液體培養(yǎng)法與熒光探針PCR 檢測(cè)陰道分泌物中解脲脲原體的應(yīng)用價(jià)值

王敏，萬(wàn)曉龍

1.江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇東臺(tái) 224200；2.江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院兒科，江蘇東臺(tái) 224200

支原體（mycoplasma）是最小的原核細(xì)胞型微生物，無(wú)細(xì)胞壁，形態(tài)多樣，可自細(xì)菌濾器濾過(guò)，生長(zhǎng)繁殖于無(wú)生命培養(yǎng)基中[1-2]。目前，能夠從人體分離出的支原體共有16 種，其中7 種對(duì)人體有致病性，以解脲脲原體（ureaplasma urealyticum, UU）、人型支原體（mycoplasma hominis，Mh）最為常見(jiàn)[3-4]?？赏ㄟ^(guò)性接觸傳播，引起人類非淋球菌性和非衣原體性泌尿生殖道感染， 引起婦科疾病與不良妊娠結(jié)局[5-6]。目前，對(duì)UU 檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)室多采用液體培養(yǎng)基法，可直接檢測(cè)細(xì)菌。另外，還可使用核酸檢測(cè)的方法檢測(cè)UU[7-8]。基于此，本文選取江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科2019 年1 月—2021 年12 月收治的138 例疑似泌尿生殖道感染者，分別采用液體培養(yǎng)法、熒光探針PCR 法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比，并探討聯(lián)合方式對(duì)疾病的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院檢驗(yàn)科的138 例疑似泌尿生殖道感染的女性患者，年齡20～58 歲，病程2～12 個(gè)月。臨床癥狀：白帶增多、混濁、子宮頸水腫、充血或表面糜爛；累及尿道可見(jiàn)尿道口潮紅、充血；擠壓尿道可見(jiàn)分泌物外溢[9]。本研究所選病例經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡22～50 歲；狀態(tài)良好，主動(dòng)配合研究；資料完整，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

排除標(biāo)準(zhǔn)：重要臟器功能受損者；惡性腫瘤患者；合并其他感染性疾病者；近期有過(guò)相關(guān)治療者；妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法

所用儀器為ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析儀。解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑盒為圣湘生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

陰道分泌物檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)為Amsel 臨床標(biāo)準(zhǔn)[10]，需滿足下列4 項(xiàng)中的其中3 項(xiàng)：線索細(xì)胞陽(yáng)性（即數(shù)量占陰道上皮細(xì)胞總量的20%以上；胺試驗(yàn)陽(yáng)性；陰道分泌物pH 值＞4.5；陰道分泌物稀薄、灰白色，且質(zhì)地均勻；必備條件為線索細(xì)胞陽(yáng)性。

以錯(cuò)誤分析理論為指導(dǎo)，分析學(xué)生的在筆譯過(guò)程產(chǎn)生的語(yǔ)言錯(cuò)誤，教師不僅可以把握學(xué)生的英語(yǔ)發(fā)展的不同階段，同時(shí)也能認(rèn)識(shí)自身翻譯教學(xué)過(guò)程中的問(wèn)題。更為重要的是，錯(cuò)誤分析有助于檢驗(yàn)學(xué)生譯文的語(yǔ)言知識(shí)點(diǎn)、百科知識(shí)以及文化知識(shí)的不足，這樣教師才能及時(shí)調(diào)整教學(xué)模式，學(xué)生也能調(diào)整自己的學(xué)習(xí)策略。總之，正如科德指出的那樣“錯(cuò)誤研究方法，作為是了解語(yǔ)言學(xué)習(xí)過(guò)程中的必要方法，它有助于我們了解語(yǔ)言學(xué)習(xí)者的語(yǔ)言變化過(guò)程，還能反映出我們的學(xué)習(xí)者處于怎樣一個(gè)語(yǔ)言學(xué)習(xí)階段中”。[17]

1.3.2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)取出所需數(shù)量的冷凍干燥培養(yǎng)基，滴加少量稀釋液到培養(yǎng)瓶中，充分搖勻至培養(yǎng)基完全溶解。補(bǔ)充滴加稀釋液，使液面至標(biāo)簽標(biāo)線處。在試劑條空白孔中加入50 μl 液體培養(yǎng)基。將采集的樣本插入培養(yǎng)基中，擠壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中分泌物洗脫后棄拭子。充分混勻接種后的液體培養(yǎng)基，分別取50 μl 接種到試劑條余下各孔中。在試劑條的每1 孔中滴加1 滴石蠟油，蓋上蓋子。將剩余培養(yǎng)基連同試劑條放置35～37℃培養(yǎng)箱中孵育。

1.3.1 樣本采集所有患者采樣前2 h 內(nèi)不能排尿。采樣時(shí)，先清潔宮頸口過(guò)多的分泌物，將女性用無(wú)菌藻酸鈣拭子深入宮頸內(nèi)2～3 cm，用力轉(zhuǎn)1～2 圈后取出拭子。取出的分泌物應(yīng)略帶黏膜，采集后的拭子置入無(wú)菌收集管中密封，立即送檢。每位患者需取兩份陰道分泌物樣本。

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)與百分比（%）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

金標(biāo)準(zhǔn)顯示：138 例疑似患者中，確診患者110例；單一診斷方式特異性對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法靈敏度和準(zhǔn)確率高于熒光探針PCR 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與單一診斷方式比較，聯(lián)合診斷靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

綜上所述,新生兒護(hù)理具有特殊性,而有效的安全護(hù)理有助于最大程度消除新生兒臨床不安全因素,降低不安全事件的發(fā)生率,需要臨床重視。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

核桃是我國(guó)能在國(guó)際市場(chǎng)上站穩(wěn)腳跟的少數(shù)農(nóng)副產(chǎn)品之一，特別是核桃油價(jià)格可達(dá)66元/kg，加之，核桃生產(chǎn)成本低，投入與產(chǎn)出比是1∶5，核桃果加工成仁能增值0.25倍，加工成油能增值2.5倍，加工成飼料能增值8倍，且收獲期長(zhǎng)達(dá)60多年，產(chǎn)量穩(wěn)定，所以，核桃產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。

1.3.3 熒光探針PCR 檢測(cè)解脲脲原體核酸按照試劑說(shuō)明書要求，取出試劑盒各組分平衡至室溫，混勻后備用；根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量，按比例混合反應(yīng)液、酶混合液和內(nèi)標(biāo)配制PCR 混合液，瞬時(shí)離心后備用；每孔PCR 反應(yīng)管中加入核酸釋放劑5 μl 后，分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各5 μl；加PCR 混合液40 μl 至每孔后，蓋上管蓋，2 000 rpm 離心30 s；設(shè)置PCR 循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為：50℃UNG 酶處理2 min，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s、57℃退火延伸30 s（共45個(gè)循環(huán)），25℃冷卻10 s；測(cè)定Ct 值≤38.5，擴(kuò)增曲線呈典型S 型，同時(shí)內(nèi)標(biāo)Ct值≤40，為解脲支原體陽(yáng)性。

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法報(bào)告獲取時(shí)間為（47.78±2.16）h，明顯長(zhǎng)于熒光探針PCR 法的(25.12±1.44）h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=102.540，P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和熒光探針PCR 兩種檢測(cè)方法結(jié)果的比較

以Amsel 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法對(duì)UU 的檢出率為76.09%，高于熒光探針PCR 法的57.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法結(jié)果的比較

2.2 單一檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值比較

當(dāng)有解脲脲原體生長(zhǎng)時(shí)，24 h 觀察培養(yǎng)基由黃色變成紅色；當(dāng)有人型支原體生長(zhǎng)時(shí)，48 h 觀察培養(yǎng)基由黃色變成紅色?？瞻卓钻幮员硎驹囼?yàn)結(jié)果有效，可對(duì)其余各孔結(jié)果予以判定；空白孔陽(yáng)性表示試驗(yàn)過(guò)程中有污染，結(jié)果無(wú)效。

表2 單檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值比較

2.3 兩種檢測(cè)方法報(bào)告獲取時(shí)間比較

2.3.1 HCC 結(jié)果(表2、表3)顯示：388例HCC患者中，腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術(shù)后總體生存的獨(dú)立因素(P<0.05)；腫瘤數(shù)目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素(P<0.05)。

3 討論

本研究中熒光探針PCR 法解脲脲原體的檢出率為57.25%，低于液體培養(yǎng)法的76.09%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造成檢出率差異的原因可能為：①解脲支原體的兩個(gè)亞型微小脲原體（ureaplasma parvum, Up）與解脲脲原體都能分解尿素，使培養(yǎng)酚紅指示劑變紅，因此液體培養(yǎng)法無(wú)法區(qū)分[11]。②液體培養(yǎng)基中所含抗菌藥物不能完全抑制陰道分泌物中復(fù)雜多樣的微生物，也可造成假陽(yáng)性。③液體培養(yǎng)基法通過(guò)檢驗(yàn)人員的肉眼判讀結(jié)果，易出現(xiàn)主觀因素導(dǎo)致的隨機(jī)誤差[12-13]。而熒光探針PCR 法可針對(duì)UU 設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行單項(xiàng)檢測(cè)，假陽(yáng)性概率較低。除具有較強(qiáng)的特異性之外，熒光探針PCR 法還有較高的敏感性，最低檢出量?jī)H為400 copies/mL；檢測(cè)時(shí)間短，只需數(shù)小時(shí)便可完成；污染率低，僅需加樣時(shí)開蓋，全封閉狀態(tài)操作等方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室廣為應(yīng)用的一種新型病原微生物檢測(cè)技術(shù)[14]。

北方的冬天，有著純潔的美。夜間下雪時(shí)，我總愛(ài)站在街燈下，頭向上仰望著，眼睛努力睜大，看著被燈光折射過(guò)的飛雪，雪花調(diào)皮地打在臉上，有些滲入衣服里，一陣冰涼的感覺(jué)傳來(lái)，可我卻感覺(jué)不到冷。路上的行人很少，雪地上只有一些稀稀疏疏的腳印，也許是因?yàn)槎疾蝗绦钠茐倪@純潔無(wú)暇的美麗風(fēng)景吧。眼前的路是一片潔白，似乎已經(jīng)鋪上了一條白地毯。雪花不時(shí)地飄到我的臉上，抬頭望去，每一片飛舞的雪花，在燈光的映射下，仿佛就是一簇簇從天上灑下來(lái)的銀屑。

傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)法雖然方法學(xué)特異性不如熒光探針PCR 法，但其所檢測(cè)的只能是陰道分泌物標(biāo)本中的活體支原體，可為疾病準(zhǔn)確診斷以及療效跟蹤觀察提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。與此同時(shí)，該檢測(cè)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，還可檢測(cè)人型支原體，也是臨床實(shí)驗(yàn)室不可或缺的解脲脲原體檢測(cè)手段[15]。學(xué)者馮米妹等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法的檢出率為90.28%,明顯高于PCR 法的77.78%（P＜0.05），與文中結(jié)果一致。

文中對(duì)比聯(lián)合方式對(duì)疾病的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法聯(lián)合熒光探針PCR 法對(duì)疾病的診斷靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率高于單一診斷方式（P＜0.05），由此可見(jiàn)，解脲脲原體感染時(shí)，只選擇一種檢測(cè)方法有一定的局限性，而聯(lián)合傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)法和熒光探針PCR 法兩種方法同時(shí)檢測(cè)，快速準(zhǔn)確地鑒定解脲脲原體，也可在此基礎(chǔ)上準(zhǔn)確診斷疾病，還能夠?yàn)榀熜ПO(jiān)測(cè)提供依據(jù)，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)更有利于指導(dǎo)臨床UU 感染的診斷和治療[17-18]。兩組報(bào)告獲取時(shí)間對(duì)比結(jié)果顯示，熒光探針PCR 時(shí)間更短（P＜0.05），24 h 左右即可獲得檢測(cè)結(jié)果，可為疾病早期診斷提供更為可靠的依據(jù)，便于疾病治療工作盡早開展，緩解患者壓力。

綜上所述，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和熒光探針PCR均可用于解脲脲原體感染診斷，二者聯(lián)合，可進(jìn)一 步提高診斷價(jià)值。