南藥牛大力組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

黃小華 聶天軍 班兆丹 熊發(fā)前 韋榮昌

摘要??? 遵照《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GAP）的宗旨，規(guī)范南藥牛大力組培苗生產(chǎn)的物種選擇、組織培養(yǎng)、瓶內(nèi)煉苗、瓶外煉苗、出圃、裝框、運輸和檔案記錄，旨在提高南藥牛大力組培苗的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞??? 牛大力;南藥;組培苗;生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

中圖分類號??? S533??? 文獻標(biāo)識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.009

Technical Regulations on Propagation of Callerya speciosa via Tissue Culture

HUANG Xiaohua1??? NIE Tianjun2??? BAN Zhaodan3??? XIONG Faqian1??? WEI Rongchang1

（1. Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China;2. Guangxi Litop Rice Corporation Co.，Ltd.，Narming，Guangxi 530022，China;3. Guangxi Wanchuan Seed Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530007，China）

Abstract??? According to the Good Agricultural Practice of Chinese Crude Drugs （GAP），technical regulations on propagation of Callerya speciosa via tissue culture were prepared. The regulations provide for selection of cultivars，tissue culture，hardening of tissue cultured plants in and out of tubes，transplanting，packaging，transportation and recording to improve the quality of tissue cultured plants of C. speciosa.

Keywords??? Callerya speciosa;southern medicine;tissue culture seedling;technical regulations on production

牛大力[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]，俗稱美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）、牛大力藤、牛牯大力、山蓮藕，是豆科（Leguminosae）雞血藤屬多年生藤本植物。牛大力是我國傳統(tǒng)名貴南藥[1]，始載于《生草藥性備要》[2]。牛大力以干燥的塊根入藥，性澀（平）、味甜（甘）、氣微，歸肺、肝經(jīng)，主要活性成分為牛大力多糖、芒柄花素和高麗槐素，具有舒筋活絡(luò)，補虛潤肺和健脾的功能[3-6]。牛大力藥食同源，塊根富含淀粉，是桂龍藥膏、強力健身膠囊及壯腰健腎丸等多種中成藥的主要原料，廣大嶺南民眾也有用牛大力炮制藥酒、藥膳或煲湯的習(xí)慣[7]。

牛大力主要分布于嶺南地區(qū)，通常生于海拔不高于1 500m的疏林、灌叢和曠野中[8]。生產(chǎn)上牛大力利用種子繁殖種苗，發(fā)芽勢和發(fā)芽率均不高[9]。而通過組織培養(yǎng)技術(shù)能夠得到優(yōu)質(zhì)的健康種苗。為了規(guī)范牛大力組培苗的生產(chǎn)，以提升其質(zhì)量和產(chǎn)量，特此制定本規(guī)程。

1??? 范圍

本規(guī)程規(guī)定了南藥牛大力[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]組培苗規(guī)范化生產(chǎn)的物種選擇、組織培養(yǎng)、瓶內(nèi)煉苗、瓶外煉苗、出圃、裝框、運輸和檔案記錄。

本規(guī)程適用于廣西境內(nèi)南藥牛大力組培苗的規(guī)范化生產(chǎn)。

2??? 引用標(biāo)準(zhǔn)

GB 3095—2012環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);

GB 5084—2021農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);

GB 15618—2018土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）;

NY/T 394—2013綠色食品肥料使用準(zhǔn)則;

GB/T 8321.9—2009農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則（九）;

NY/T 393—2020綠色食品??? 農(nóng)藥使用準(zhǔn)則;

GB 15569—2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程。

3??? 物種選擇

豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]。

4??? 組織培養(yǎng)[10-12]

4.1??? 外植體的選擇與滅菌

應(yīng)選用品種純正，生長勢旺，熟期一致的豐產(chǎn)單株作母株。母株開花前，套袋，以隔絕外來花粉，避免異交。秋末冬初，當(dāng)莢果表面由綠色變?yōu)樽睾稚蚝稚珪r，表明種子已經(jīng)成熟。采摘飽滿未開裂的莢果，剪去果柄，浸泡于0.05%的洗衣粉（m/m）或洗潔精（V/V）水溶液中，用軟毛刷輕輕刷洗莢果表面，清除莢果表面的污垢和柔毛，8～12 min后取出莢果，用線狀自來水沖洗15～40 min;用消毒濾紙或無菌吸水紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)至超凈工作臺上，用75%的乙醇浸泡30～50 s，無菌水沖洗1～2次;置于滅菌玻璃瓶中（所裝材料應(yīng)少于瓶子容積的1/3），穿戴乳膠防護手套，用1 g/L的HgCl+2～3滴吐溫-20浸沒材料，消毒15～20 min，取出并用無菌水沖洗20～25 min（宜分4～5次沖洗，每次4～5min）;吸去表面水分，用解剖刀縱向剖開莢果，然后用鑲子將種子小心夾出（不得夾傷種子），得到無菌外植體。

4.2??? 種子萌發(fā)獲得無菌試管苗

將種子接種到萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+1.5～3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L KT+0.2～0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA+500 mg/L PVP+5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH 5.8～6.0，配制分裝后，于121℃滅菌20 min）上，每瓶培養(yǎng)基接種1粒種子，種臍朝下，插入培養(yǎng)基的深度為種子長度的2/3，在培養(yǎng)溫度為23～28℃、光照強度為20～40 μmol/（m·s）、時間為10～16 h/d的條件下初代培養(yǎng)20～30 d，誘導(dǎo)種子萌發(fā)，獲得無菌試管苗。

4.3??? 試管苗叢生芽增殖與分化

將種子萌發(fā)獲得的叢生芽切取單個不定芽，轉(zhuǎn)接于增殖與分化培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2～0.5 mg/L NAA+5 g/L 瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.8～6.0，配制分裝后，于121℃滅菌20 min）中，在培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強度為20～40 μmol/（m·s）、時間為10～16 h/d的條件下繼代培養(yǎng)20～25 d，誘導(dǎo)叢生芽增殖與分化。

4.4??? 試管苗生根培養(yǎng)

當(dāng)試管苗高達2～4 cm時，切取2～3 cm左右的單個不定芽，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基（1/2MS+1.0～2.5 mg/L IBA+1.5 mg/L NAA+5 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖），pH 5.8～6.0，配制分裝后，于121 ℃滅菌20 min）中，在培養(yǎng)溫度為23～28℃、光照強度為20-40 μmol/（m·s），光照時間為10～16 h/d的條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)試管苗生根，通常情況下，6～8d即可產(chǎn)生根原基，20～30 d后得到具2～3條不定根的完整植株（瓶苗），當(dāng)瓶苗高達瓶口時，即可煉苗。

5??? 瓶內(nèi)煉苗

得到帶根的完整植株后，將瓶苗置于遮光度50%～70%，溫度（25±2）℃的室內(nèi)環(huán)境中，將光照強度從20～40μmol/（m·s）逐步提高到75～ 100μmol/（m·s）。14～21d后，先松開瓶蓋1～2 d，然后半開瓶蓋l～2d，最后完全打開瓶蓋，沿瓶壁緩慢添加適量自來水，以恰好浸沒培養(yǎng)基為宜，煉苗3～5d，當(dāng)植株表面形成角質(zhì)后，用滅菌長鑷子輕輕夾出瓶苗，放入清水盆中，小心洗去植株根部殘留的培養(yǎng)基，再用500～800倍液的50% 多菌靈可濕性粉劑浸泡20～30min，待移栽至瓶外煉苗。

6??? 瓶外煉苗

包括砂床煉苗和育苗袋煉苗2個階段，均要求煉苗環(huán)境中的空氣應(yīng)符合GB 3095—2012環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]的規(guī)定;灌溉水應(yīng)滿足GB 5084—2021農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[14]的要求，土壤應(yīng)按照GB 15618—2018 土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）[15]執(zhí)行。

6.1??? 砂床煉苗

把細(xì)河砂按20～30目：30～45目：45～60目=2：5：3（V：V）拌勻，作成寬1.2～1.4 m，高15～20 cm的砂床，砂床上再覆一層1～2 cm厚的河砂（30～45目）。用800～1 000倍液的甲基托布津或300～500倍液的95%敵克松噴霧殺菌，1d后，淋透水。幼苗栽于砂床上，株行距（8～10）cm×（10～12）cm。移栽后10 d內(nèi)，保持砂床內(nèi)相對濕度為85%～95%，控制白天溫度在23～25℃，夜間溫度在15～18℃，同時注意避免直射光照射。移栽后15～20 d，即可移至育苗袋煉苗。

6.2??? 育苗袋煉苗

先將紅壤土的表土鏟去，選取心土，破碎過篩（10～20目），用0.2%～0.4%的高鎰酸鉀溶液或多菌靈可濕性粉劑800～1 000倍液均勻噴灑消毒，加入6%～10%的腐熟有機肥，3%～5%的生石灰，攪拌均勻，作成圓錐形土堆，用聚丙烯塑料薄膜覆蓋密封，在高溫天氣條件下悶曬7～10 d，或采用高溫干熱滅菌法進行基質(zhì)滅菌。當(dāng)滅菌后的紅壤土溫度降至室溫，裝入（8～10）cm（口徑）×（12～14）cm（高度）的無紡布育苗袋中，土高10～12cm為宜。

將經(jīng)過砂床煉苗的牛大力小苗栽植于育苗袋中，每袋栽1株。然后把育苗袋擺在平整的地塊上，寬以1.2～1.4 m為宜，長依地而定，四周開好排水溝。淋足定根水，搭建高的簡易拱棚，并覆蓋一層白色的聚乙烯薄膜，四周用土塊壓實，以達到保溫和防風(fēng)避雨的目的[9]。

6.3 ???田間管理

6.3.1??? 查苗補苗??? 移栽后5～7d，揭膜查苗，如有死苗，應(yīng)連同育苗袋一起清理，并用新的育苗袋補種相同苗齡的小苗。

6.3.2??? 水分管理??? 保持土壤相對含水量為田間持水量的40%～60%，空氣相對濕度為60%～80%。雨后及時清溝排水，降低土壤和空氣中的濕度;當(dāng)持續(xù)高溫干旱時，應(yīng)早晚噴霧（水）降溫，并揭開拱棚兩頭薄膜，通風(fēng)換氣，必要時還應(yīng)加蓋遮陽網(wǎng)，降低光照強度。

6.3.3??? 除草追肥??? 不定時揭膜檢查，根據(jù)雜草的長勢，及時除去育苗袋中、地塊及溝邊的雜草，同時注意培土固根，以防倒伏。結(jié)合除草培土，進行追肥。移栽后7～10 d，淋施腐熟的有機肥水或噴施1/2 MS營養(yǎng)液，連施2次。此后，每14 d追肥1次，將腐熟的有機肥撒施在小苗的四周。肥料的選擇和使用應(yīng)符合NY/T 394—2013綠色食品肥料使用準(zhǔn)則[16]的相關(guān)規(guī)定。

6.4??? 病蟲害防治

牛大力組培苗的病蟲害較少，主要有莖腐病和甥蟲。應(yīng)優(yōu)先采取物理防治和生物防治，在符合GB/T 8321.9—2009農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則（九）[17]和NY/T 393—2020綠色食品農(nóng)藥使用準(zhǔn)則[18]的前提下，科學(xué)選擇低毒低殘留高效的化學(xué)農(nóng)藥，將病蟲危害控制在經(jīng)濟允許范圍內(nèi)。

6.4.1??? 莖腐病??? 莖腐病為害莖基部，先是葉片萎蔫，然后莖基部和根部逐漸腐爛，幼苗死亡。因此，煉苗時，當(dāng)幼苗成活后，應(yīng)緩慢降低育苗基質(zhì)和空氣中的濕度。同時噴施70%百菌清可濕性粉劑，或50%多菌靈可濕性粉劑，或50%敵克松可濕性粉劑600～1 000倍液進行防控。一旦發(fā)現(xiàn)中心病株，應(yīng)馬上清理，并在病坑的四周淋（噴）施上述藥劑，以防病害通過土壤進行傳播[19]。

6.4.2??? 蚜蟲??? 蚜蟲為害葉片，剛孵化出來的幼蟲從幼葉開始啃食，然后啃食新葉。大多數(shù)被啃食后的葉片只剩下葉脈，甚至整個葉片脫落，嚴(yán)重影響植株的健康生長?？捎谜T蟲黃板誘殺，或以2%啶蟲脒可濕性粉劑1 500～2 000倍液，或10%毗蟲琳可濕性粉劑2 500～3 000倍液噴灑葉面[20]。

7??? 出圃

當(dāng)組培苗長出3～5片真葉，株高15～20 cm時，即可出圃。出圃前，應(yīng)先割掉突破透育苗袋的根系，正常田間管理5～7 d，然后逐漸降低育苗基質(zhì)和空氣中的濕度。

8??? 裝筐

將種苗連同育苗袋一起，裝入潔凈的帶蓋塑料筐（筐高20～25cm）內(nèi)，單層擺放，育苗袋與育苗袋之間排列緊湊，以確保運輸途中不散坨。

9??? 運輸

調(diào)運前，應(yīng)按照GB 15569—2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程[21]的要求，提出調(diào)運檢疫申請，并取得植物檢疫機構(gòu)簽發(fā)的植物檢疫證書。同時，應(yīng)對運輸工具進行全面消毒，并注意防曬和防雨。

10??? 檔案記錄

對組織培養(yǎng)、瓶內(nèi)煉苗、瓶外煉苗、出圃、裝框、運輸和檔案等環(huán)節(jié)采取的措施進行詳細(xì)記錄，建立生產(chǎn)檔案。

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