提高番木瓜組培苗生根率的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

成鏡 李季 戴雪梅 徐正偉 周權(quán)男 黃天帶

摘要??? 以TY-4番木瓜組培芽為試驗材料，在以半強度Murashige和Skoog培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，蛭石為支撐物的基礎(chǔ)上，研究不同蔗糖濃度（0、5、20、40g/L）、吲哚-3-丁酸濃度（2、4、6、8 mg/L）、間苯三酚濃度（0、10.0、14.9、19.9 mg/L）對番木瓜生長狀態(tài)和生根率及根系質(zhì)量的影響。結(jié)果表明：將番木瓜組培芽在含蔗糖濃度為0，吲哚-3-丁酸（IBA）濃度為2 mg/L、間苯三酚濃度為0，并補充1/2強度的MS大量元素、MS微量元素、MS有機質(zhì)，肌醇0.1 g/L、硫胺素0.4 mg/L和核黃素0.38 mg/L，支撐物為蛭石的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，體外芽最高生根率為95.2%，與最低的生根處理相比，高出38.1%，且莖基部形成愈傷組織較少。通過正交試驗結(jié)果分析可知，番木瓜最佳的生根組合為：蔗糖濃度為0、吲哚-3-丁酸（IBA）濃度為2mg/L、間苯三酚濃度為10.0 mg/L。本研究可為番木瓜體外繁殖生根技術(shù)提供理論參考。

關(guān)鍵詞??? 番木瓜;蔗糖;吲哚-3-丁酸;間苯三酚;生根;根系質(zhì)量;器官發(fā)生;蛭石

中圖分類號??? S667.9??? 文獻標(biāo)識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.010

Optimization of Rooting Medium for Tissue Culture of Papaya

CHENG Jing??? LI Ji??? DAI Xuemei??? XU Zhengwei??? ZHOU Quannan??? HUANG Tiandai

（Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops /CATASRRI Engineering Center for Rapid Propagation of Tropical Woody Plants.，Haikou，Hainan 571101，China）

Abstract??? Tissue cultured shoots of papaya variety “TY-4”were cultured on rooting mediums with the half-strength Murashige and Skoog medium as basic medium and vermiculite as the support，supplemented with sucrose at different concentrations （0，5，20，40 g·L），indole-3-butyric acid （IBA）at 2，4，6，8 mg·L，phloroglucinol at 0，10.0，14.9，19.9 mg·L to observe the effects of the three factors，sucrose，IBA and phloroglucinol，on the growth，rooting rate and root quality. An orthogonal experiment was arranged to optimize the concentrations of the sucrose，IBA and phloroglucinol in the rooting medium. The results showed that when papaya tissue cultured shoots were cultured on the rooting medium including 1/2 strength MS with vermiculite as support，supplemented with macro-elements，trace elements，organic matter，0.1 g·L inositol，0.4 mg·L thiamine and 0.38 mg·L riboflavin at the presence of 0 sucrose，2 mg·L IBA，and 0 phloroglucinol，the rooting rate of the shoots in vitro was upto 95.2%，which was 38.1% higher than that of the treatment with the lowest rooting rate，under which less calli were formed at the base of the shoots. The orthogonal experiment showed that the optimal combination of the three factors in the papaya rooting medium is sucrose at the concentration of 0，IBA at 2 mg·L，and phloroglucinol at 10.0 mg·L.

Keywords??? papaya;sucrose;indole-3-butyric acid;phloroglucinol;rooting;root quality;organogenesis;vermiculite

番木瓜（Carica papaya L）是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的多年生果樹，是國際上第四大暢銷的熱帶、亞熱帶特色水果，原產(chǎn)于熱帶美洲，與香蕉、菠蘿并稱“熱帶三大草本果樹”。目前，在我國的廣東、海南、廣西、云南、福建、四川等熱區(qū)已形成一定的種植規(guī)模[1-3]。

番木瓜是從種子繁殖而來的，但實際上它是一種異花授粉的物種，通過種子繁殖無法保留親代的某些特征（番木瓜植株按性別分為3種：雌株、雄株、兩性株，性別由初期的X-Y染色體控制）。研究顯示，在一個小的特定區(qū)域的Y染色體可以控制雄株（Y）或雌雄同株（Y）類型;雌株是XX類型，所有Y染色體和Y染色體都是不育的;因此，雄株和雌雄同株的類型都是雜合體（分別是XY和形式XY）。種子的繁殖還帶來果實質(zhì)量、大小以及生產(chǎn)力的變化。而且，各種形式的木瓜果實對于生產(chǎn)者來說是嚴重的問題，限制了木瓜商業(yè)化。優(yōu)良植物的繁殖和新品種的開發(fā)需要有效的營養(yǎng)繁殖技術(shù)[4]。盡管可以通過嫁接和生根插條繁殖，但由于從親本產(chǎn)生的植株數(shù)量有限，因此還不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)需求[5]。因此，使用可繁殖大量高質(zhì)量植株的微繁技術(shù)是種植該作物的迫切需求。組織培養(yǎng)技術(shù)可作為育種程序中重要的措施，以克服常規(guī)育種和克隆繁殖中遇到的問題。盡管用番木瓜品種成功進行組織培養(yǎng)已有報道，但再生枝芽的主要問題是低生根率以及基部愈傷組織的形成，阻止了根的形成，適應(yīng)馴化的生根植物的比例也很低[6]。體細胞胚的發(fā)芽還經(jīng)常受到高水合度和根部位愈傷組織的影響[6-7]，番木瓜的體外培養(yǎng)中再生植物的馴化是世界范圍內(nèi)存在的最大問題。在田間種植之前，已經(jīng)損失了超過70%的植株[8]。

近年來，體細胞胚發(fā)生技術(shù)已用于許多植物物種的快速繁殖。大規(guī)模繁殖的體外方案的成功取決于能否再生大量植物（低成本），并使其具有高成活率的體外條件[9-10]。然而，體細胞胚發(fā)生方案的商業(yè)化使從體外移植到離體移植后死亡或受損的植株比例很高，這仍是需要解決的問題[11]。一般而言，在半固體培養(yǎng)基中，通過體細胞胚發(fā)生獲得的植物，一旦產(chǎn)生葉子和根系，即可適應(yīng)離體條件。半固體培養(yǎng)通常會在解剖學(xué)、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)方面產(chǎn)生異常植物[10]。實際上，這些植物的特征是由葉片角質(zhì)層發(fā)育不良導(dǎo)致的光合作用弱、與維管束系統(tǒng)無關(guān)的無功能的根系問題以及其他可能影響植物在適應(yīng)階段生存的疾病[10-11]所引起的。

間苯三酚是生長調(diào)節(jié)劑，是木質(zhì)素生物合成途徑中Phloridzin及其前體降解的產(chǎn)物，是一種酚類化合物，因其具有促進植物生長的特性而聞名，盡管其作用通常被其他類似化合物所掩蓋[12]。前人已證明，間苯三酚對木質(zhì)化有積極作用[13-14]，減少了高水合過程[15]，并抑制從體細胞胚和胚芽獲得的芽的愈傷組織形成。周鵬等[16]將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的芽接種于MS+KT （0.1～0.2）mg/L+NAA （0.05～0.1）mg/L+IBA （0.2～0.3）mg/L+蔗糖（20～30）g/L+瓊脂6.5 g/L（pH 5.6），26～28 ℃，每日光照培養(yǎng)12h，光照強度為1 500 lx，連續(xù)培養(yǎng)15～20 d進行催根培養(yǎng)，生根率達85%以上，該項研究的目的是使用蛭石作為支撐物，確定蔗糖、IBA、間苯三酚濃度對番木瓜芽生根的影響。本研究探討不同因素對番木瓜生長的影響大小，并篩選出適合番木瓜根系生長的最佳組合，為下一步開展番木瓜規(guī)?？旆碧峁├碚摶A(chǔ)。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

TY-4番木瓜材料經(jīng)鑒定為雌雄同株，采集于三亞市林業(yè)科學(xué)研究所塑料大棚內(nèi)。

1.2??? 方法

1.2.1??? 正交試驗設(shè)計??? 取生長狀況良好且?guī)в?～3片綠葉的芽為外植體（長1.5～2 cm），接種于含有1/2 MS大量、MS微量、MS有機、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L硫胺素和0.38 mg/L核黃素，不同蔗糖、吲哚-3-丁酸、間苯三酚濃度的培養(yǎng)基中，支撐物為蛭石;蔗糖、吲哚-3-丁酸、間苯三酚采用三因素四水平設(shè)計（表1）;培養(yǎng)容器為帶透氣膜的玻璃試管，pH 5.8，在溫度25℃的條件下培養(yǎng)30d。對照處理（PS51）：蔗糖含量0，IBA濃度2 mg/L，間苯三酚二水化合物濃度12.8 mg/L;采用L（4）正交設(shè)計表，分別設(shè)置蔗糖濃度（因素A）、IBA濃度（因素B）、間苯三酚濃度（因素C）的三因素四水平正交試驗（表2）。每個處理組合21個外植體，重復(fù)3次，接種1個月后統(tǒng)計生根情況：用水浸泡基質(zhì)，待基質(zhì)松軟后，輕輕洗掉基質(zhì)，取出根系，統(tǒng)計生根數(shù)和觀察生根情況。

1.2.2??? 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析??? 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003和DPS 7.05軟件進行處理和分析，用Tukey 法進行差異顯著性分析。

2??? 結(jié)果與分析

2.1??? 正交試驗設(shè)計結(jié)果分析

從表3可看出，不同培養(yǎng)基配方對番木瓜生根率的影響不同;其中PS35處理生根率最高，達95.2%;其次分別是PS36、PS37、PS38、PS39處理，生根率均達90.5%。雖然PS46處理的生根率也達到90%，但長出的根系短，莖基部形成大量愈傷組織，如圖1所示。PS47、PS48、PS49、PS50處理的生根率最低，分別為61.9%、57.1%、57.1%、57.1%?？梢钥闯?，蔗糖濃度為0的處理，番木瓜生根率略高于蔗糖濃度為5、20 g/L的處理，且顯著高于蔗糖濃度為40 g/L的處理。

從正交試驗結(jié)果（表3、4）的直觀分析可以看出，因素A（蔗糖濃度）對番木瓜生根率的影響較大，而因素B（IBA濃度）和因素C（間苯三酚濃度）對其影響較小。從表4的極值可確定，三因素對番木瓜生根率影響程度的主次順序為：A>B>C;根據(jù)表4中各因素水平平均值的大小，可得番木瓜生根最優(yōu)組合為ABC，即蔗糖濃度0、IBA濃度2mg/L、間苯三酚濃度10.0 mg/L。

從表5可看出，3個因素對試驗結(jié)果的影響各有差異，其中因素A對本試驗結(jié)果的影響顯著，因素B和因素C對試驗結(jié)果的影響沒有達到顯著水平，說明在番木瓜生根的過程中，不同蔗糖濃度對生根率的影響最大，而IBA濃度和間苯三酚濃度對生根率影響小。

2.2??? 不同處理植株生長狀況

從圖2可以看出，蔗糖濃度為0的PS37處理，葉片呈深綠色，隨著蔗糖濃度（5～40 g/L）的升高，番木瓜黃葉情況明顯，說明生根階段低蔗糖濃度有利于番木瓜植株的健康生長。

2.3??? 不同處理根系生長情況

從圖1 可以看出，PS35、PS36、PS37、PS38、PS39處理的番木瓜根系生長較好，根截面周圍一圈都有根產(chǎn)生，有側(cè)根形成，莖基部無愈傷組織形成且沒有形成泡沫狀根;而PS46處理，產(chǎn)生的根系短，莖基部形成較多愈傷組織，植株生長狀況差，葉片變黃脫落。

3??? 討論與結(jié)論

目前，在番木瓜組織培養(yǎng)過程中，生根率和生根狀況一直是影響番木瓜快繁成本和田間移栽成活率的關(guān)鍵因素。然而，番木瓜高生根率和優(yōu)質(zhì)根系的實現(xiàn)，常受到諸多因素的綜合影響。

因此，篩選出適合番木瓜根系生長的最佳組合條件就顯得尤為重要。本研究通過正交試驗設(shè)計獲得了番木瓜生根的最優(yōu)組合為ABC，即蔗糖濃度0、IBA濃度2 mg/L、間苯三酚濃度10.0 mg/L，與Laisyn Posada Perez 等[17]的研究結(jié)果一致。蔗糖是淀粉合成的前體物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)中蔗糖是最理想的碳源之一，其作用是作為碳源和維持滲透壓;培養(yǎng)基中的蔗糖濃度高時會產(chǎn)生較高的滲透壓，使得植物組織中的水分向培養(yǎng)基滲透，最終導(dǎo)致植物組織缺水，進而影響其生長發(fā)育過程[18]。本試驗中，隨著蔗糖濃度的升高，番木瓜的黃葉數(shù)增加，這可能是由于培養(yǎng)基中的蔗糖濃度高，導(dǎo)致葉片中的水分向培養(yǎng)基滲透，并最終成為影響番木瓜芽生根率的主要因素。本研究得出的番木瓜生根的最優(yōu)組合也可在其他作物的組培快繁體系中應(yīng)用與推廣，生根階段減少使用蔗糖或者不使用蔗糖，不但能減少組培生產(chǎn)成本，且能減少因蔗糖而存在的污染風(fēng)險。

參考文獻

[1]吳遵耀，郭林榕，熊月明.番木瓜生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技，2007（3）：88-90.

[2]陳春寶，黎小瑛，周鵬.番木瓜抗病育種及其組培苗生產(chǎn)概述[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（6）：47-52.

[3]蔡英卿，賴鐘雄.番木瓜生物技術(shù)研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（3）：429 -434.

[4] Farzana A R F，Palkadapala P G V，Meddegoda K M M，et al. Somatic embryogenesis in papaya （Carica papaya L. cv. Rathna）[J]. J Nat Sci Found Sri Lanka，2008，36：41-50.

[5] Nzilani N M，Karambu F R，Edward G M，et al. In vitro regeneration of selected Kenyan papaya （Carica papaya L.）lines through shoot tip culture[J]. Afr J Biotechnol，2013，12：6 826-6 832.

[6] Sekeli R，Abdullah J O，Namasivayam P，et al. Better rooting procedure to enhance survival rate of field grown Malaysian Eksotika papaya transformed with 1-Aminocyclopropane- 1-carboxylic acid oxidase gene[J]. ISRN Biotechnol，201413：1-10.

[7] Ascencio-Cabral A，Rodriguez B，Gutierrez H，et al. Plant regeneration of Carica papaya through somatic embryogenesis in response to light quality，gelling agent and phlo- ridzin[J]. Sci Hortic，2008，118：155-160.

[8] Malabadi R B，Kumar S V，Mulgund G S，et al.Induction of somatic embryogenesis in papaya （Carica papaya）[J]. Res Biotechnol，2011，2：40-55.

[9] Bany-Etienne D，Bertrand B，Schlonvoigta A，et al. The morphological variability within a population of coffee somatic em-bryos produced in a bioreactor affects the regeneration and the development of plants in the nursery[J]. Plant Cell Tissue Organ Cult，2002，68：153-162.

[10] Hazarika B N. Morpho-physiological disorders in in vitro culture of plant[J]. Sci Hortic-Amst，2006，108：105-120.

[11] Pospisilova J，Synkova H，Haisel D，et al. Acclimatization of plantles to ex vitro conditions：effects of air，humidity，irradiance，CO concentration and abscisic acid[J]. Acta Horde，2007，748：29-39.

[12] TeixeiradaSilva J A，Dobranszki J，Ross S.Phloroglucinol in plant tissue culture[J]. In Vitro Cell Dev-Plant，2013，49：1-16.

[13] Ross S，Castillo A. Mass propagation of Vaccinium corym- bosumin bioreactors[J]. Agrociencia XIII，2009（2）：1-18.

[14] Ross S，Castillo A.Micropropagation of Achyrocline flaccid （Weinm）DC. in liquid culture media[J]，Agrociencia XIV，2010（1）：1-7.

[15] Ross S，Grasso R. In vitro propagationof ‘Guayabodelpals’（Acca sellowiana （Berg.）Burret）[J]. Fruit Veg Cereal Sci Biotechnol，2010，4（spe- cial issue 1）：83-87.

[16]周鵬，黎小瑛，沈文濤，等.番木瓜優(yōu)質(zhì)組培苗生產(chǎn)體系的建立[J].熱帶作物學(xué)報，2005，26（1）：43-46

[17] Laisyn Posada Pérez，Yenny Padrón Montesinos，Justo González Olmedo，et al. Effect of phloroglucinol on rooting and in vitro acclimatization of papaya （Carica papaya L. var. Maradol Roja）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant，2016，52：196-203.

[18]莽克強，植物組培快繁（第1卷背景）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：133-135.