn)作用機(jī)制在腫瘤進(jìn)展中的重要作用。本組接下來(lái)仍需要納入更多有關(guān)TNBC的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并盡可能的排除干擾因素，以補(bǔ)充TNBC中PD-L1的生存數(shù)據(jù)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TNBC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是OS的獨(dú)立預(yù)后因素，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者較陰性患者具有更短的OS。有研究認(rèn)為，TNBC中CD8+sTILs可能與患者良好的預(yù)后相關(guān)，這進(jìn)一步說(shuō)明了CD8+sTILs在TNBC中發(fā)揮著重要的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)CD4+sTILs作為輔助性T細(xì)胞可以激活腫瘤特異性CD8+sTILs的記憶和增殖，它們共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，本實(shí)驗(yàn)未能論證以上觀點(diǎn)，有待進(jìn)一步討論。最后，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析得出Foxp3+sTILs與TNBC患者的預(yù)后無(wú)相關(guān)性，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[5,23]不符，這可能與本組標(biāo)本及抗體選擇的差異有關(guān)，需后續(xù)進(jìn)一步研究和分析。

綜上所述，sTILs中PD-L1表達(dá)及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs浸潤(rùn)程度可能與TNBC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。sTILs中PD-L1高表達(dá)提示TNBC患者預(yù)后不良，這表明PD-L1可作為T(mén)NBC的治療靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物，而由于樣本量及抗體選擇的差異，sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs對(duì)于患者的預(yù)后作用仍有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。若能闡明sTILs及其免疫亞群在腫瘤免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制，必將為乳腺癌的免疫治療提供重大的理論及臨床依據(jù)。